一种水产养殖动物或水产食品中创伤弧菌的PCR检测方法与流程

本发明属于病原微生物检测领域，具体的涉及一种针对水产养殖动物或水产食品中常见的病原菌：创伤弧菌(Vibrio vulnificus)的PCR检测方法。

背景技术：

创伤弧菌(Vibrio vulnificus)或称为海洋弧菌，是一种革兰氏阴性嗜盐菌，自然生存于河口和海洋环境中，与霍乱弧菌、肠炎弧菌同属致病性弧菌。能够引起胃肠炎、伤口感染和原发性败血症。通常人类感染是因为食用生或半生的受污染海产品，或是因为伤口接触了带菌的海水或海洋动物。所以检测水产养殖动物或水产食品中是否存在创伤弧菌就显得尤为重要。

目前国内外对创伤弧菌检测方法主要有生理生化方法、免疫学方法和基因检测法。方法复杂，灵敏性差。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种水产养殖动物或水产食品中创伤弧菌的PCR检测方法。本发明的方法可快速鉴定致病源，为我国水产养殖动物的安全和水产食品进出口安全提供技术支持。

本发明采用的技术方案是：一种水产养殖动物或水产食品中创伤弧菌(Vibrio vulnificus)的PCR检测方法，方法如下：

1)提取水产养殖动物组织或水产食品组织的总DNA；

2)以所提取的DNA为模板，采用创伤弧菌特异性引物，进行PCR扩增；所述的创伤弧菌特异性引物是针对创伤弧菌的recA基因的特异性引物P1、toxR基因的特异性引物P2、rpoD基因的特异性引物P3或topA基因的特异性引物P4。

特异性引物P1的上下游引物的序列是：P1-F：TGGGCCGTATCGTTGAAATTTT；P1-R：GAGTCGCCCATCTCACCTTC。

特异性引物P2的上下游引物的序列是：P2-F：CCCGCTCCTGTCAGATTCAA；P2-R：GCAGTGCGGCTAACAAGAAT。

特异性引物P3的上下游引物的序列是：P3-F：CACTCAGCTTCGTAACAGCT；P3-R：CCATTCTTCGCTTGACTCGTTG。

特异性引物P4的上下游引物的序列是：P4-F：CGCTGTGAAGCTTTTGGTGG；P4-R：GATGTACCCACGAACCGCTT。

PCR反应条件：第一阶段：94℃5min；

第二阶段：94℃30s，60℃或64℃或66℃30s，72℃30s；30循环；

第三阶段：72℃5min；

第四阶段：4℃保存。

3)根据PCR扩增产物的琼脂糖凝胶呈像结果判断水产养殖动物或水产食品是否被创伤弧菌感染。

针对特异性引物P1，如果PCR扩增产物的琼脂糖凝胶呈像结果有313bp条带产生，则水产养殖动物或水产食品被创伤弧菌感染，否则没有被感染。

针对特异性引物P2，如果PCR扩增产物的琼脂糖凝胶呈像结果有215bp条带产生，则水产养殖动物或水产食品被创伤弧菌感染，否则没有被感染。

针对特异性引物P3，如果PCR扩增产物的琼脂糖凝胶呈像结果有283bp条带产生，则水产养殖动物或水产食品被创伤弧菌感染，否则没有被感染。

针对特异性引物P4，如果PCR扩增产物的琼脂糖凝胶呈像结果有421bp条带产生，则水产养殖动物或水产食品被创伤弧菌感染，否则没有被感染。

上述的一种水产养殖动物或水产食品中创伤弧菌的PCR检测方法，所述的水产养殖动物为大菱鲆、海参、泥鳅鱼、螃蟹、爬虾、青虾或三文鱼。

上述的一种水产养殖动物或水产食品中创伤弧菌的PCR检测方法，所述的水产食品为动物性水产品干制品、腌醉制生食动物性水产品、鱼糜制品。

本发明的有益效果是：

1.本发明，设计的创伤弧菌特异性引物，能有效从各常见致病菌株中区分出创伤弧菌，表现出很强的特异性。

2.本发明，设计的创伤弧菌特异性引物，灵敏性高，可有效检出水产养殖动物和水产食品中的创伤弧菌，其最低检测浓度可达到10^-3ng/ul。

3.本发明的检测方法可有效检出水产养殖动物体内和水产食品中的高危致病菌创伤弧菌，经验证此检测方法特异性强，灵敏度高。该检测方法的确立为今后水产养殖动物体内残留病原菌创伤弧菌的检测和分析提供了必要的理论依据和完善的方法体系，不仅为我国水产品进出口食品安全提供技术支持，同时为我国养殖水产品食品安全健康发展做出了贡献

4.本发明，所提供的水产食品中创伤弧菌的PCR检测方法，使得水产食品中创伤弧菌检测更为简便。在水产食品中，一旦存在病原菌创伤弧菌，即能够做到快速鉴定，为我国水产食品进出口提供有效的检查方法。

附图说明

图1是实施例1创伤弧菌特异性引物P1的PCR反应条件优化；

其中，M:Marker DL2000，1-5:退火温度分别为56℃，57℃，58℃，59℃，60℃。

图2是实施例1创伤弧菌特异性引物P1的特异性验证；

其中，1.Vibrio vulnificus；2.Vibrio vulnificus；3.Vibrio hollisae；4.Vibrio harveyi；5.Vibrio fluvialis；6.Vibrio campbellii；7.Vibrio alginolyticus；8.Vibrio metschnikovii；9.Vibrio gigantis；10.Vibrio cyclitrophicus；11.Aeromonas hydrophila；12.Aeromonas salmonicida；13.Pseudomonas helmanticensis；14.Pseudomonas aeruginosa；15.Pseudomonas kilonensis，M:Marker DL2000。

图3是实施例1创伤弧菌特异性引物P1的PCR反应灵敏性验证。

其中，M:Marker DL2000，1-7:模板浓度分别为10¹ng/ul，10⁰ng/ul，10^-1ng/ul，10^-2ng/ul，10^-3ng/ul，10^-4ng/ul，10^-5ng/ul。

图4是实施例1创伤弧菌特异性引物P1对不同水产养殖动物PCR扩增产物的凝胶成像结果；

其中，M:Marker DL2000，1-7分别为注射0.1ml创伤弧菌菌液的大菱鲆、海参、泥鳅鱼、螃蟹、爬虾、青虾、三文鱼组织；8-14分别为注射0.90％生理盐水的大菱鲆、海参、泥鳅鱼、螃蟹、爬虾、青虾、三文鱼组织。

图5是实施例2创伤弧菌特异性引物P2的PCR反应条件优化；

其中，M:Marker D，1-5:退火温度分别为60℃，61℃，62℃，63℃，64℃。

图6是实施例2创伤弧菌特异性引物P2的特异性验证；

其中，1.Vibrio furnissi；2.Vibrio vulnificus；3.Vibrio harveyi；4.Vibrio parahemolyticus；5.Vibrio fluvialis；6.Vibrio campbellii；7.Vibrio alginolyticus；8.Vibrio metschnikovii；9.Vibrio mimicus；10.Vibrio gigantis；11.Vibrio cyclitrophicus；12.Aeromonas hydrophila；13.Aeromonas salmonicida；14.Aeromonas sobria；15.Aeromonas veronii；16.Pseudomonas helmanticensis；17.Pseudomonas aeruginosa；18.Pseudomonas kilonensis，M:Marker D。

图7是实施例2创伤弧菌特异性引物P2的PCR反应灵敏性验证。

其中，M:Marker D，1-7:模板浓度分别为10¹ng/ul，10⁰ng/ul，10^-1ng/ul，10^-2ng/ul，10^-3ng/ul，10^-4ng/ul，10^-5ng/ul。

图8是实施例2创伤弧菌特异性引物P2对不同水产食品PCR扩增产物的凝胶成像结果；

其中，M:Marker D，分别为注射0.1ml创伤弧菌菌液的动物性水产品干制品(1-3)、腌醉制生食动物性水产品(4-5)、鱼糜制品(6-7)；8-14分别为注射0.90％生理盐水的动物性水产品干制品(8-10)、腌醉制生食动物性水产品(11-12)、鱼糜制品(13-14)。

图9是实施例3创伤弧菌特异性引物P3的PCR反应条件优化；

其中，M:Marker D，1-5:退火温度分别为62℃，63℃，64℃，65℃，66℃。

图10是实施例3创伤弧菌特异性引物P3的特异性验证；

其中，1.Vibrio furnissi；2.Vibrio vulnificus；3.Vibrio hollisae；4.Vibrio parahemolyticus；5.Vibrio harveyi；6.Vibrio fluvialis；7.Vibrio campbellii；8.Vibrio alginolyticus；9.Vibrio metschnikovii；10.Vibrio mimicus 11.Vibrio cyclitrophicus；12.Aeromonas sobria；13.Aeromonas hydrophila；14.Aeromonas salmonicida；15.Aeromonas veronii；16.Pseudomonas helmanticensis；17.Pseudomonas aeruginosa；18.Pseudomonas kilonensis；M:Marker D。

图11是实施例3创伤弧菌特异性引物P3的PCR反应灵敏性验证。

其中，M:Marker D，1-7:模板浓度分别为10¹ng/ul，10⁰ng/ul，10^-1ng/ul，10^-2ng/ul，10^-3ng/ul，10^-4ng/ul，10^-5ng/ul。

图12是实施例3创伤弧菌特异性引物P3对海参人工感染创伤弧菌PCR扩增产物的凝胶成像结果；

其中，M:Marker D；1-7分别为注射0.1ml创伤弧菌菌液的海参组织；8-14分别为注射0.90％生理盐水的海参组织。

图13是实施例4创伤弧菌特异性引物P4的PCR反应条件优化；

其中，M:Marker D，1-5:退火温度分别为56℃，57℃，58℃，59℃，60℃。

图14是实施例4创伤弧菌特异性引物P4的特异性验证；

其中，1.Vibrio furnissi；2.Vibrio vulnificus；3.Vibrio hollisae；4.Vibrio parahemolyticus；5.Vibrio harveyi；6.Vibrio fluvialis；7.Vibrio alginolyticus；8.Vibrio campbellii；9.Vibrio metschnikovii；10.Vibrio mimicus 11.Vibrio gigantis；12.Vibrio cyclitrophicus；13.Aeromonas hydrophila；14.Aeromonas salmonicida；15.Aeromonas veronii；16.Pseudomonas helmanticensis；17.Pseudomonas aeruginosa 18.Pseudomonas kilonensis；19.Bordetella trematum；M:Marker D。

图15是实施例4创伤弧菌特异性引物P4的PCR反应灵敏性验证。

其中，M:Marker D，1-7:模板浓度分别为10¹ng/ul，10⁰ng/ul，10^-1ng/ul，10^-2ng/ul，10^-3ng/ul，10^-4ng/ul，10^-5ng/ul。

图16是实施例4创伤弧菌特异性引物P4对大菱鲆人工感染创伤弧菌PCR扩增产物的凝胶成像结果；

其中，M:Marker D，1-7分别为注射0.1ml创伤弧菌菌液的大菱鲆肌肉组织，8-14分别为注射0.90％生理盐水的大菱鲆肌肉组织。

具体实施方式

下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。

实施例1

(一)创伤弧菌特异性引物P1的设计

本实施例针对菌种创伤弧菌(Vibrio vulnificus)的recA基因，利用软件LSPrimer(http://ccsipb.lnu.edu.cn/primer/)和MEGA6软件，设计出对创伤弧菌(Vibrio vulnificus)具有特异性强且灵敏性高的一对特异性引物P1，该创伤弧菌特异性引物的具体信息如表1所示。

表1

(二)创伤弧菌特异性引物P1最佳PCR反应条件的探索

1、创伤弧菌DNA的提取

使用Ezup柱氏基因组DNA抽提试剂盒(细菌)，提取创伤弧菌(Vibrio vulnificus)的DNA，具体步骤如下：

1.1)取1ml过夜培养的含有菌种创伤弧菌(Vibrio vulnificus)的菌液，加入1.5ml离心管中，室温8000rmp离心1min，弃上清，收集菌体，加入180ul Buffer Digestion，再加入20ul Proteinase K溶液，震荡混匀。56℃水浴1h至细胞完全裂解。水浴过程中，每10分钟颠倒混匀一次，促进细胞裂解。

1.2)加入200ul Buffer BD，充分颠倒混匀。加入Buffer BD后，如有沉淀产生，可70℃水浴10分钟。

1.3)加入200ul的无水乙醇，充分颠倒混匀。加入无水乙醇后可能产生半透明纤维状悬浮物，不影响DNA的提取和应用。

1.4)将吸附柱放入收集管中，用移液器将步骤1.3)获得的溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中，静置2min，在12000rmp室温离心1min，倒掉收集管中的废液。

1.5)将吸附柱重新放回收集管中，加入500ul PW Solution，10000rmp离心30s，倒掉收集管滤液。

1.6)将吸附柱重新放回收集管，加入500ul Wash Solution，10000rmp离心30s，倒掉滤液。

1.7)将吸附柱重新放回收集管中，于12000rmp室温离心2min，弃去残留的Wash Solution。将吸附柱打开盖子于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的Wash Solution，Wash Solution的残留会影响基因组DNA的产量和后续的实验。

1.8)取出吸附柱，放入一个新的1.5ml离心管中，加入50-200ul CE Buffer静置3min，12000rmp室温离心2min，收集DNA溶液，即为创伤弧菌的DNA。提取的DNA可立即进行下一步实验或-20℃保存。

2、创伤弧菌特异性引物P1最佳退火温度的探索

分别以提取的创伤弧菌的DNA为模板做PCR扩增，并将目的引物的退火温度分别设置为56℃、57℃、58℃、59℃、60℃，PCR扩增产物在1％琼脂糖1×TAE缓冲系统中电泳，每孔加样5ul，用凝胶成像系统观察并摄影记录，根据PCR后的凝胶电泳结果确定创伤弧菌特异性引物P1的最佳退火温度。具体PCR反应条件和体系如表2所示，结果如图1。

表2目的引物最佳PCR反应探索条件

由图1可见，温度对该引物并无明显影响，但根据PCR基本原则，温度越高越有利于引物的特异性结合，故确定最佳退火温度为60℃。

(三)创伤弧菌特异性引物P1的特异性探索

1、待试菌株DNA的提取

使用Ezup柱氏基因组DNA抽提试剂盒(细菌)，分别提取如表3所示的不同菌种的DNA，具体步骤如上述(二)中步骤1。

2、特异性探索

分别以表3中，提取的不同菌种的DNA为模板做PCR扩增，具体PCR反应条件和体系如表4所示，PCR后的凝胶电泳结果如图2所示。

表3待试菌株如下：

表4目的引物最佳PCR反应条件

由图2可见，本发明的创伤弧菌特异性引物在弧菌属内，以及气单胞菌属和假单胞菌属内均表现出很强的特异性，只能和目的菌株创伤弧菌产生特异性扩增，而非目的菌株未产生特异性扩增。故可见其表现出很强的特异性。

(四)创伤弧菌特异性引物P1的灵敏性的探索

1、创伤弧菌DNA的提取

使用Ezup柱氏基因组DNA抽提试剂盒(细菌)，提取创伤弧菌(Vibrio vulnificus)菌种的DNA，具体步骤如上述(二)中步骤1。

2、灵敏性的探索

将创伤弧菌的DNA浓度调至10¹ng/ul，并且依次稀释为10⁰ng/ul、10^-1ng/ul、10^-2ng/ul、10^-3ng/ul、10^-4ng/ul、10^-5ng/ul，分别取1ul DNA作为PCR反应模板，具体PCR反应条件和体系如表5所示，PCR后的凝胶电泳结果如图3所示。

表5目的引物最佳PCR反应探索条件

由图3可见，本发明的创伤弧菌特异性引物在创伤弧菌DNA浓度为10¹ng/ul、10⁰ng/ul、10^-1ng/ul、10^-2ng/ul、10^-3ng/ul、时均可产生特异性扩增，其最低检测浓度可达到10^-3ng/ul。

(五)水产养殖动物体内创伤弧菌的PCR检测

1、提取水产养殖动物组织的总DNA；

使用Ezup柱氏动物基因组DNA抽提试剂盒，提取水产养殖动物组织的DNA，具体步骤如下：

1.1)分别取约未注射创伤弧菌和注射0.1ml创伤弧菌菌悬液的25mg水产养殖动物组织，用液氮研磨成粉末，加到1.5ml离心管中，加入180ul Buffer ACL，再加入20ul Proteinase K溶液，震荡混匀。56℃水浴1h至细胞完全裂解。

1.2)加入200ul Buffer CL，充分颠倒混匀。加入Buffer CL后，如有沉淀产生，可70℃水浴10分钟。

1.3)加入200ul的无水乙醇，充分颠倒混匀。加入无水乙醇后可能产生半透明纤维状悬浮物，不影响DNA的提取和应用。

1.4)将吸附柱放入收集管中，用移液器将步骤1.3)获得的溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中，静置2min，在12000rmp室温离心1min，倒掉收集管中的废液。

1.5)将吸附柱重新放回收集管中，加入500ul CW1 Solution，10000rmp离心30s，倒掉收集管滤液。

1.6)将吸附柱重新放回收集管，加入500ul CW2 Solution，10000rmp离心30s，倒掉滤液。

1.7)将吸附柱重新放回收集管中，于12000rmp室温离心2min，弃去残留的CW2 Solution。将吸附柱打开盖子于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的CW2 Solution，CW2 Solution的残留会影响基因组DNA的产量和后续的实验。

1.8)取出吸附柱，放入一个新的1.5ml离心管中，加入50-200ul CE Buffer静置3min，12000rmp室温离心2min，收集DNA溶液，即为水产养殖动物组织的总DNA。提取的DNA可立即进行下一步实验或-20℃保存。

2、PCR方法扩增

以提取的DNA为模板，采用创伤弧菌特异性引物P1，利用PCR方法扩增，得到PCR产物；

P1-F:TGGGCCGTATCGTTGAAATTTT

P1-R:GAGTCGCCCATCTCACCTTC

PCR反应条件：第一阶段：94℃5min；

第二阶段：94℃30s，60℃30s，72℃30s；30循环；

第三阶段：72℃5min；

第四阶段：4℃保存。

3、PCR扩增产物在1％琼脂糖1×TAE缓冲系统中电泳，每孔加样5ul，用凝胶成像系统观察并摄影记录，如图4所示。

M:Marker DL2000，1-7分别为注射0.1ml创伤弧菌菌液的大菱鲆、海参、泥鳅鱼、螃蟹、爬虾、青虾、三文鱼组织；8-14分别为注射0.90％生理盐水的大菱鲆、海参、泥鳅鱼、螃蟹、爬虾、青虾、三文鱼组织。

4、判断标准：根据PCR扩增产物的琼脂糖凝胶呈像结果判断该引物实际检测效果；如果琼脂糖凝胶呈现结果有313bp条带产生，则实际检测效果良好。如果琼脂糖凝胶未呈现结果有313bp条带产生，则实际检测效果不理想。

由图4可见，注射0.1ml创伤弧菌菌液的大菱鲆、海参、泥鳅鱼、螃蟹、爬虾、青虾、三文鱼组织(1-7)均产生313bp大小条带，而注射0.90％生理盐水的大菱鲆、海参、泥鳅鱼、螃蟹、爬虾、青虾、三文鱼组织(8-14)未产生313bp大小条带，由此可见，本发明根据创伤弧菌recA基因所设计的特异性引物具有较好的检测能力，可应用到实际检测中。

实施例2

(一)创伤弧菌特异性引物P2的设计

本实施例针对菌种创伤弧菌(Vibrio vulnificus)的toxR基因，利用软件LSPrimer(http://ccsipb.lnu.edu.cn/primer/)和MEGA6软件，设计出对创伤弧菌(Vibrio vulnificus)具有特异性强且灵敏性高的一对特异性引物P2，该创伤弧菌特异性引物的具体信息如表6所示。

表6

(二)创伤弧菌特异性引物P2最佳PCR反应条件的探索

1、创伤弧菌DNA的提取：同实施例1

2、创伤弧菌特异性引物P2最佳退火温度的探索

分别以提取的创伤弧菌的DNA为模板做PCR扩增，并将目的引物的退火温度分别设置为60℃、61℃、62℃、63℃、64℃，PCR扩增产物在1％琼脂糖1×TAE缓冲系统中电泳，每孔加样5ul，用凝胶成像系统观察并摄影记录，根据PCR后的凝胶电泳结果确定创伤弧菌特异性引物P2的最佳退火温度。具体PCR反应条件和体系如表7所示，结果如图5。

表7目的引物最佳PCR反应探索条件

由图5可见，温度对该引物并无明显影响，但根据PCR基本原则，温度越高越有利于引物的特异性结合，故确定最佳退火温度为64℃。

(三)创伤弧菌特异性引物P2的特异性探索

1、待试菌株DNA的提取：使用Ezup柱氏基因组DNA抽提试剂盒(细菌)，分别提取如表8所示的不同菌种的DNA，具体步骤如实施例1的(二)中步骤1。

2、特异性探索

分别以表8中，提取的不同菌种的DNA为模板做PCR扩增，具体PCR反应条件和体系如表9所示，PCR后的凝胶电泳结果如图6所示。

表8待试菌株如下：

表9目的引物最佳PCR反应条件

由图6可见，本发明的创伤弧菌特异性引物在弧菌属内，以及气单胞菌属和假单胞菌属内均表现出很强的特异性，只能和目的菌株创伤弧菌产生特异性扩增，而非目的菌株未产生特异性扩增。故可见其表现出很强的特异性。

(四)创伤弧菌特异性引物P2的灵敏性的探索

1、创伤弧菌DNA的提取：同实施例1

2、灵敏性的探索

将创伤弧菌的DNA浓度调至10¹ng/ul，并且依次稀释为10⁰ng/ul、10^-1ng/ul、10^-2ng/ul、10^-3ng/ul、10^-4ng/ul、10^-5ng/ul，分别取1ul DNA作为PCR反应模板，具体PCR反应条件和体系如表10所示，PCR后的凝胶电泳结果如图7所示。

表10目的引物最佳PCR反应探索条件

由图7可见，本发明的创伤弧菌特异性引物在创伤弧菌DNA浓度为10¹ng/ul、10⁰ng/ul、10^-1ng/ul、10^-2ng/ul、10^-3ng/ul、时均可产生特异性扩增，其最低检测浓度可达到10^-3ng/ul。

(五)水产食品中创伤弧菌的PCR检测方法

1、提取水产食品组织的总DNA；

使用Ezup柱氏动物基因组DNA抽提试剂盒，提取水产食品的DNA，具体步骤如下：

1.1)分别取约未注射创伤弧菌和注射0.1ml创伤弧菌菌悬液的25mg水产食品组织，用液氮研磨成粉末，加到1.5ml离心管中，加入180ul Buffer ACL，再加入20ul Proteinase K溶液，震荡混匀。56℃水浴1h至细胞完全裂解。

1.2)加入200ul Buffer CL，充分颠倒混匀。加入Buffer CL后，如有沉淀产生，可70℃水浴10分钟。

1.3)加入200ul的无水乙醇，充分颠倒混匀。加入无水乙醇后可能产生半透明纤维状悬浮物，不影响DNA的提取和应用。

1.4)将吸附柱放入收集管中，用移液器将步骤1.3)获得的溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中，静置2min，在12000rmp室温离心1min，倒掉收集管中的废液。

1.5)将吸附柱重新放回收集管中，加入500ul CW1 Solution，10000rmp离心30s，倒掉收集管滤液。

1.6)将吸附柱重新放回收集管，加入500ul CW2 Solution，10000rmp离心30s，倒掉滤液。

1.7)将吸附柱重新放回收集管中，于12000rmp室温离心2min，弃去残留的CW2 Solution。将吸附柱打开盖子于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的CW2 Solution，CW2 Solution的残留会影响基因组DNA的产量和后续的实验。

1.8)取出吸附柱，放入一个新的1.5ml离心管中，加入50-200ul CE Buffer静置3min，12000rmp室温离心2min，收集DNA溶液，即为水产食品组织的总DNA。提取的DNA可立即进行下一步实验或-20℃保存。

2、PCR方法扩增

以提取的DNA为模板，采用创伤弧菌特异性引物P2，利用PCR方法扩增，得到PCR产物；

P2-F:CCCGCTCCTGTCAGATTCAA

P2-R:GCAGTGCGGCTAACAAGAAT

PCR反应条件：第一阶段：94℃5min；

第二阶段：94℃30s，64℃30s，72℃30s；30循环；

第三阶段：72℃5min；

第四阶段：4℃保存。

3、PCR扩增产物在1％琼脂糖1×TAE缓冲系统中电泳，每孔加样5ul，用凝胶成像系统观察并摄影记录，如图8所示。

M:Marker D，分别为注射0.1ml创伤弧菌菌液的动物性水产品干制品(1-3)、腌醉制生食动物性水产品(4-5)、鱼糜制品(6-7)；8-14分别为注射0.90％生理盐水的动物性水产品干制品(8-10)、腌醉制生食动物性水产品(11-12)、鱼糜制品(13-14)。

4、判断标准：根据PCR扩增产物的琼脂糖凝胶呈像结果判断该引物实际检测效果；如果琼脂糖凝胶呈现结果有215bp条带产生，则实际检测效果良好。如果琼脂糖凝胶未呈现结果有215bp条带产生，则实际检测效果不理想。

由图8可见，注射0.1ml创伤弧菌菌液的动物性水产品干制品、腌醉制生食动物性水产品、鱼糜制品(1-7)均产生215bp大小条带，而注射0.90％生理盐水的水产品干制品、腌醉制生食动物性水产品、鱼糜制品(8-14)未产生215bp大小条带，由此可见，本发明根据创伤弧菌toxR基因所设计的特异性引物具有较好的检测能力，可应用到实际检测中。

实施例3

(一)创伤弧菌特异性引物的设计

本实施例针对菌种创伤弧菌(Vibrio vulnificus)的rpoD基因，利用软件LSPrimer(http://ccsipb.lnu.edu.cn/primer/)和MEGA6软件，设计出对创伤弧菌(Vibrio vulnificus)具有特异性强且灵敏性高的一对特异性引物P3，该创伤弧菌特异性引物的具体信息如表11所示。

表11

(二)创伤弧菌特异性引物P3最佳PCR反应条件的探索

1、创伤弧菌DNA的提取：同实施例1。

2、创伤弧菌特异性引物P3最佳退火温度的探索

分别以提取的创伤弧菌的DNA为模板做PCR扩增，并将目的引物的退火温度分别设置为62℃、63℃、64℃、65℃、66℃，PCR扩增产物在1％琼脂糖1×TAE缓冲系统中电泳，每孔加样5ul，用凝胶成像系统观察并摄影记录，根据PCR后的凝胶电泳结果确定创伤弧菌特异性引物P3的最佳退火温度。具体PCR反应条件和体系如表12所示，结果如图9。

表12目的引物最佳PCR反应探索条件

由图9可见，温度对该引物并无明显影响，但根据PCR基本原则，温度越高越有利于引物的特异性结合，故确定最佳退火温度为66℃。

(三)创伤弧菌特异性引物P3的特异性探索

1、待试菌株DNA的提取：使用Ezup柱氏基因组DNA抽提试剂盒(细菌)，分别提取如表13所示的不同菌种的DNA，具体步骤如实施例1的(二)中步骤1。

2、特异性探索

分别以表13中，提取的不同菌种的DNA为模板做PCR扩增，具体PCR反应条件和体系如表14所示，PCR后的凝胶电泳结果如图10所示。

表13待试菌株如下：

表14目的引物最佳PCR反应条件

由图10可见，本发明的创伤弧菌特异性引物在弧菌属内，以及气单胞菌属和假单胞菌属内均表现出很强的特异性，只能和目的菌株创伤弧菌产生特异性扩增，而非目的菌株未产生特异性扩增。故可见其表现出很强的特异性。

(四)创伤弧菌特异性引物P3的灵敏性的探索

1、创伤弧菌DNA的提取：同实施例1

2、灵敏性的探索

将创伤弧菌的DNA浓度调至10¹ng/ul，并且依次稀释为10⁰ng/ul、10^-1ng/ul、10^-2ng/ul、10^-3ng/ul、10^-4ng/ul、10^-5ng/ul，分别取1ul DNA作为PCR反应模板，具体PCR反应条件和体系如表15所示，PCR后的凝胶电泳结果如图11所示。

表15目的引物最佳PCR反应探索条件

由图11可见，本发明的创伤弧菌特异性引物在创伤弧菌DNA浓度为10¹ng/ul、10⁰ng/ul、10^-1ng/ul、10^-2ng/ul、10^-3ng/ul时均可产生特异性扩增，其最低检测浓度可达到10^-3ng/ul。

(五)海参养殖过程中创伤弧菌的PCR检测

1、提取海参组织的总DNA；

使用Ezup柱氏动物基因组DNA抽提试剂盒，提取海参组织的DNA，具体步骤如下：

1.1)分别取约未注射创伤弧菌和注射0.1ml创伤弧菌菌悬液的25mg海参组织，用液氮研磨成粉末，加到1.5ml离心管中，加入180ul Buffer ACL，再加入20ul Proteinase K溶液，震荡混匀。56℃水浴1h至细胞完全裂解。

1.2)加入200ul Buffer CL，充分颠倒混匀。加入Buffer CL后，如有沉淀产生，可70℃水浴10分钟。

1.3)加入200ul的无水乙醇，充分颠倒混匀。加入无水乙醇后可能产生半透明纤维状悬浮物，不影响DNA的提取和应用。

1.4)将吸附柱放入收集管中，用移液器将步骤1.3)获得的溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中，静置2min，在12000rmp室温离心1min，倒掉收集管中的废液。

1.5)将吸附柱重新放回收集管中，加入500ul CW1 Solution，10000rmp离心30s，倒掉收集管滤液。

1.6)将吸附柱重新放回收集管，加入500ul CW2 Solution，10000rmp离心30s，倒掉滤液。

1.7)将吸附柱重新放回收集管中，于12000rmp室温离心2min，弃去残留的CW2 Solution。将吸附柱打开盖子于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的CW2 Solution，CW2 Solution的残留会影响基因组DNA的产量和后续的实验。

1.8)取出吸附柱，放入一个新的1.5ml离心管中，加入50-200ul CE Buffer静置3min，12000rmp室温离心2min，收集DNA溶液，即为海参组织的总DNA。提取的DNA可立即进行下一步实验或-20℃保存。

2、PCR方法扩增

以提取的DNA为模板，采用创伤弧菌特异性引物P3，利用PCR方法扩增，得到PCR产物；

P3-F:CACTCAGCTTCGTAACAGCT

P3-F R:CCATTCTTCGCTTGACTCGTTG

PCR反应条件：第一阶段：94℃5min；

第二阶段：94℃30s，66℃30s，72℃30s；30循环；

第三阶段：72℃5min；

第四阶段：4℃保存。

3、PCR扩增产物在1％琼脂糖1×TAE缓冲系统中电泳，每孔加样5ul，用凝胶成像系统观察并摄影记录，如图12所示。

4、判断标准：根据PCR扩增产物的琼脂糖凝胶呈像结果判断该引物实际检测效果；如果琼脂糖凝胶呈现结果有283bp条带产生，则实际检测效果良好。如果琼脂糖凝胶未呈现结果有283bp条带产生，则实际检测效果不理想。

由图12可见，注射0.1ml创伤弧菌菌液的海参组织(1-7)均产生283bp大小条带，而注射0.90％生理盐水的海参组织(8-14)未产生283bp大小条带，由此可见，本发明根据创伤弧菌rpoD基因所设计的特异性引物具有较好的检测能力，可应用到实际检测中。

实施例4

(一)创伤弧菌特异性引物P4的设计

本实施例针对菌种创伤弧菌(Vibrio vulnificus)的topA基因，利用软件LSPrimer(http://ccsipb.lnu.edu.cn/primer/)和MEGA6软件，设计出对创伤弧菌(Vibrio vulnificus)具有特异性强且灵敏性高的一对特异性引物P4，该创伤弧菌特异性引物的具体信息如表16所示。

表16

(二)创伤弧菌特异性引物P4最佳PCR反应条件的探索

1、创伤弧菌DNA的提取：同实施例1

2、创伤弧菌特异性引物P4最佳退火温度的探索

分别以提取的创伤弧菌的DNA为模板做PCR扩增，并将目的引物的退火温度分别设置为56℃、57℃、58℃、59℃、60℃，PCR扩增产物在1％琼脂糖1×TAE缓冲系统中电泳，每孔加样5ul，用凝胶成像系统观察并摄影记录，根据PCR后的凝胶电泳结果确定创伤弧菌特异性引物的最佳退火温度。具体PCR反应条件和体系如表17所示，结果如图13。

表17目的引物最佳PCR反应探索条件

由图13可见，温度对该引物并无明显影响，但根据PCR基本原则，温度越高越有利于引物的特异性结合，故确定最佳退火温度为60℃。

(三)创伤弧菌特异性引物P4的特异性探索

1、待试菌株DNA的提取：使用Ezup柱氏基因组DNA抽提试剂盒(细菌)，分别提取如表14所示的不同菌种的DNA，具体步骤如实施例1的(二)中步骤1

2、特异性探索

分别以表14中，提取的不同菌种的DNA为模板做PCR扩增，具体PCR反应条件和体系如表15所示，PCR后的凝胶电泳结果如图14所示。

表14待试菌株如下：

表15目的引物最佳PCR反应条件

由图14可见，本发明的创伤弧菌特异性引物在弧菌属内，以及气单胞菌属和假单胞菌属内均表现出很强的特异性，只能和目的菌株创伤弧菌产生特异性扩增，而非目的菌株未产生特异性扩增。故可见其表现出很强的特异性。

(四)创伤弧菌特异性引物P4的灵敏性的探索

1、创伤弧菌DNA的提取：同实施例1

2、灵敏性的探索

将创伤弧菌的DNA浓度调至10¹ng/ul，并且依次稀释为10⁰ng/ul、10^-1ng/ul、10^-2ng/ul、10^-3ng/ul、10^-4ng/ul、10^-5ng/ul，分别取1ul DNA作为PCR反应模板，具体PCR反应条件和体系如表16所示，PCR后的凝胶电泳结果如图15所示。

表16目的引物最佳PCR反应探索条件

由图15可见，本发明的创伤弧菌特异性引物在创伤弧菌DNA浓度为10¹ng/ul、10⁰ng/ul、10^-1ng/ul时均可产生特异性扩增，其最低检测浓度可达到10^-1ng/ul。

(五)大菱鲆养殖过程中创伤弧菌的PCR检测

1、提取大菱鲆组织的总DNA；

使用Ezup柱氏动物基因组DNA抽提试剂盒，提取大菱鲆组织的DNA，具体步骤如下：

1.1)分别取约未注射创伤弧菌和注射0.1ml创伤弧菌菌悬液的25mg大菱鲆组织，用液氮研磨成粉末，加到1.5ml离心管中，加入180ul Buffer ACL，再加入20ul Proteinase K溶液，震荡混匀。56℃水浴1h至细胞完全裂解。

1.2)加入200ul Buffer CL，充分颠倒混匀。加入Buffer CL后，如有沉淀产生，可70℃水浴10分钟。

1.3)加入200ul的无水乙醇，充分颠倒混匀。加入无水乙醇后可能产生半透明纤维状悬浮物，不影响DNA的提取和应用。

1.4)将吸附柱放入收集管中，用移液器将步骤1.3)获得的溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中，静置2min，在12000rmp室温离心1min，倒掉收集管中的废液。

1.5)将吸附柱重新放回收集管中，加入500ul CW1 Solution，10000rmp离心30s，倒掉收集管滤液。

1.6)将吸附柱重新放回收集管，加入500ul CW2 Solution，10000rmp离心30s，倒掉滤液。

1.7)将吸附柱重新放回收集管中，于12000rmp室温离心2min，弃去残留的CW2 Solution。将吸附柱打开盖子于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的CW2 Solution，CW2 Solution的残留会影响基因组DNA的产量和后续的实验。

1.8)取出吸附柱，放入一个新的1.5ml离心管中，加入50-200ul CE Buffer静置3min，12000rmp室温离心2min，收集DNA溶液，即为大菱鲆组织的总DNA。提取的DNA可立即进行下一步实验或-20℃保存。

2、PCR方法扩增

以提取的DNA为模板，采用创伤弧菌特异性引物P4，利用PCR方法扩增，得到PCR产物；

P4-F:CGCTGTGAAGCTTTTGGTGG

P4-R:GATGTACCCACGAACCGCTT

PCR反应条件：第一阶段：94℃5min；

第二阶段：94℃30s，60℃30s，72℃30s；30循环；

第三阶段：72℃5min；

第四阶段：4℃保存。

3、PCR扩增产物在1％琼脂糖1×TAE缓冲系统中电泳，每孔加样5ul，用凝胶成像系统观察并摄影记录，如图16所示。

4、判断标准：根据PCR扩增产物的琼脂糖凝胶呈像结果判断该引物实际检测效果；如果琼脂糖凝胶呈现结果有421bp条带产生，则实际检测效果良好。如果琼脂糖凝胶未呈现结果有421bp条带产生，则实际检测效果不理想。

由图16可见，注射0.1ml创伤弧菌菌液的大菱鲆组织(1-7)均产生421bp大小条带，而注射0.90％生理盐水的大菱鲆组织(8-14)未产生421bp大小条带，由此可见，本发明根据创伤弧菌pyrH基因所设计的特异性引物具有较好的检测能力，可应用到实际检测中。