专利名称：一种基于卵黄抗体的免疫磁性微粒、其制备方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基于卵黄抗体的免疫磁性微粒、其制备方法及其用途。
背景技术：
在现有技术中对生物大分子特异性亲和分离最常用的方法是以琼脂糖或树脂为 载体，以哺乳动物来源的抗体IgG为亲和配基的免疫亲和层析法。然而这种层析方法有两 方面的限制因素一是以层析柱的形式进行生物大分子分离，需要复杂的前处理过程，且需 要较大反应体积，对样品稀释度大，不适合处理小体积样品；二是哺乳动物来源的抗体特异 性不高，并且会与类风湿因子等结合，导致分离特异性不好。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于卵黄抗体的免疫磁性微粒、其制备方法及其用 途，解决了生物大分子亲和分离操作复杂，分离特异性低、效率低的技术问题。本发明的技术解决方案是一种基于卵黄抗体的免疫磁性微粒，该免疫磁性微粒由磁性微粒和经共价反应或 非共价作用结合在磁性微粒表面的卵黄抗体组成；所述磁性微粒为具有与蛋白质/抗体有 较强结合能力的金磁微粒，或者末端具有与蛋白质反应的功能基团的磁性微粒；所述基团 包括具有反应活性的氨基、羧基、巯基以及苯异硫氰酸根；所述磁性微粒具有超顺磁性的微 粒；粒径为1ηπι-200μπι。所述卵黄抗体为具有免疫亲和反应活性，可以与待分离生物大分 子、细胞特异性结合的生物分子；所述待分离生物大分子指蛋白，核酸，及其复合物以及细 胞等。一种基于卵黄抗体的免疫磁性微粒的制备方法，该方法包括以下步骤1)磁性微粒的平衡用偶联缓冲液平衡，使磁性微粒处于适宜反应的缓冲液中；所述磁性微粒的平衡步骤包括a)将偶联缓冲液放入离心管，使磁性微粒分散于偶联缓冲液中；b)用磁性分离器进行磁性分离，弃上清；c)对步骤a)、b)重复一次或多次，以三次为宜；2)平衡后的磁性微粒与卵黄抗体的结合平衡后的磁性微粒与卵黄抗体的结合包括以下条件a)卵黄抗体以偶联缓冲液配制，用偶联缓冲液调节反应体积，使磁性微粒和卵黄 抗体处于合适的反应浓度，其体积为使所取磁性微粒浓度为0. 5-3mg/mL的体积；卵黄抗体 的浓度为磁粒浓度的0. 05-5倍。b)采用恒温振荡器进行振荡反应，温度为4°C至37°C ；反应时间为20-30分钟；3)获得的免疫磁性微粒的清洗除去非特异性吸附在免疫磁性微粒表面的卵黄 抗体；所述对免疫磁性微粒的清洗包括以下步骤a)、将清洗缓冲液放入离心管，使磁性微粒分散于清洗缓冲液中；
b)、用磁性分离器进行磁性分离，弃上清；c)、对步骤a)、b)重复一次或多次，以三次为宜。上述方法还包括对免疫磁性微粒的封闭；所述免疫磁性微粒的封闭符合以下条 件1)加入封闭剂，其体积为使免疫磁性微粒浓度为0. 5-2mg/mL的体积，振荡反应；2)具 体可采用恒温振荡器，温度为4°C至37°C ；3)反应时间为20-120分钟。上述方法还包括对免疫磁性微粒的清洗，即除去非特异性吸附在免疫磁性微粒表 面的卵黄抗体或封闭剂。上述方法还包括对免疫磁性微粒的保存步骤即将免疫磁性微粒悬于保存含 0. 叠氮钠和0. 1% BSA的PBS缓冲液中，在温度为2 8°C中保存备用。上述在步骤1)和2)中的偶联缓冲液使用0.02-0. 2M三羟甲基氨基甲烷-盐酸 缓冲液(Tris-HCl)，pH = 7. 0-7. 6 ；或 0. 02-0. 2M 磷酸缓冲液(PBS)，pH = 7. 0-7. 6 ；或 0. 02-0. 2M的N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸缓冲液，pH = 7. 0-7. 6 ；所述偶联缓冲液中加 入0. 1-1. OM的NaCl的为宜。上述步骤3)中的清洗缓冲液为含0.05% (ν/ν)吐温20 (Tween 20)的偶联缓冲 液，或含有IOmM乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)和0. 15M的NaCl的0. 02M三羟甲基氨基甲 烷-盐酸缓冲液，PH = 7. 0-7. 6 ；所述清洗所用清洗缓冲液体积以使磁性微粒的浓度为 0. 5-4mg/mL的体积为宜。上述封闭剂采用含1-10%的脱脂奶粉，或1-5%牛血清白蛋白BSA，或1-5%赖氨 酸，或0.2-2.0%的明胶，或1-5%的聚乙二醇的偶联缓冲液.以含5%脱脂奶粉的偶联缓冲 液为宜。一种基于卵黄抗体免疫磁性微粒的用途所述基于卵黄抗体免疫磁性微粒用于从 血浆、腹水、组织培养上清等样本中蛋白的分离；所述免疫磁性微粒用于从血浆、腹水、组织 培养上清等样本中核酸的分离；所述免疫磁性微粒用于免疫沉淀试验；所述免疫磁性微粒 用于细胞分选。上述免疫磁性微粒与从血浆、腹水、组织培养上清的反应应符合以下条件a 样品以反应缓冲液配制，其体积为使所取磁性微粒浓度为0. 5-20mg/mL的体 积，以lOmg/mL为宜；b 采用恒温振荡器进行振荡反应的温度为4°C至37°C，以37°C为宜；反应时间为 20-30分钟，以20分钟为宜；c 反应缓冲液使用0. 02-0. 2M三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-HCl)，pH = 6. 0-8. 5 ；或 0. 02-0. 2M 磷酸缓冲液(PBS)，pH = 6. 0-8. 5 ；或 0. 02-0. 2M 的 N-2-羟乙基哌 嗪-N-2-乙磺酸缓冲液，pH = 6. 0-8. 5 ；所述反应缓冲液中加入0. 1-1. OM的NaCl的为宜。上述免疫磁性微粒的再生符合以下条件a 以再生缓冲液再生反应后免疫磁性微粒，再生缓冲液体积为使磁性微粒浓度为 0. 5-20mg/mL 的体积，以 10mg/mL 为宜；b 采用恒温振荡器进行振荡反应的温度为4°C至37°C，以37°C为宜；反应时间为 1-10分钟，以3分钟为宜;c 再生缓冲液使用0. 02-2M尿素，0. 01-0. 05M的十二烷基磺酸钠或0. 01-0. 05M, PH2. 5-4. 5 的 Gly-HCl 缓冲液。
本发明的优点是1、生物大分子分离效率高。因为磁性微粒具有较大的比表面积，所以具有固定化 容量高的优点。比如金磁微粒对卵黄抗体的固定，Img的金磁微粒能够固定0. 3mg以上的卵 黄抗体。由于磁性微粒对生物分子的固定化容量很高，使得利用此种固定了目的生物大分 子卵黄抗体的磁性微粒对目的生物大分子、细胞的分离效率很高。2、抗体特异性强，生物大分子分离效果更好。由于禽类与哺乳动物亲缘关系较远， 生成的抗体特异性较哺乳动物更强。而且，禽类的IgY不激活补体，不与哺乳动物的类风湿 因子结合，也不与哺乳动物球蛋白发生血清学交叉反应，不与葡萄球菌A蛋白、链球菌G蛋 白等反应，避免在分离过程中非特异性生物分子的损失。3、分离过程便捷。本发明方法不需要对生物样品进行前处理，直接对生物样品进 行适度倍数的稀释即可进行相应生物大分子、细胞的分离步骤；而且本发明方法不需要对 卵黄抗体所用的载体基质即磁性微粒进行使用前的活化处理及离心操作，可直接使用，操 作方便快捷，缩短了去除所需时间，也无需使用昂贵的实验仪器。亦可根据实验需要调整反 应体积，适合于对小体积生物样品的处理。4、以磁性微粒作为载体，卵黄抗体(IgY)取代哺乳动物抗体作为亲和配基，这种 亲和方法同时结合了磁性微粒和卵黄抗体的优点，可以广泛应用于在生物大分子(如蛋 白、核酸)的分离领域。并且以磁性微粒作为载体的亲和分离方法还可扩大到在细胞分离 领域的应用。
图1为金磁微粒对血清中白蛋白，抗体分离后样品所做的SDS-PAGE考马斯亮蓝染 色电泳图，其中泳道1为白蛋白标准品的电泳图，泳道2和3为血清样品分离去除白蛋白 后的电泳图，泳道4为血清样品的电泳图，泳道5为抗体标准样品的电泳图，泳道6和7为 血清样品分离去除抗体后的电泳图泳道，8为蛋白分子量标准(14 97KD)电泳图。
具体实施例方式下面以具体实施例来对本发明进行详细说明，但并不是对本发明的具体限制。实施例1 是基于抗人抗体的卵黄抗体(IgY)和金磁微粒的免疫磁性微粒的制备 过程，及免疫磁性微粒应用于从血清/浆等生物样品中分离去除抗体的具体过程1]免疫磁性微粒的制备a.抗人抗体的卵黄抗体在金磁微粒表面的固定取Iml金磁微粒悬液加入到一个 2ml容量的离心管中，轻摇重悬。置于磁性分离器上，磁性分离，弃上清。加入Iml偶联缓 冲液(0. 2M的pH8. 0的Tris-HCl缓冲液)，轻摇重悬。置于磁性分离器上，磁性分离，弃上 清。重复操作一次。将卵黄抗体配置成浓度为lmg/ml的溶液，取100 200 μ 1加入金磁 微粒中，在摇床中37°C，180r/min反应30min。反应完毕，磁性分离，弃上清。加入Iml清洗 缓冲液(含0. 1 %吐温的pH6. 0的PBS缓冲液)，轻摇重悬磁粒。磁性分离，弃上清。b.金磁微粒的封闭在上一步的磁粒中加入Iml的封闭剂(含牛血清白蛋白 和赖氨酸的偶联缓冲液)，在摇床中37°C，180r/min反应池。用2ml的上述清洗缓冲 液清洗3次，最后悬于Iml保存缓冲液(含0. 1 %叠氮钠和0. 1 % BSA的PBS缓冲液)中，2 8°C保存备用。2]血清/浆等生物样品中抗体的分离去除a.血清/浆等生物样品的稀释取5μ1血清/浆等生物样品，用去除缓中液 (pH6. 0的1 XPBS缓冲液)稀释至50 μ 1。b.将1]步骤中的金磁微粒磁性分离，弃上清。加入Iml的去除缓冲液(pH6. 0的 IXPBS缓冲液)，轻摇重悬金磁微粒，磁性分离，弃上清。加入a步骤中的血清/浆等生物 样品，在摇床中37°C，180r/min反应lOmin。抗体就被结合到免疫磁性微粒上，再经磁场中 磁性分离，从而实现抗体从血清/浆等生物样品中的分离去除。移取磁性分离后的上清，即 为分离去除了抗体的样品。3]金磁微粒的再生和保存加入Iml再生缓冲液(0. 05M，pH3. 5的Gly-HCl缓冲 液)到上步骤中的金磁微粒中，在摇床中37°C，180r/min反应2min，将吸附到金磁微粒上的 抗体从金磁微粒上洗脱下来，磁性分离，弃上清。加入Iml的上述清洗缓冲液，轻摇重悬金 磁微粒，磁性分离，上清即为分离得到的人抗体。加入Iml的上述保存缓冲液2 8°C保存实施例2是基于抗人血清白蛋白的IgY(卵黄抗体)和金磁微粒的免疫磁性微粒 的制备过程，及这种免疫磁性微粒应用于从血清/浆等生物样品中分离除去人血清白蛋白 的过程，具体如下1]免疫磁性微粒的制备a.抗人血清白蛋白卵黄抗体在金磁微粒表面的固定取金磁微粒到一个5ml 容量的离心管中，轻摇重悬。置于磁性分离器上，磁性分离，弃上清。加入細1偶联缓冲液， 轻摇重悬。置于磁性分离器上，磁性分离，弃上清。重复操作一次。将抗人血清白蛋白的卵 黄抗体配置成浓度为lmg/ml的溶液，取1. 5ml加入金磁微粒中，在摇床中37°C，180r/min 反应30min。反应完毕，磁性分离，弃上清。加入細1清洗缓冲液，轻摇重悬磁粒。磁性分 离，弃上清。b.金磁微粒的封闭在上一步的磁粒中加入的封闭剂，在摇床中37°C，180r/ min反应池。用細1的清洗缓冲液清洗3次，最后悬于2ml保存缓冲液中，2 8°C保存备用。2]血清/浆等生物样品中白蛋白的分离去除a.血清/浆等生物样品稀释取1 μ 1血清/浆等生物样品，用去除缓冲液稀释至 100 μ 1。b.将1]步骤中的金磁微粒磁性分离，弃上清。加入的去除缓冲液，轻摇重悬 金磁微粒，磁性分离，弃上清。加入a步骤中的血清/浆等生物样品，在摇床中37°C，180r/ min反应30min。白蛋白就被结合到免疫磁性微粒上，再经磁场中磁性分离，从而实现白蛋 白从血清/浆等生物样品中的分离去除。移取磁性分离后的上清，即为分离去除了白蛋白 的样品。3]金磁微粒的再生和保存加入3ml再生缓冲液(0. 05M，pH3. 5的Gly-HCl缓冲 液)到上步骤金磁微粒中，在摇床中37°C，180r/min反应2min，将吸附到金磁微粒上的白 蛋白从金磁微粒上洗脱下来，磁性分离，上清即为分离得到的白蛋白。加入細1的清洗缓冲 液，轻摇重悬金磁微粒，磁性分离，弃上清。加入2ml的保存缓冲液2 8°C保存备用。
从附图可以看出，泳道2和泳道3中，已无明显的白蛋白条带出现，说明白蛋白分 离去除的较为彻底。从附图可以看出，泳道5和泳道6中已无明显的抗体条带出现，说明抗 体分离去除的较为彻底。本申请以磁性微粒为载体，某生物大分子的特异性卵黄抗体为亲和配基，制备出 一种免疫磁性微粒。这种免疫磁性微粒可用于从生物样品中进行某生物大分子及细胞的特 异性亲和分离。磁性微粒是指粒径在lnm-200 μ m，具有超顺磁性和高比表面积的复合微粒。 卵黄抗体是指从鸡，鸭等禽类动物卵黄中提取出的抗体。生物大分子指蛋白，核酸，及其免 疫沉淀复合物。本发明将生物大分子的特异性卵黄抗体与磁性微粒共同反应一段时间后，制备出 具有特异性的免疫磁性微粒。将稀释好的生物样品与免疫磁性微粒共同反应一段时间后， 即可实现生物大分子亲和吸附到免疫磁性微粒表面。经磁性分离后，即可实现将生物大分 子、细胞从生物样品中分离出去的目的。
权利要求
1.一种基于卵黄抗体的免疫磁性微粒，其特征在于该免疫磁性微粒由磁性微粒和经 共价反应或非共价作用结合在磁性微粒表面的卵黄抗体组成；所述磁性微粒为具有与蛋白 质/抗体较强亲和结合的金磁微粒，或者末端具有与蛋白质反应功能基团的磁性微粒；所 述基团包括具有反应活性的氨基、羧基、巯基以及苯异硫氰酸根；所述磁性微粒具有超顺磁 性的微粒；粒径为lnm-200ym ；所述卵黄抗体为具有免疫亲和反应活性，可以及与待分离 生物大分子、细胞特异性结合的生物分子；所述待分离生物大分子指蛋白，核酸，及其复合 物。
2.一种基于卵黄抗体的免疫磁性微粒的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤1)磁性微粒的平衡用偶联缓冲液平衡，使磁性微粒处于适宜反应的缓冲液中； 所述磁性微粒的平衡步骤包括a)将偶联缓冲液放入离心管，使磁性微粒分散于偶联缓冲液中；b)用磁性分离器进行磁性分离，弃上清；c)对步骤a)、b)重复一次或多次，以三次为宜；2)平衡后的磁性微粒与卵黄抗体的结合平衡后的磁性微粒与卵黄抗体的结合包括以下条件a)卵黄抗体以偶联缓冲液配制，用偶联缓冲液调节反应体积，使磁性微粒和卵黄抗体 处于合适的反应浓度，其体积为使所取磁性微粒浓度为0. 5-3mg/mL的体积，以1. 5mg/mL为 宜；其浓度为磁粒浓度的0. 05-5倍，以1倍为宜；b)采用恒温振荡器进行振荡反应，温度为4°C至37°C，以37°C为宜；反应时间为20-30 分钟，以20分钟为宜；3)获得的免疫磁性微粒的清洗除去非特异性吸附在免疫磁性微粒表面的卵黄抗体； 所述对免疫磁性微粒的清洗包括以下步骤a)将清洗缓冲液放入离心管，使磁性微粒分散于清洗缓冲液中；b)用磁性分离器进行磁性分离，弃上清；c)对步骤a)、b)重复一次或多次，以三次为宜。
3.根据权利要求2所述的基于卵黄抗体的免疫磁性微粒的制备方法，其特征在于所 述方法还包括对免疫磁性微粒的封闭；所述免疫磁性微粒的封闭符合以下条件1)加入封闭剂，其体积为使免疫磁性微粒浓度为0.5-2mg/mL的体积，振荡反应；2)具体可采用恒温振荡器，温度为4°C至37°C，以37°C为宜；3)反应时间为20-120分钟，以120分钟为宜。
4.根据权利要求3所述的基于卵黄抗体的免疫磁性微粒的制备方法，其特征在于所 述方法还包括对免疫磁性微粒的清洗，即除去非特异性吸附在免疫磁性微粒表面的卵黄抗 体或封闭剂。
5.根据权利要求4所述的基于卵黄抗体的免疫磁性微粒的制备方法，其特征在于所 述方法还包括对免疫磁性微粒的保存步骤即将免疫磁性微粒悬于保存含0. 叠氮钠和 0. 1 % BSA的PBS缓冲液中，在温度为2 8°C中保存备用。
6.根据权利要求2或5所述的基于卵黄抗体的免疫磁性微粒的制备方法，其特征在于所述在步骤1)和幻中的偶联缓冲液使用0. 02-0. 2M三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液 (Tris-HCl)，pH = 7. 0-7. 6 ；或 0. 02-0. 2M 磷酸缓冲液(PBS)，pH = 7. 0-7. 6 ；或 0. 02-0. 2M 的N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸缓冲液，pH = 7. 0-7. 6 ；所述偶联缓冲液中加入0. 1-1. OM m NaCl的为宜。
7.根据权利要求6所述的基于卵黄抗体的免疫磁性微粒的制备方法，其特征在于所述步骤3)中的清洗缓冲液为含0.05% (ν/ν)吐温20(Tween 20)的偶联缓冲液，或 含有IOmM乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)和0. 15M的NaCl的0. 02M三羟甲基氨基甲烷-盐 酸缓冲液，PH = 7. 0-7. 6 ；所述清洗所用清洗缓冲液体积以使磁性微粒的浓度为0. 5-4mg/ mL的体积为宜。
8.根据权利要求7所述的基于卵黄抗体的免疫磁性微粒的制备方法，其特征在于所述封闭剂采用含1-10%的脱脂奶粉，以含5%脱脂奶粉的偶联缓冲液为宜；或1-5%牛血清白蛋白BSA，或1-5%赖氨酸，或0. 2-2.0%的明胶，或1-5%的聚乙二醇的偶联缓冲 液。
9.一种权利要求1所述的基于卵黄抗体免疫磁性微粒的用途其特征在于所述基于卵黄抗体免疫磁性微粒用于从血浆、腹水、组织培养上清等样本中蛋白的分 离；所述免疫磁性微粒用于从血浆、腹水、组织培养上清等样本中核酸的分离；所述免疫磁 性微粒用于免疫沉淀试验；所述免疫磁性微粒用于细胞分选。
10.一种权利要求1所述的基于卵黄抗体免疫磁性微粒的用途其特征在于1)所述与从血浆、腹水、组织培养上清的反应符合以下条件a 样品以反应缓冲液配制，其体积为使所取磁性微粒浓度为0. 5-20mg/mL的体积，以 10mg/mL 为宜；b 采用恒温振荡器进行振荡反应的温度为4°C至37°C，以37°C为宜；反应时间为 20-30分钟，以20分钟为宜；c 反应缓冲液使用0. 02-0. 2M三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-HCl)，pH = 6. 0-8. 5 ；或 0. 02-0. 2M 磷酸缓冲液(PBS)，pH = 6. 0-8. 5 ；或 0. 02-0. 2M 的 N-2-羟乙基哌 嗪-N-2-乙磺酸缓冲液，pH = 6. 0-8. 5 ；所述反应缓冲液中加入0. 1-1. OM的NaCl的为宜；2).所述免疫磁性微粒上的再生符合以下条件a 以再生缓冲液再生反应后免疫磁性微粒，再生缓冲液体积为使磁性微粒浓度为 0. 5-20mg/mL 的体积，以 10mg/mL 为宜；b 采用恒温振荡器进行振荡反应的温度为4°C至37°C，以37°C为宜；反应时间为1_10 分钟，以3分钟为宜；c 洗脱缓冲液使用0. 02-2M尿素，0.01-0. 05M的十二烷基磺酸钠或0. 01-0. 05M, ρΗ2· 5-4. 5 的 Gly-HCl 缓冲液；以 0. 05Μ, ρΗ3· 5 的 Gly-HCl 缓冲液为宜。
全文摘要
本发明涉及基于卵黄抗体(IgY)和磁性微粒的免疫磁性微粒的制备方法及其应用。卵黄抗体(IgY)是指从禽类，如鸡、鸭、鹅的卵黄中分离得到的抗体。磁性微粒是指粒径在1nm-200μm，具有超顺磁性和高比表面积的磁性复合微粒。免疫磁性微粒的应用包括生物样本中蛋白、核酸等生物大分子分离，细胞的分离，免疫沉淀试验。本发明方法是通过将卵黄抗体(IgY)固定到磁性微粒表面制备出一种基于卵黄抗体(IgY)免疫磁性微粒。利用生物大分子与其相应卵黄抗体的亲和作用以及免疫磁性微粒的超顺磁性从而达到在磁场中将生物大分子、细胞从生物样品中分离的目的。
文档编号C12N5/00GK102086225SQ20091021928
公开日2011年6月8日 申请日期2009年12月3日 优先权日2009年12月3日
发明者崔亚丽, 胡佳, 陈超 申请人:陕西北美基因股份有限公司