专利名称：重组创伤弧菌铁摄取调节蛋白及制备方法
技术领域：
本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及一种操作简便、成本低廉、重组蛋白
纯度好、得率高、适应于工业化生产的重组创伤弧菌铁摄取调节蛋白及制备方法。
背景技术：
创伤弧菌是一种嗜盐性革兰氏阴性细菌，生存于海洋和河口环境中，易引起海洋 动物(如海水鱼、虾、贝)伤口感染、胃肠炎和败血症等，是主要的病原弧菌之一，给海水养 殖业带来巨大的经济损失。弧菌的生长及致病与很多微量元素有关，铁是维持弧菌新陈代 谢所必需的营养物质之一，对病原菌的复制增殖是必需的，所以弧菌在缺铁的环境中不能 生长，但是如果摄取过量也会因形成羟基而引起细胞毒作用和氧化应激，从而停止生长。存 在于弧菌中的铁摄取调节蛋白(Fur)可作为阻遏蛋白与二价铁形成稳定的复合物，该复合 物与铁调控基因上游长度19bp的操纵子序列结合，从而达到抑制转录减低细胞内铁浓度 的目的，同时抑制铁吸收系统许多编码基因及其铁调节基因的表达。研究铁摄取调节蛋白 在弧菌代谢过程中的作用，有助于深入了解弧菌的致病机制，从而可有效地控制弧菌病的 流行。然而，从创伤弧菌中直接提取该蛋白的操作复杂、成本高、产量少，不能大规模产业化 生产且所得蛋白容易降解，因此人们致力于重组制备创伤弧菌铁摄取调节蛋白。
现有技术已有关于对弧菌铁摄取调节蛋白(Fur)表达的报道(钱荣华，于涟，毛芝 娟，等。溶藻弧菌铁调蛋白基因的克隆、表达及其特征分析。科技通报，2007，23 :651-657)， 是通过将溶藻弧菌铁摄取调节蛋白基因与pET-30a(+)表达载体重组获得表达质粒来表达 Fur蛋白的。但是，此方法在表达过程中产生了包涵体，所以在纯化前要对样品进行变性和 复性，不仅操作复杂，增加制备成本，也容易使蛋白结构遭到破坏。
发明内容
本发明是为了克服现有技术所存在的上述技术问题，提供一种操作简便、成本低 廉、重组蛋白纯度好、得率高、适应于产业化生产的重组创伤弧菌铁摄取调节蛋白及制备方 法。 本发明的技术解决方案是一种重组创伤弧菌铁摄取调节蛋白，其氨基酸序列如 SEQ ID NO :4。 —种上述重组创伤弧菌铁摄取调节蛋白的制备方法，其特征在于按如下步骤进 行 a.培养创伤弧菌菌种并提取DNA ; b.设计创伤弧菌铁摄取调节蛋白编码序列的引物对，以上述提取的创伤弧菌DNA 为模板进行PCR扩增； c.PCR电泳回收产物与克隆载体pMD19T连接并转化入大肠杆菌感受态细胞 DH5 a ，在含氨苄青霉素的LB固体培养基上培养通过蓝白斑法筛选阳性克隆，选择450bp大 小的条带进行回收；
d.用限制性内切酶EcoR I和Xho I分别双酶切c步骤回收产物和表达载体 pET-32a(+)，将得到的两种目的基因片断用DNA连接酶连接，转化入大肠杆菌感受态细胞 DH5 a进行培养并筛选提取重组表达质粒； e.将所提取的重组表达质粒转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)内，培养菌株得
菌液，用IPTG诱导菌液，收集菌种； f.将所收集的菌种进行扩大培养，收集菌体； g.将菌体破碎、裂解、纯化，收集纯化液。 所述引物对的核苷酸序列为 上游引物VuF : 5' -CCGGAATTCATGTCAGACAATAACCAAGC-3';
下游引物VuR :5' -CCCTCGAGGTTCTTACGTTTATGTGCG-3'。 所述PCR反应条件为94t:预变性5分钟后进行94t:变性30秒、56. 2t:复性30 秒、72t:延伸30秒的30个循环的扩增，72t:延伸7分钟后保存于4°C 。
所述e步骤是将所提取的重组质粒转化入大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3)后，挑取 单菌落接种于5ml Amp LB液体培养基过夜培养，再取50 yl过夜培养的菌液接种5ml Amp LB液体培养基，37t:、200转/分摇菌2. 5小时，至菌液的0D600为0. 4，向菌液中加诱导剂 IPTG至终浓度为lmM，37t:摇菌4小时后，回收菌体。 所述g步骤是用PBS重悬f步骤所得菌体，用超声波破碎细菌并用孔径为0. 22 ii m 的过滤器过滤细菌裂解液，在4ml Bind buffer中加lml 50^的Ni-NTA HisBind树脂悬 液，轻轻混匀，静置，待树脂沉淀后取沉淀；在沉淀中加4ml细菌裂解液，轻轻混匀后用振荡 器4°C ， 200rpm振荡1 2h形成混合液；将混合液移入纯化柱，用0. 5ml Elute buffer洗 脱，收集洗脱液。 本发明根据GenBank中创伤弧菌铁摄取调节蛋白的DNA序列，设计针对铁摄取调 节蛋白编码序列的引物对，以CTAB法提取的创伤弧菌DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物 与pMD 19T载体连接得重组质粒，经双酶切后再与表达载体pET-32a(+)连接，获重组表达 质粒并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中；通过IPTG诱导实现了重组蛋白的可溶性表达。因在 表达过程中不产生包涵体，该表达质粒表达的融合蛋白带有组氨酸标签，方便了样品的鉴 定和纯化，避免了样品的变性和复性，不但操作简单，降低了制作成本，更主要的是蛋白结 构不受破坏；重组蛋白纯度好、得率高且不易降解，适应于工业化生产，为进一步研究创伤 弧菌铁摄取调节蛋白的功能奠定基础。
图1本发明实施例创伤弧菌铁摄取调节蛋白基因片断的琼脂糖凝胶电泳分析图。
图2本发明实施例重组表达质粒的双酶切电泳鉴定图。
图3本发明实施例纯化柱洗脱组分的SDS-PAGE分析图。
图4本发明实施例重组表达质粒表达产物的SDS-PAGE分析图。
图5本发明实施例重组表达质粒诱导表达的蛋白印迹分析图。
具体实施例方式 实施例
a.将创伤弧菌菌种ATCC 27562接种于2216E琼脂平板上，28。C过夜培养，从所述 接种于2216E琼脂平板上的创伤弧菌菌体中以CTAB法提取DNA。 b.根据已发表的GenBank中创伤弧菌的铁摄取调节蛋白基因保守序列设计针对 铁摄取调节蛋白编码序列的引物对，以上述提取的创伤弧菌DNA为模板进行PCR扩增，引物 对的核苷酸序列为 上游引物VuF : 5' -CCGGAATTCATGTCAGACAATAACCAAGC-3';
下游引物VuR : 5' -CCCTCGAGGTTCTTACGTTTATGTGCG-3'。 PCR反应条件为94t:预变性5分钟后进行94t:变性30秒、56. 2"C复性30秒、72t: 延伸30秒的30个循环的扩增，72t:延伸7分钟后保存于4°C 。 引物对由上海生物工程有限公司合成，划线部分分别为EcoR I酶切位点和Xhol 酶切位点。 以创伤弧菌基因组DNA为模板，用PCR技术获得目的基因。目的基因片断的琼脂 糖凝胶电泳分析图如图1所示，图中1 :铁摄取调节蛋白基因的PCR产物；2 :阴性对照；M :
Maker DL2000。 c.PCR电泳回收产物与克隆载体pMD19T连接并转化入大肠杆菌感受态细胞 DH5a ，在含氨苄青霉素的LB固体培养基上培养通过蓝白斑法筛选阳性克隆，用酶切方法 对阳性克隆进行分析以鉴定重组质粒并选择450bp大小的条带进行回收。
d.用限制性内切酶EcoR I和Xho I分别双酶切c步骤回收产物和表达载体 pET-32a(+) ，37t:作用2小时后，酶切产物用DNA Fragment Purification Kit(Takara公 司)回收，PCR酶切产物和载体酶切产物按5 : 1混合，T4DNA连接酶(Takara公司)16°C 过夜连接，37t:过夜培养，提取重组表达质粒pET-Fur ;用EcoR I和Xho I对重组表达质粒 双酶切鉴定，鉴定结果如图2所示:图中1 :MakerDL2000 ;2 :pET-Fur经EcoR I和Xho I双 酶切产物。测序结果表明，所测序列与其他弧菌铁摄取调节蛋白Fur编码序列同源性极高， 故初步确认所提取的重组表达质粒为创伤弧菌铁摄取调节蛋白Fur的编码序列。
e.将所提取的重组表达质粒转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)内，培养菌株得 菌液，挑取单菌落接种5ml Amp LB液体培养基过夜培养，取50 过夜培养的菌液接种5ml Amp LB液体培养基，37°C 200转/分摇菌2. 5小时，至0D600为0. 4，所摇菌液加诱导剂IPTG 至终浓度为lmM， 37t:摇菌4小时后，回收菌体，即得到菌种。
f.将所收集的菌种进行扩大培养，收集菌体； g.用BugBuster參Ni-NTA His 扁nci像Purification kit (Novagen公司)纯 化融合蛋白，具体操作步骤是用PBS重悬f步骤所得菌体，用超声波破碎细菌并用孔径为 0. 22 ii m的过滤器过滤细菌裂解液，除去其中的大颗粒。在4ml Bindbuffer中加1ml 50% 的Ni-NTA His Bind树脂悬液，轻轻混匀，静置，待树脂沉淀后用移液枪吸去上清液取沉淀； 在沉淀中加4ml细菌裂解液，轻轻混匀后用振荡器4°C ， 200rpm振荡1 2h形成混合液；将 混合液移入纯化柱，打开底部的盖子，收集液体；用4ml Wash buffer洗涤，收集洗涤液；用 0.5ml Elute buffer洗脱，收集洗脱液。SDS-PAGE分析各收集液，其结果如图3所示图中 1 :蛋白Marker ;2 :洗涤部分；3 :纯化蛋白部分；洗脱液部分即为纯化的蛋白液。
实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子 克隆实验室手册(New York : Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 重组创伤弧菌铁摄取调节蛋白(Fur)的鉴定
l.SDS-PAGE电泳 配制12%的分离胶和5%的浓縮胶。将诱导前的样品和诱导后的样品各取20分别加入20 ill 2XSDS loading buffer混匀，沸水煮5分钟，12000转/分离心10分钟，留取上清做SDS-PAGE。 120V恒压电泳2h、考马斯亮蓝R250染色2小时、脱色液脱色。
观察，在37kDa处有明显条带出现，如图4所示，图中1 :pET32a(+)诱导前产物；2 :pET32a(+)诱导后表达蛋白；3 :pET-Fur诱导前产物；4 :蛋白Marker ;5 :pET-Fur诱导后表达蛋白。 2. Western Blot鉴定 当SDS-PAGE电泳即将结束时，用蒸馏水洗清石墨板并擦干。从SDS-PAGE胶上切下需要转膜的部分，切6张滤纸和1张硝酸纤维素膜(NC)。把硝酸纤维素膜浸没于去离子水的水面中，滤纸浸没于转移缓冲液中，平衡5分钟。按纸、膜、胶、纸的顺序从阳极到阴极摆放正确，连接电源，注意正负极。根据凝胶面积按0. 65-1. OmA/ci^接通电流，电转移O. 5_2h。转移结束后，切断电源，从上至下拆卸装置，逐一拆去各层。在NC上作标记。把凝胶取出进行抗体标记。硝酸纤维素膜放在密封的塑料袋中，内加封闭液和鼠血清(鼠血清为1 : 200稀释)，37t:摇床中温育lh。取出硝酸纤维素膜，用PBS漂洗3次，每次10分钟。滤膜再用TBST漂洗IO分钟。 硝酸纤维素膜放在密封的塑料袋中，内加封闭液和l : 2000稀释的HRP标记的羊抗鼠酶标二抗。37t:摇床中温育lh。取出NC膜，用PBS漂洗4次。将NC膜放在底物液中直到有条带出现( 一般l-5min)，取出NC在水中漂洗一下，放在PBS中。观察结果，在37kDa处有一条特异性免疫条带，如图5所示，图中1 :蛋白Marker ;2 :诱导后的pET-Fur ;3 :诱导前的pET-Fur作为阴性对照，和预期的pET-Fur大小一致。序列表〈110〉大连水产学院〈120〉重组创伤弧菌铁摄取调节蛋白及制备方法〈160>4〈170>Patentin Version 3. 1〈210>1〈211>29〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221>misc_feature〈223〉引物〈400>1ccgg朋ttca tgtc3gac朋t朋cc朋gc 29〈210>2〈211>27
〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221>misc_feature〈223〉引物〈400>2ccctcgaggt tcttacgttt atgtgcg27〈210>3〈211>450〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221>CDS〈223〉重组创伤弧菌铁摄取调节蛋白基因〈400>3atgtc3gac3 ateacc朋gc gcte朋ggatgctggtctte aagtteccct ttcaaggctg60朋朋tttteg朋gtecteca gc朋ccggattgccaacaca tcagtgctga agacctttet120aagaagctga ttgatcttgg cgaggagattggccttgcga cagtetetcg agtgttgaac180cagtttgatg atgccggtet tgttectcgccaccactttg aaggcggtea atcggtettt240gaactttcaa ctcaacatca ccatgatcacctegtttgtc tcgactgcgg tgaagttett300gagttttcgg atgacattet tgaagagcgcc朋3朋g朋3 tcgccgccgc tteteatgtt360caactgacaa accacagcct ctecctttecggcaagtgtg gcgatggctc atgcaaaggt420朋tcc3gacg cacate朋cg teag朋ctea450〈210>4〈211>150〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈221>CDS〈223〉重组创伤弧菌铁摄取调节蛋白〈400>4Met Ser Asp Asn Asn Gin Ala LeuLys Asp Ala Gly Leu Lys Val Thr1 510 15Leu Ser Arg Leu Lys lie Leu GluVal Leu Gin Gin Pro Asp Cys Gin2025 30His lie Ser Ala Glu Asp Leu TyrLys Lys Leu lie Asp Leu Gly Glu35 4045Glu lie Gly Leu Ala Thr Val TyrArg Val Leu Asn Gin Phe Asp Asp50 55 760
AlaGlylieValThrArgHisHisPheGluGlyGlySerValPhe65707580GluLeuSerThrGinHisHisHisAspHisLeuValCysLeuAspCys859095GlyGluVallieGluPheSerAspAsplielieGluGluArgGinLys100105110GlulieAlaAlaAlaTyrAsnValGinLeuThrAsnHisSerLeuTyr115120125LeuTyrGlyLysCysGlyAspGlySerCysGlyAsnProAspAla130135140HisLysArgLysAsnTer145150
权利要求
一种重组创伤弧菌铁摄取调节蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO4。
2. —种如权利要求1所述重组创伤弧菌铁摄取调节蛋白的制备方法，其特征在于按如 下步骤进行a. 培养创伤弧菌菌种并提取DNA;b. 设计创伤弧菌铁摄取调节蛋白编码序列的引物对，以上述提取的创伤弧菌DNA为模 板进行PCR扩增；c. PCR电泳回收产物与克隆载体pMD19T连接并转化入大肠杆菌感受态细胞DH5 a ，在 含氨苄青霉素的LB固体培养基上培养通过蓝白斑法筛选阳性克隆，选择450bp大小的条带 进行回收；d. 用限制性内切酶EcoR I和Xho I分别双酶切c步骤回收产物和表达载体 pET-32a(+)，将得到的两种目的基因片断用DNA连接酶连接，转化入大肠杆菌感受态细胞 DH5 a进行培养并筛选提取重组表达质粒；e. 将所提取的重组表达质粒转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)内，培养菌株得菌 液，用IPTG诱导菌液，收集菌种；f. 将所收集的菌种进行扩大培养，收集菌体；g. 将菌体破碎、裂解、纯化，收集纯化液。
3. 根据权利要求2所述的重组创伤弧菌铁摄取调节蛋白的制备方法，其特征在于所述 引物对的核苷酸序列为上游引物VuF:5' -CCGGAATTCATGTCAGACAATAACCAAGC-3'; 下游引物VuR :5' -CCCTCGAGGTTCTTACGTTTATGTGCG-3'。所述PCR反应条件为94t:预变性5分钟后进行94t:变性30秒、56. 2t:复性30秒、 72t:延伸30秒的30个循环的扩增，72t:延伸7分钟后保存于4°C 。
4. 根据权利要求3所述的重组创伤弧菌铁摄取调节蛋白的制备方法，其特征在于所 述e步骤是将所提取的重组表达质粒转化入大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3)后，挑取单菌落 接种于5ml Amp LB液体培养基过夜培养，再取50 yl过夜培养的菌液接种5ml Amp LB液 体培养基，37t:、200转/分摇菌2. 5小时，至菌液的0D600为0. 4，向菌液中加诱导剂IPTG 至终浓度为lmM，37t:摇菌4小时后，回收菌体。
5. 根据权利要求4所述的重组创伤弧菌铁摄取调节蛋白的制备方法，其特征在于所 述g步骤是用PBS重悬f步骤所得菌体，用超声波破碎细菌并用孔径为0. 22 ii m的过滤器 过滤细菌裂解液，在4ml Bind buffer中加lml 50X的Ni-NTA His Bind树脂悬液，轻轻 混匀，静置，待树脂沉淀后取沉淀；在沉淀中加4ml细菌裂解液，轻轻混匀后用振荡器4t:， 200rpm振荡1 2h形成混合液；将混合液移入纯化柱，用0. 5ml Elute buffer洗脱，收集 洗脱液。
全文摘要
本发明公开一种重组创伤弧菌铁摄取调节蛋白及制备方法，根据创伤弧菌铁摄取调节蛋白的DNA序列，设计引物对并以CTAB法提取的创伤弧菌DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物与pMD19T载体连接得重组质粒，经双酶切后再与表达载体pET-32a(+)连接，获重组表达质粒并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中；通过IPTG诱导实现了重组蛋白的可溶性表达。因在表达过程中不产生包涵体，该表达质粒表达的融合蛋白带有组氨酸标签，方便了样品的鉴定和纯化，避免了样品的变性和复性，不但操作简单，降低了制作成本，更主要的是蛋白结构不受破坏；重组蛋白纯度好、得率高且不易降解，适应于工业化生产，为进一步研究创伤弧菌铁摄取调节蛋白的功能奠定基础。
文档编号C12P21/02GK101698676SQ20091021966
公开日2010年4月28日 申请日期2009年11月5日 优先权日2009年11月5日
发明者仇雪梅, 王秀利, 葛辉, 袁野 申请人:大连水产学院