专利名称：创伤弧菌的一管法半巢式pcr检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及一种采用一管法半巢式PCR检测创伤弧菌的试剂盒，进一步涉及使用一管法半巢式PCR检测试剂盒检测创伤弧菌的方法。
背景技术：
创伤弧菌(Vibrio vulnificus)是一种人兽共患的病原，主要分布于世界各地的暖水性近海与海湾的海水、海底沉积物及动物体内(Pfeffer et al，2003；郑国兴等，1999)，可通过进食生的或未熟透的海鲜食物或通过破损的皮肤接触海水而引发感染，能强烈引起人类(Nascimento et al，2001)和多种水生动物如石碟鱼(沈志强等，2001)、军曹鱼(简纪常等，2003)、三疣梭子蟹(何伟贤，2004)等的死亡率极高的败血症与脓毒症，由于该细菌易产生抗药性的特点，目前还没有治疗这一严重疾病的理想方法，因此，创伤弧菌的快速检测将是促使人类健康和水产品健康养殖的关键。现有的创伤弧菌的检测手段主要有传统的分离培养与生化鉴定、ELISA技术、DNA杂交技术、分子探针杂交技术、普通双引物PCR技术等，这些方法有的具有费时费工和专业性要求高，有的具有操作难度大，有的具有敏感度低等缺点，很难在水产养殖过程中实际推广，已明显防碍了因创伤弧菌而引发的重大流行性疾病的防治。
半巢式PCR是通过3条特异性引物而实现的，其中一条为公用引物，另外两条分别为内外侧引物，这一方法明显提高了PCR检测技术的特异性，具有操作简单、灵敏度高、快速准确等优点，是国内外病害研究学者进行病原检测的首选方法，因此，该技术在细菌性病原的检测中已得到广泛应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种可快速检测创伤弧菌的一管法半巢式PCR检测试剂盒，特别是提供3种创伤弧菌特异性引物Vvg1、Vvg2、Vvg3，并提供一种使用一管法半巢式PCR检测试剂盒检测创伤弧菌的方法。
本发明利用创伤弧菌gyrB基因的3个特异性位点而设计了半巢式PCR的3条寡聚核苷酸引物(Vvg1、Vvg2、Vvg3)，在高保真的PCR聚合酶系统中，首先用Vvg1和Vvg2进行扩增数个循环，可产生一定量的700bp的片段，然后再加入引物Vvg3，这时，两对引物(Vvg1和Vvg2、Vvg1和Vvg3)均可对自身的模板进行有效的扩增，但Vvg1和Vvg3这一对引物的扩增效率要大于前一对引物(Vvg1和Vvg2)的扩增效率，这样就确保了产物中700bp和350bp的2条片段的终产量基本相同，以此达到检测的高灵敏和高准确度。
本发明所采用的技术方案是一种一管法半巢式PCR检测创伤弧菌的试剂盒，包括(1)DNA提取试剂含缓冲试剂A和细胞裂解试剂B；试剂A含有NaCl 200～350mmol/L，三羟甲基氨基甲烷50～100mmol/L(ph＝8.0)，乙二胺四乙酸二钠50～100mmol/L；试剂B含有浓度为5～10％的十二烷基磺酸钠水溶液；(2)聚合酶链式反应试剂包括反应预混试剂C和反应引物试剂D和E；试剂C包括10×反应缓冲液5μL、500～1000μmol L-1的dNTPs(四种脱氧核苷酸等浓度的混合物)、1～5mmol L-1的MgCl2，1～2个单位的热聚合酶和适量的灭菌超纯水；试剂D包括2种引物，浓度均为5～20μmol L-1，这里的引物特指Vvg1(5’-CATCGTGGTGGTCATACTCATAGC-3’)Vvg2(5’-GGTGCTCGGCTAAGAAGTCGTT-3’)试剂E包括1种引物，其浓度为10～30μmol L-1，这里的引物特指Vvg3(5’-AAGACGGGATTGCGGTTGAAGT-3’)(3)电泳和显色试剂，包括试剂F、试剂G、试剂H和试剂I；试剂F为20-50倍电泳缓冲液，含三羟基甲基氨基甲烷——醋酸和乙二胺四乙酸二钠，浓度分别为0.01～0.04mol/L和0.001mol/L；试剂G含0.1～0.5g琼脂糖；试剂HNucleic acid ClearDNA stain试剂I标准分子量DL2000使用上述一管法半巢式PCR检测创伤弧菌的试剂盒检测创伤弧菌的方法包括下列步骤1、样品处理取0.5～5克样品(水样1～5ml)，用50～1000μL试剂A悬浮样品，并将样品充分混匀，1000～3000g离心3～10分钟，取上清转管，8000～15000g离心3～10分钟，弃上清；
2、DNA提取用50～150μL试剂A再次悬浮沉淀，并加入5～10μL试剂B，混匀，室温放置5分钟以上，沸水浴中保温10～30分钟；8000～15000g离心10分钟，取上清转管，并加入上清2/3体积的异丙醇；混匀后室温放置10分钟，8000～15000g离心5分钟；去上清，75％乙醇洗涤一次，让乙醇彻底挥发，将沉淀溶于10～50μL灭菌双蒸水，即制成了DNA提取液；3、聚合酶链式反应扩增取0.5～2μL DNA提取液和40～45μL试剂C、1～2μL试剂D混合；在热循环仪上按以下方法进行扩增首先以94℃预变性1～4min；接着以92～95℃变性0.5～2min，62℃退火0.5～2min，72℃延伸0.5～2min，共扩增5～15个循环；加入1～2μL试剂E，以92～95℃变性0.5～2min，62℃退火0.5～2min，72℃延伸0.5～2min，再扩增20～40个循环；最后72℃延伸5～10min，4℃保存；4、电泳和显色检测将试剂F稀释成1倍的电泳缓冲液，取10～40mL的1倍电泳缓冲液和试剂G充分混匀后煮沸，用10cm×10cm的核酸水平电泳槽制胶，凝固后加入适量的1倍电泳缓冲液，使液面高于胶面0.5～2mm左右；取5～20μL扩增后的样品与0.8～4μL试剂H在保鲜膜上混合，静置5～10min以上，将此混合样品加于上述胶孔中，同时，在另一胶孔中加入1～5μL的试剂I；50～100V电泳20～30min；紫外光下检测，如果同时有一条700核苷酸对和一条350的核苷酸对条带，说明样品已被创伤弧菌感染或污染；如果样品中只有一条350核苷酸对条带，则需要用引物Vvg1和Vvg3做另一扩增反应实验，如果样品中能产生一条700核苷酸对的条带，同样说明样品有创伤弧菌感染或污染；反之则没有。
本发明的优点1、目前，针对创伤弧菌的PCR检测，都是双引物的普通PCR，本发明首次利用半巢式PCR实现了该病原的特异性强、灵敏度高的检测。
2、标准的半巢式PCR需要分别在2个不同的反应体系中进行2次扩增，从采集样品到读出检测结果所需的检测时间在1天左右。通过条件优化，本发明在1个反应体系中经过1次扩增实现了半巢式PCR，从采集样品到读出检测结果所需的检测时间在4个小时之内，提高了半巢式PCR的检测效率。
图1是紫外光下检测创伤弧菌灵敏度效果图。M试剂I；1106个菌体/ml样品；2105个菌体/ml样品；3104个菌体/ml样品；4103个菌体/ml样品；5102个菌体/ml样品；6101个菌体/ml样品；7100个菌体/ml样品；8和9空白样品。
图2是对环境海水样品中创伤弧菌的检测效果图。M试剂I；1海水样品；20.22μm滤膜过滤海水样品；3未加模板扩增样品；4ddH2O样品。
图3是对虾消化道中创伤弧菌的检测效果图。M试剂I；1对虾消化道样品；2未加模板扩增样品；3ddH2O样品。
具体实施例方式
下面用非限定性实施例对本发明进一步说明。
实施例一、检测对创伤弧菌灵敏度的测试，按下列步骤进行1、通过显微计数法确定创伤弧菌原液浓度为106个菌体/ml；2、将上述原液作梯度稀释为105个菌体/ml、104个菌体/ml、103个菌体/ml、102个菌体/ml、101个菌体/ml和100个菌体/ml；3、每个样品取1ml，10000g离心3分钟，弃上清；4、用60μL试剂A(NaCl 250mmol/L，三羟甲基氨基甲烷60mmol/L(ph＝8.0)，乙二胺四乙酸二钠50mmol/L)悬浮沉淀，并加入8μL试剂B(8％的十二烷基磺酸钠水溶液)，混匀，室温放置5分钟以上，沸水浴中保温15分钟；11000g离心10分钟，取上清转管，并加入50μL异丙醇；混匀后室温放置10分钟，12000g离心5分钟；去上清，75％乙醇洗涤一次，让乙醇彻底挥发，将沉淀溶于30μL灭菌双蒸水，即制成了DNA提取液；5、聚合酶链式反应扩增取1μL DNA提取液和22μL试剂C(10×反应缓冲液5μL、800μmol L-1的dNTPs、2mmol L-1的MgCl2，2个单位的热聚合酶和适量的灭菌超纯水)、1μL试剂D(10μmol L-1的Vvg1和Vvg2)混合；在热循环仪上按以下方法进行扩增首先以94℃预变性4min；接着以93℃变性1.5min，62℃退火1.5min，72℃延伸1.5min，共扩增8个循环；加入1μL试剂E(8μmol L-1的Vvg3)，以93℃变性1min，62℃退火1min，72℃延伸1.5min，再扩增30个循环；最后72℃延伸7min，4℃保存；
6、电泳和显色检测将试剂F稀释成1倍的电泳缓冲液，取25mL的1倍电泳缓冲液和试剂G(0.3g琼脂糖)充分混匀后煮沸，用10cm×10cm的核酸水平电泳槽制胶，凝固后加入适量的1倍电泳缓冲液，使液面高于胶面0.5mm左右；取10μL扩增后的样品与2μL试剂H在保鲜膜上混合，静置15min，将此混合样品加于上述胶孔中，同时，在另一胶孔中加入3μL的试剂I；60V电泳25min；紫外光下检测，结果见图1，除101个菌体/ml样品的两条带(350bp和700bp)较弱外，其它5个浓度梯度(106~102)均有明显的700bp和350bp的两条带。
从检测结果中可以得出结论本发明所提供的检测创伤弧菌的试剂盒的检测极限可达10个菌体/ml。
实施例二、按下列步骤对环境海水样品中创伤弧菌的检测1、从海口某海区取海水3ml，10000g离心10分钟，弃上清，用50μL试剂A(NaCl 250mmol/L，三羟甲基氨基甲烷60mmol/L(ph＝8.0)，乙二胺四乙酸二钠50mmol/L)悬浮样品，并将样品充分混匀；2、加入5μL试剂B(8％的十二烷基磺酸钠水溶液)，混匀，室温放置8分钟以上，沸水浴中保温20分钟；12000g离心10分钟，取上清转管，并加入40μL异丙醇；混匀后室温放置10分钟，12000g离心5分钟；去上清，75％乙醇洗涤一次，让乙醇彻底挥发，将沉淀溶于20μL灭菌双蒸水，即制成了DNA提取液；
3、聚合酶链式反应扩增取3μL DNA提取液和43μL试剂C(10×反应缓冲液5μL、1000μmol L-1的dNTPs、2.5mmol L-1的MgCl2，1.5个单位的热聚合酶和适量的灭菌超纯水)、2μL试剂D(10μmol L-1的Vvg1和Vvg2)混合；在热循环仪上按以下方法进行扩增首先以94℃预变性4min；接着以93℃变性1min，61℃退火1min，72℃延伸1.5min，共扩增10个循环；加入2μL试剂E(10μmol L-1的Vvg3)，以93℃变性1min，62℃退火0.5min，72℃延伸1.5min，再扩增25个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存；4、电泳和显色检测将试剂F稀释成1倍的电泳缓冲液，取30mL的1倍电泳缓冲液和试剂G(0.3g琼脂糖)充分混匀后煮沸，用10cm×10cm的核酸水平电泳槽制胶，凝固后加入适量的1倍电泳缓冲液，使液面高于胶面0.5mm左右；取10μL扩增后的样品与2μL试剂H在保鲜膜上混合，静置10min以上，将此混合样品加于上述胶孔中，同时，在另一胶孔中加入3μL的试剂I；60V电泳40min；紫外光下检测，明显可见一条700核苷酸对和一条350的核苷酸对条带(见图2)，表明该水域样品中含有创伤弧菌。
实施例三、按下列步骤对虾消化道中创伤弧菌的检测1、从市场购得养殖凡纳滨对虾500g(体长为20cm左右)，随机取2尾作为检测样品，解剖分离样品的消化道，转入5ml无菌离心管中，加入1000μL试剂A悬浮样品，并将样品充分混匀，1500g离心10分钟；取上清转管，12000g离心8分钟，弃上清；
2、用50μL试剂A(NaCl 250mmol/L，三羟甲基氨基甲烷60mmol/L(ph＝8.0)，乙二胺四乙酸二钠50mmol/L)悬浮样品，并将样品充分混匀，加入5μL试剂B(10％的十二烷基磺酸钠水溶液)，混匀，室温放置5分钟以上，沸水浴中保温25分钟；10000g离心10分钟，取上清转管，并加入40μL异丙醇；混匀后室温放置10分钟，12000g离心5分钟；去上清，75％乙醇洗涤一次，让乙醇彻底挥发，将沉淀溶于30μL灭菌双蒸水，即制成了DNA提取液；3、聚合酶链式反应扩增取2μL DNA提取液和50μL试剂C(10×反应缓冲液5μL、1000μmol L-1的dNTPs、2.5mmol L-1的MgCl2，1.5个单位的热聚合酶和适量的灭菌超纯水)、2μL试剂D(15μmol L-1的Vvg1和Vvg2)混合；在热循环仪上按以下方法进行扩增94℃预变性3min；接着以93℃变性1min，60℃退火1.5min，72℃延伸1.5min，共扩增10个循环；加入2μL试剂E(10μmol L-1的Vvg3)，以93℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min，再扩增25个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存；4、电泳和显色检测将试剂F稀释成1倍的电泳缓冲液，取25mL的1倍电泳缓冲液和试剂G(0.25g琼脂糖)充分混匀后煮沸，用10cm×10cm的核酸水平电泳槽制胶，凝固后加入适量的1倍电泳缓冲液，使液面高于胶面0.5mm左右；取10μL扩增后的样品与2μL试剂H在保鲜膜上混合，静置10min以上，将此混合样品加于上述胶孔中，同时，在另一胶孔中加入3μL的试剂I；60V电泳40min；紫外光下检测，明显可见一条700核苷酸对和一条350的核苷酸对条带(见图3)，结果表明该对虾样品已被创伤弧菌污染。
权利要求
1.一种一管法半巢式PCR检测试剂盒，包括(1)DNA提取试剂含缓冲试剂A和细胞裂解试剂B；试剂A含有NaCl 200～350mmol/L，三羟甲基氨基甲烷50～100mmol/L(ph＝8.0)，乙二胺四乙酸二钠50～100mmol/L；试剂B含有浓度为5～10％的十二烷基磺酸钠水溶液；(2)聚合酶链式反应试剂包括反应预混试剂C和反应引物试剂D和E； 试剂C包括10×反应缓冲液5μL、500～1000μmol L-1的dNTPs(四种脱氧核苷酸等浓度的混合物)、1～5mmol L-1的MgCl2，1～2个单位的热聚合酶和适量的灭菌超纯水；试剂D包括引物Vvg1和Vvg2，浓度均为5～20μmol L-1，Vvg1特指(5’-CATCGTGGTGGTCATACTCATAGC-3’)；Vvg2特指(5’-GGTGCTCGGCTAAGAAGTCGTT-3’)；试剂E包括引物Vvg3，其浓度为10～30μmol L-1，Vvg3特指(5’-AAGACGGGATTGCGGTTGAAGT-3’)；(3)电泳和显色试剂，包括试剂F、试剂G、试剂H和试剂I；试剂F为20-50倍电泳缓冲液，含三羟基甲基氨基甲烷--醋酸和乙二胺四乙酸二钠，浓度分别为0.01～0.04mol/L和0.001mol/L；试剂G含0.1～0.5g琼脂糖；试剂HNucleic acid ClearDNA stain试剂I标准分子量DL2000。
2.一种使用权利要求1中的试剂盒检测创伤弧菌的方法，包括下列步骤1)、样品处理取0.5～5克样品，用50～1000μL试剂A悬浮样品，并将样品充分混匀，1000～3000g离心3～10分钟，取上清转管，8000～15000g离心3～10分钟，弃上清；2)、DNA提取用50～150μL试剂A再次悬浮沉淀，并加入5～10μL试剂B，混匀，室温放置5分钟以上，沸水浴中保温10～30分钟；8000～15000g离心10分钟，取上清转管，并加入上清2/3体积的异丙醇；混匀后室温放置10分钟，8000～15000g离心5分钟；去上清，75％乙醇洗涤一次，让乙醇彻底挥发，将沉淀溶于10～50μL灭菌双蒸水，即制成了DNA提取液；3)、聚合酶链式反应扩增取0.5～2μL DNA提取液和40～45μL试剂C、1～2μL试剂D混合；在热循环仪上按以下方法进行扩增首先以94℃预变性1～4min；接着以92～95℃变性0.5～2min，62℃退火0.5～2min，72℃延伸0.5～2min，共扩增5～15个循环；加入1～2μL试剂E，以92～95℃变性0.5～2min，62℃退火0.5～2min，72℃延伸0.5～2min，再扩增20～40个循环；最后72℃延伸5～10min，4℃保存；4)、电泳和显色检测将试剂F稀释成1倍的电泳缓冲液，取10～40mL的1倍电泳缓冲液和试剂G充分混匀后煮沸，用10cm×10cm的核酸水平电泳槽制胶，凝固后加入适量的1倍电泳缓冲液，使液面高于胶面0.5～2mm左右；取5～20μL扩增后的样品与0.8～4μL试剂H在保鲜膜上混合，静置5～10min以上，将此混合样品加于上述胶孔中，同时，在另一胶孔中加入1～5μL的试剂I；50～100V电泳20～30min；紫外光下检测，如果同时有一条700核苷酸对和一条350的核苷酸对条带，说明样品已被创伤弧菌感染或污染；如果样品中只有一条350核苷酸对条带，则需要用引物Vvg1和Vvg3做另一扩增反应实验，如果样品中能产生一条700核苷酸对的条带，同样说明样品有创伤弧菌感染或污染；反之则没有。
3.根据权利要求2所述的检测创伤弧菌的方法，其特征在于所述样品为1～5ml水样样品。
全文摘要
本发明提供了一种可快速检测创伤弧菌的一管法半巢式PCR检测试剂盒及检测方法。试剂盒包括(1)DNA提取试剂含缓冲试剂A和细胞裂解试剂B；(2)聚合酶链式反应试剂包括反应预混试剂C和反应引物试剂D和E，试剂D中的特异引物Vvg1为5′－CATCGTGGTGGTCATACTCATAGC－3′，Vvg2为5′－GGTGCTCGGCTAAGAAGTCGTT－3′，试剂E中的特异引物Vvg3为5′－AAGACGGGATTGCGGTTGAAGT－3′；(3)电泳和显色试剂，包括试剂F、试剂G、试剂H和试剂I。检测方法包括(1)样品处理；(2)DNA提取；(3)聚合酶链式反应扩增；(4)电泳和显色检测。本发明的优点是检测速度快，特异性强、灵敏度高。
文档编号C12Q1/68GK101082063SQ200710100758
公开日2007年12月5日 申请日期2007年4月17日 优先权日2007年4月17日
发明者谢珍玉, 周永灿, 冯永勤 申请人:海南大学 被以下专利引用 (1),