专利名称：重组副溶血弧菌鞭毛蛋白及制备方法
技术领域：
本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及一种操作简便、成本低廉、重组蛋白
纯度好、得率高、适应于工业化生产的重组副溶血弧菌鞭毛蛋白及制备方法。
背景技术：
副溶血性弧菌是一种常见的革兰氏阴性细菌，生存于近岸、河口和海洋环境中，该 弧菌属条件致病性细菌，能够感染多种养殖动物，如鱼、虾、鲍等，常造成大量死亡，给海水 养殖业带来巨大的经济损失。弧菌粘附于宿主细胞表面是对机体感染致病的先决条件，弧 菌的鞭毛蛋白在其粘附过程及对副溶血弧菌侵入宿主并有效发挥毒素等起着重要作用，毒 力实验表明副溶血弧菌鞭毛蛋白是鱼类感染过程中的一个毒力细胞器。鞭毛不仅与运动有 关，更重要的是在感染与免疫以及分类鉴定等方面发挥重要的作用，特别是免疫原性具有 重要的实际意义。研究表明，弧菌鞭毛蛋白不仅可以激发机体的体液免疫，还可以引起细胞 免疫，产生交叉保护作用，具备作为优良亚单位疫苗的主要特点。然而，从弧菌中直接提取 该蛋白的操作复杂、成本高、产量少，不能大规模产业化生产且所得蛋白容易降解，因此人 们致力于重组制备副溶血弧菌鞭毛蛋白。 现有技术已有关于弧菌鞭毛蛋白(FlaA)表达的报道(钱荣华。溶藻弧菌主要毒 力相关基因的克隆、表达及其免疫原性研究。浙江大学，博士学位论文，2007， 45-60)，是通 过将溶藻弧菌鞭毛蛋白(FlaA)基因与pET-30a(+)表达载体重组获得表达质粒来表达FlaA 蛋白的。但是，此方法在表达过程中产生了包涵体，所以在纯化前要对样品进行变性和复 性，不仅操作复杂，增加制备成本，也容易使蛋白结构遭到破坏。
发明内容
本发明是为了克服现有技术所存在的上述技术问题，提供一种操作简便、成本低 廉、重组蛋白纯度好、得率高、适应于产业化生产的重组副溶血弧菌鞭毛蛋白及制备方法。
本发明的技术解决方案是一种重组副溶血弧菌鞭毛蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO :4。 —种上述重组副溶血弧菌鞭毛蛋白的制备方法，其特征在于按如下步骤进行
a.培养副溶血弧菌菌种并提取DNA ; b.设计副溶血弧菌鞭毛蛋白编码序列的引物对，以上述提取的副溶血弧菌DNA为 模板进行PCR扩增； c.PCR电泳回收产物与克隆载体pMD19T连接并转化入大肠杆菌感受态细胞 DH5a ，在含氨苄青霉素的LB固体培养基上培养通过蓝白斑法筛选阳性克隆，选择1131bp 大小的条带进行回收； d.用限制性内切酶BamH I和Xho I分别双酶切c步骤回收产物和表达载体 pET-32a(+)，将得到的两种目的基因片断用DNA连接酶连接，转化入大肠杆菌感受态细胞 DH5 a进行培养并筛选提取重组表达质粒；
e.将所提取的重组表达质粒转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)内，培养菌株得
菌液，用IPTG诱导菌液，收集菌种； f.将所收集的菌种进行扩大培养，收集菌体； g.将菌体破碎、裂解、纯化，收集纯化液。 所述引物对的核苷酸序列为 上游引物PaF : 5' -GCGCGGATCCATGGCGATTAACGTTAATACT-3';
下游引物PaR : 5' -GACTCGAGGCCCAACAAGCTTAGCGCTGC-3'。 所述PCR反应条件为94t:预变性5分钟后进行94t:变性30秒、58。C复性30秒、 72t:延伸30秒的30个循环的扩增，72t:延伸7分钟后保存于4°C 。 所述e步骤是将所提取的重组表达质粒转化入大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3)后， 挑取单菌落接种于5ml Amp LB液体培养基过夜培养，再取50 yl过夜培养的菌液接种5ml Amp LB液体培养基，37°C 、200转/分摇菌2. 5小时，至菌液的0D600为0. 4，向菌液中加诱 导剂IPTG至终浓度为lmM，37。C摇菌4小时后，回收菌体。 所述g步骤是用PBS重悬f步骤所得菌体，用超声波破碎细菌并用孔径为0. 22 ii m 的过滤器过滤细菌裂解液，在4ml Bind buffer中加lml 50^的Ni-NTA HisBind树脂悬 液，轻轻混匀，静置，待树脂沉淀后取沉淀；在沉淀中加4ml细菌裂解液，轻轻混匀后用振荡 器4°C ， 200rpm振荡1 2h形成混合液；将混合液移入纯化柱，用0. 5ml Elute buffer洗 脱，收集洗脱液。 本发明根据GenBank中副溶血弧菌鞭毛蛋白的DNA序列，设计针对鞭毛蛋白编码 序列的引物对，以CTAB法提取的副溶血弧菌DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物与pMD19T 载体连接得重组质粒，经双酶切后再与表达载体pET-32a (+)连接，获重组表达质粒并转化 至大肠杆菌BL21(DE3)中；通过IPTG诱导实现了重组蛋白的可溶性表达。因在表达过程中 不产生包涵体，该表达质粒表达的融合蛋白带有组氨酸标签，方便了样品的鉴定和纯化，避 免了样品的变性和复性，不但操作简单，降低了制作成本，更主要的是蛋白结构不受破坏； 重组蛋白纯度好、得率高且不易降解，适应于工业化生产，为进一步研究副溶血弧菌鞭毛蛋 白的功能奠定基础。
图1本发明实施例副溶血弧菌鞭毛蛋白基因片断的琼脂糖凝胶电泳分析图。
图2本发明实施例重组表达质粒的双酶切电泳鉴定图。
图3本发明实施例纯化柱洗脱组分的SDS-PAGE分析图。
图4本发明实施例重组表达质粒表达产物的SDS-PAGE分析图。
图5本发明实施例重组表达质粒诱导表达的蛋白印迹分析图。
具体实施例方式 实施例 a.将副溶血弧菌菌种ATCC 17802接种于2216E琼脂平板上，28。C过夜培养，从所 述接种于2216E琼脂平板上的副溶血弧菌菌体中以CTAB法提取DNA。 b.根据已发表的GenBank中副溶血弧菌的鞭毛蛋白基因保守序列设计针对鞭毛蛋白编码序列的引物对，以上述提取的副溶血弧菌DNA为模板进行PCR扩增，引物对的核苷 酸序列为 上游引物PaF : 5' _GCGCGGATCCATGGCGATTAACGTTAATACT_3';
下游引物PaR : 5' -GACTCGAGGCCCAACAAGCTTAGCGCTGC-3'。 PCR反应条件为94t:预变性5分钟后进行94t:变性30秒、58。C复性30秒、72。C 延伸30秒的30个循环的扩增，72t:延伸7分钟后保存于4°C 。 引物对由上海生物工程有限公司合成，划线部分分别为BamH I酶切位点和Xhol 酶切位点。 以副溶血弧菌基因组DNA为模板，用PCR技术获得目的基因。目的基因片断的琼 脂糖凝胶电泳分析图如图1所示，图中1 :Maker DL2000 ;2 :鞭毛蛋白基因的PCR产物；3 : 阴性对照；。 c.PCR电泳回收产物与克隆载体pMD19T连接并转化入大肠杆菌感受态细胞 DH5 a ，在含氨苄青霉素的LB固体培养基上培养通过蓝白斑法筛选阳性克隆，用酶切方法 对阳性克隆进行分析以鉴定重组质粒并选择1131bp大小的条带进行回收。
d.用限制性内切酶BamH I和Xho I分别双酶切c步骤回收产物和表达载体 pET-32a(+) ，37t:作用2小时后，酶切产物用DNAFragment Purification Kit(Takara公 司)回收，PCR酶切产物和载体酶切产物按5 : 1混合，T4DNA连接酶(Takara公司)16°C 过夜连接，37t:过夜培养，提取重组表达质粒pET-FlaA ;用BamH I和Xho I对重组表达质粒双酶切鉴定，鉴定结果如图2所示图中1 : MakerDL2000 ;2 :pET-FlaA质粒;3 :pET-FlaA经BamH I和Xho I双酶切产物。测序结果表 明，所测序列与其他弧菌鞭毛蛋白FlaA编码序列同源性极高，故初步确认所提取的重组表 达质粒为副溶血弧菌鞭毛蛋白FlaA的编码序列。 e.将所提取的重组表达质粒转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)内，培养菌株得 菌液，挑取单菌落接种5ml Amp LB液体培养基过夜培养，取50 yl过夜培养的菌液接种5ml Amp LB液体培养基，37°C 200转/分摇菌2. 5小时，至0D600为0. 4，所摇菌液加诱导剂IPTG 至终浓度为lmM， 37t:摇菌4小时后，回收菌体，即得到菌种。
f.将所收集的菌种进行扩大培养，收集菌体； g.用BugBuste赠Ni-NTA His 廳纖Purification kit (Novagen公司)纯 化融合蛋白，具体操作步骤是用PBS重悬f步骤所得菌体，用超声波破碎细菌并用孔径为 0. 22 ii m的过滤器过滤细菌裂解液，除去其中的大颗粒。在4ml Bindbuffer中加lml 50% 的Ni-NTA His Bind树脂悬液，轻轻混匀，静置，待树脂沉淀后用移液枪吸去上清液取沉淀； 在沉淀中加4ml细菌裂解液，轻轻混匀后用振荡器4°C ， 200rpm振荡1 2h形成混合液；将 混合液移入纯化柱，打开底部的盖子，收集液体；用4ml Wash buffer洗涤，收集洗涤液；用 0.5ml Elute buffer洗脱，收集洗脱液。SDS-PAGE分析各收集液，其结果如图3所示图中 1 :洗涤部分；2 :蛋白Marker ;3 :纯化蛋白部分；洗脱液部分即为纯化的蛋白液。
实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子 克隆实验室手册(New York : Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条 件，或按照制造厂商所建议的条件。
重组副溶血弧菌鞭毛蛋白(FlaA)的鉴定
1. SDS-PAGE电泳 配制12%的分离胶和5%的浓縮胶。将诱导前的样品和诱导后的样品各取20
分别加入20 ill 2XSDS loading buffer混匀，沸水煮5分钟，12000转/分离心10分钟，
留取上清做SDS-PAGE。 120V恒压电泳2h、考马斯亮蓝R250染色2小时、脱色液脱色。 观察，在61.78kDa处有明显条带出现，如图4所示，图中1 :pET32a(+)诱导前产
物；2 :pET32a(+)诱导后表达蛋白；3 :pET-FlaA诱导前产物；4 :蛋白Marker ;5 :pET-FlaA
诱导后表达蛋白。 2. Western Blot鉴定 当SDS-PAGE电泳即将结束时，用蒸馏水洗清石墨板并擦干。从SDS-PAGE胶上切下 需要转膜的部分，切6张滤纸和1张硝酸纤维素膜(NC)。把硝酸纤维素膜浸没于去离子水 的水面中，滤纸浸没于转移缓冲液中，平衡5分钟。按纸、膜、胶、纸的顺序从阳极到阴极摆 放正确，连接电源，注意正负极。根据凝胶面积按0. 65-1. OmA/ci^接通电流，电转移O. 5_2h。 转移结束后，切断电源，从上至下拆卸装置，逐一拆去各层。在NC上作标记。把凝胶取出 进行抗体标记。硝酸纤维素膜放在密封的塑料袋中，内加封闭液和Anti-His Antibody。 (Anti-HisAntibody为1 : 1000稀释)，37。C摇床中温育lh。 37。C摇床中温育lh。取出硝 酸纤维素膜，用PBS漂洗3次，每次10分钟。滤膜再用TBST漂洗10分钟。
硝酸纤维素膜放在密封的塑料袋中，内加封闭液和l : 2000稀释的HRP标记的羊 抗鼠酶标二抗。37t:摇床中温育lh。取出NC膜，用PBS漂洗4次。将NC膜放在底物液中直 到有条带出现( 一般l-5min)，取出NC在水中漂洗一下，放在PBS中。观察结果，在61. 78KDa 处有一条特异性免疫条带。如图5所示，图中1 :蛋白Marker ;2 :诱导前的pET-FlaA作为 阴性对照；3 :诱导后的pET-FlaA，和预期的pET-FlaA大小一致。序列表〈110〉大连水产学院〈120〉重组副溶血弧菌鞭毛蛋白及制备方法〈160>4〈170>Patentin Version 3. 1〈210>1〈211>31〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221>misc_feature〈223〉引物〈400>1gcgcggatcc atggcgatte 3cgtt朋tec t〈210>2
〈211>29〈212>DNA〈213〉人工序列
〈220〉 〈221>misc_feature 〈223〉引物 〈400>2 gactcgaggc ccaacaagct tegcgctgc 29 〈210>3 〈211>1131 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈220〉 〈221>CDS 〈223〉副溶血弧菌鞭毛蛋白FlaA基因 〈400>3atggcgatteacgtteatecteacgtttctgcgatgaccgcacagcgtte ccteaaccac60gcggctg皿gcgtttgtctt120gcg^agatgatgctgc郷tctecagatttcaaaccgtttg皿cgctca皿gccgtggc180ctegacatggcgcg皿cgacggtetctccattgC3C3ggt tgctg皿ggt240gc皿tg皿tgcatcctecagcgtetgcgtgacctetcgct tcaatctgcg300aacggttcteag皿cgtgtegcgatcc皿g皿g皿gteac agcgcte皿c360gacggacteaaccgtetcgctctttcggtggteac皿3ct gctteacggt420acgtecggtectcaatctttccaaatcggtgcggactctggcgaagctgt aatgctttct■3tgggC3gCCtecgttctgatecttcagcaatgggtggteagagctectc 3gc3g皿g皿540ggt腿gatgcatcttggac3gttggtgat皿皿ctgagctte皿3tgag ctecacc皿c600actteccatc皿ggcteagc皿ggCg3Cg3 C3tCg3gC3g660ctegcaactt3C3tC皿Cgggatgtea皿gcgtctgttgg tg皿gacggc720皿gctec皿gtetttgcttctectcag皿3gt腿tggtgaagttgagtt ctctggcaac780ctegctggcgagatcggttttggtgatgcg3皿g3cgteacggtte皿ga catcgacgte8403C皿Cggttgcaggctctcaag皿gctgtegcagttetcg3cggtgcact te皿tcagte■g3C3gCC皿Cgtgcgtcactaggtgctttccagaaccgtttcaaccacgc aatcagcaac960ctegac朋c3cgtteatgca tcteacagccgtette皿ga tectgattec1020C皿C3gCg3tgactea， cg caaattcttcagcaagcaag tecttcaatc1080ctggctcaagcg皿gcagtcaccatctgca gcgctaagcttgttgggcte a1131 〈210>4 〈211>376 〈212>PRT 〈213>人工序列 〈220〉 〈221>CDS 〈223〉副溶血弧菌鞭毛蛋白FlaA0105]〈400>4
0106]MetAlalieAsnValAsnThrAsnValSerAlaMetThrAlaGinArg
0107]151015
0108]TyrLeuAsnHisAlaAlaGluGlyGinGinLysSerMetGluArgLeu
0109]202530
0110] 0111 ]SerSerGly 35TyrLyslieAsnSer 40AlaLysAspAspAla 45AlaGlyLeu
0112]GinlieSerAsnArgLeuAsnAlaGinSerArgGlyLeuAspMetAla
0113]505560
0114]ValLysAsnAlaAsnAspGlylieSerlieAlaGinValAlaGluGly
0115]65707580
0116]AlaMetAsnGluSerThrAsnlieLeuGinArgMetArgAspLeuSer
0117]859095
0118]LeuGinSerAlaAsnGlySerAsnSerLysAlaGluArgValAlalie
0119]100105110
0120]GinGluGluValThrAlaLeuAsnAspGlyLeuAsnArglieAlaGlu
0121]115120125
0122]ThrThrSerPheGlyGlyAsnLysLeuLeuAsnGlyThrTyrGlyThr
0123]130135140
0124]GinSerPheGinlieGlyAlaAspSerGlyGluAlaValMetLeuSer
0125]145150155160
0126]MetGlySerLeuArgSerAspThrSerAlaMetGlyGlyLysSerTyr
0127]165170175
0128]SerAlaGluGluGlyLysAspAlaSerTrpThrValGlyAspLysThr
0129]180185190
0130]GluLeuLysMetSerTyrThrAsnLysGinGlyGluGluLysGluLeu
0131]195200205
0132]ThrlieLysAlaLysGinGlyAspAsplieGluGinLeuAlaThrTyr
0133]210215220
0134]lieAsnGlyGinSerGluAspValLysAlaSerValGlyGluAspGly
0135]225230235240
0136]LysLeuGinValPheAlaSerThrGinLysValAsnGlyGluValGlu
0137]245250255
0138]PheSerGlyAsnLeuAlaGlyGlulieGlyPheGlyAspAlaLysAsp
0139]260265270
0140]ValThrValLysAsplieAspValThrThrValAlaGlySerGinGlu
0141]275280285
0142]AlaValAlaVallieAspGlyAlaLeuLysSerValAspSerGinArg
0143]290295300GlyAlaPheGinAsnArgPheAsnHisAlalieSerAsn305310315320LeuAspAsnlieAsnGluAsnValAsnAlaSerAsnSerArglieLys325330335AspThrAspTyrAlaLysGluThrThrAlaMetThrLysSerGinlie340345350LeuGinGinAlaSerThrSerlieLeuAlaGinAlaLysGinSerPro355360365SerAlaAlaLeuSerLeuLeuGly37037权利要求
一种重组副溶血弧菌鞭毛蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO4。
2. —种如权利要求1所述重组副溶血弧菌鞭毛蛋白的制备方法，其特征在于按如下步 骤进行a. 培养副溶血弧菌菌种并提取DNA ;b. 设计副溶血弧菌鞭毛蛋白编码序列的引物对，以上述提取的副溶血弧菌DNA为模板 进行PCR扩增；c. PCR电泳回收产物与克隆载体pMD19T连接并转化入大肠杆菌感受态细胞DH5 a ，在 含氨苄青霉素的LB固体培养基上培养通过蓝白斑法筛选阳性克隆，选择1131bp大小的条 带进行回收；d. 用限制性内切酶BamH I和Xho I分别双酶切c步骤回收产物和表达载体 pET-32a(+)，将得到的两种目的基因片断用DNA连接酶连接，转化入大肠杆菌感受态细胞 DH5 a进行培养并筛选提取重组表达质粒；e. 将所提取的重组表达质粒转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)内，培养菌株得菌 液，用IPTG诱导菌液，收集菌种；f. 将所收集的菌种进行扩大培养，收集菌体；g. 将菌体破碎、裂解、纯化，收集纯化液。
3. 根据权利要求2所述的重组副溶血弧菌鞭毛蛋白的制备方法，其特征在于所述引物 对的核苷酸序列为上游引物PaF:5' -GCGCGGATCCATGGCGATTAACGTTAATACT-3'; 下游引物PaR :5' -GACTCGAGGCCCAACAAGCTTAGCGCTGC-3'。所述PCR反应条件为94t:预变性5分钟后进行94t:变性30秒、58"C复性30秒、72"C 延伸30秒的30个循环的扩增，72t:延伸7分钟后保存于4°C 。
4. 根据权利要求3所述的重组副溶血弧菌鞭毛蛋白的制备方法，其特征在于所述e 步骤是将所提取的重组表达质粒转化入大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3)后，挑取单菌落接种 于5ml Amp LB液体培养基过夜培养，再取50 yl过夜培养的菌液接种5ml Amp LB液体培 养基，37°C 、200转/分摇菌2. 5小时，至菌液的0D600为0. 4，向菌液中加诱导剂IPTG至终 浓度为lmM，37t:摇菌4小时后，回收菌体。
5. 根据权利要求4所述的重组副溶血弧菌鞭毛蛋白的制备方法，其特征在于所述g 步骤是用PBS重悬f步骤所得菌体，用超声波破碎细菌并用孔径为0. 22 ii m的过滤器过滤 细菌裂解液，在4ml Bind buffer中加lml 50X的Ni-NTA HisBind树脂悬液，轻轻混匀，静 置，待树脂沉淀后取沉淀；在沉淀中加4ml细菌裂解液，轻轻混匀后用振荡器4°C ， 200rpm振 荡1 2h形成混合液；将混合液移入纯化柱，用0. 5ml Elute buffer洗脱，收集洗脱液。
全文摘要
本发明公开一种重组副溶血弧菌鞭毛蛋白及制备方法，根据副溶血弧菌鞭毛蛋白的DNA序列，设计引物对并以CTAB法提取的副溶血弧菌DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物与pMD19T载体连接得重组质粒，经双酶切后再与表达载体pET-32a(+)连接，获重组表达质粒并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中；通过IPTG诱导实现了重组蛋白的可溶性表达。因在表达过程中不产生包涵体，该表达质粒表达的融合蛋白带有组氨酸标签，方便了样品的鉴定和纯化，避免了样品的变性和复性，不但操作简单，降低了制作成本，更主要的是蛋白结构不受破坏；重组蛋白纯度好、得率高且不易降解，适应于工业化生产，为进一步研究副溶血弧菌鞭毛蛋白的功能奠定基础。
文档编号C12P21/02GK101698675SQ20091021966
公开日2010年4月28日 申请日期2009年11月5日 优先权日2009年11月5日
发明者仇雪梅, 王秀利, 袁野, 郭设平 申请人:大连水产学院