本发明属于转基因检测技术领域，具体涉及一种转基因小麦和棉花的检测方法。
背景技术：
自1983年世界首例转基因植物问世以来，商品化转基因植物逐渐增多，由此衍生出来的转基因食品也越来越多。转基因食品是由转基因生物生产和加工形成的。从人体安全方面来看，基因的某种转移也许会产生新的毒素和过敏原，引起意想不到的中毒或过敏反应，这种食品某些营养成分或营养质量可能产生变化，使人体出现某种病症，而且疾病可能有很长时间的潜伏期，且毒性物质对人体的危害也需要一个积累的过程才能实现。因此其安全性问题引起了全世界的普遍关注。我国为此也制定了《农业转基因生物安全管理条例》，并考虑对转基因食品进行标签标识。对转基因食品贴示标签，区分转基因与非转基因食品，或对食品中转基因含量的多少加以限制，这都需要有准确、有效的检测方法。随着转基因产品的不断市场化，建立有效的检测方法，是进一步加强我国在转基因食品监管方面的重要技术保障。常用的转基因检测方法主要有两大类：一类是蛋白质水平的检测，如酶联免疫法(ELISA法)和胶体金试纸法。另一类是核酸水平的检测，如PCR定性方法和实时荧光定量PCR方法。随着转基因新品种的研究和不断问世，仍需要深入、扩大开展转基因食品检测技术的研究，建立新型、实用、高通量的检测方法。特别是在对转基因背景一无所知的情况下，需要提高对各种候选待检目标逐一筛查检测的工作效率。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种转基因小麦和棉花的检测方法，即使用引物探针组合物来快速检测小麦、棉花中是否含有外源基因，从而弥补现有技术的不足。
本发明首先提供一种用于小麦和棉花转基因检测的引物探针组合物，其中包含有:
检测内源Wx012基因的引物和探针，其序列分别为SEQ ID NO:1-3；
检测外源bar基因的引物和探针，序列分别为SEQ ID NO:4-6；
检测外源nos基因的引物和探针，序列为SEQ ID NO:7-9；
检测内源Acp1基因的引物和探针，其序列分别为SEQ ID NO:10-12；
检测外源Mon531基因的引物和探针，其序列分别为SEQ ID NO:13-15；
检测外源Mon15985基因的引物和探针，其序列分别为SEQ ID NO:16-18；
上述所述各基因特异探针的5′端均修饰有报告基团，3′端均修饰有淬灭基团。
报告基团包含有FAM、FITC、JOE、CY3、CY5、ROX，淬灭基团包含有TAMRA，BHQ、Eclipse等。
上述的引物探针组合物还可以用来制备小麦和棉花转基因检测的制品。
本发明再一个方面提供了一种鉴别小麦、棉花转基因的检测方法，包括如下的步骤：
1)提取待检样本的基因组DNA，
2)将步骤1)提取的基因组DNA加入到鉴别小麦、棉花转基因检测的反应体系中，利用六重实时荧光定量PCR法检测，判读是否检出转基因成分；反应体系中添加了上述的引物和探针组；
3)收集PCR扩增过程中的荧光信号，通过荧光信号鉴别样本中是否含有外源基因；
上述步骤2)的反应条件如下：95℃3min，1个循环。95℃15s，60℃60s，40个循环。
上述方法中，按以下方式判读是否检出转基因成分：
1)测试样品中内源基因检测Ct值小于等于36，外源基因检测Ct值大于或等于40，判断该样品不含所检外源基因。
2)测试样品中内源基因检测Ct值小于等于36，外源基因检测Ct值小于或等于40，判断该样品含所检外源基因。
3)测试样品中内源基因检测Ct值在36～40之间，应调整模板浓度，重做实时荧光PCR，再次扩增后的外源基因Ct值仍小于40，且阴性对照，阳性对照和空白对照结果正常则可判定为该样品检出所检外源基因。若再次扩增后的外源基因Ct值仍大于或等于40，且阴性对照，阳性对照和空白对照结果正常则可判定为该样品未检出所检外源基因。
本发明采用实时荧光PCR技术，可对DNA分子进行标记，可实现对小麦，棉花所检测基因的快速准确检测。在引物探针的设计方面，本实验对所设计六对的引物及其引物之间进行了以下分析：引物间的干扰，发卡结构和二聚体。并通过NCBI的BLAST功能对其特异性进行初步鉴定。经筛选，排除了引物自身及引物之间存在互补序列、扩增产物的单链能形成二级结构的引物，最终筛选出可满足在同一反应体系中反应的六对引物探针组合。本发明的方法通过对其灵敏度的检测，荧光定量DNA模板用量为0.01ng时，各基因的特异性探针仍有扩增曲线，可实现灵敏度为0.01ng。通过重复性试验的验证，本发明对每个样本的3次独立重复实验的Ct值的标准方差均小于0.5，说明检测结果的重复性好，检测的稳定性高。
具体实施方式
申请人分析了小麦、棉花中被检测基因的序列差异，并分析引物间的干扰，发卡结构和二聚体；筛选优化了相应的引物和探针，从而促成了本发明。
下述实施例中，所用实验材料，试剂与仪器如下：
(1)实验材料
未转基因棉花、转Mon531基因棉花、转Mon15985基因棉花、未转基因小麦、转bar基因小麦、转nos基因小麦、未转基因大豆、未转基因玉米、白菜、菠菜、猪肉、羊肉、鸭肉、鱼肉、兔肉、驴肉、鸡肉、鹅肉。
(2)所用试剂
动物组织基因组DNA提取试剂盒(天根牌)、植物基因组DNA提取试剂盒(天根牌)、TAKARA的Premix Ex Taq、热启动酶、dNTP、Mg2+等PCR反应试剂。引物与探针得合成以及DNA测序均由生工生物工程(大连)有限公司完成。
(3)实验仪器
ABI ViiA7荧光定量PCR仪、高速离心机、半自动核酸提取仪、金属浴、超微量分光光度计。
实施例1：设计引物探针
分别针对小麦内源Wx012基因、外源bar基因、nos基因、棉花内源Acp1基因、外源Mon531基因、外源Mon15985基因，利用PrimerExpress3.0软件设计，RTi-PCR引物和Taq man探针序列，分别使用荧光基团FAM,FITC,JOE,CY3，CY5，ROX。作为探针的发光基团，以对应的荧光定量PCR仪的不同波长段用于检测。对所设计的引物进行以下分析：引物间的干扰，发卡结构和二聚体。并通过NCBI的BLAST功能对其特异性进行初步鉴定。经筛选，排除了引物自身及引物之间存在互补序列、扩增产物的单链能形成二级结构的引物，选留如表1所示的引物及探针序列。
引物与探针序列如下表：
单重实时荧光定量PCR采用25μL反应体系：0.25μL(5U/μL)Taq酶,2.5μL 10×PCR Buffer，2μL dNTPs混合物，2.5μLMgcl2(25mM)，正反向引物各1μL，探针2μL，模板DNA2μL(DNA浓度为50ng/μL)，加双蒸水补足至25μL。所加引物终浓度均为0.2pmol/μL。
实施例2：检测方法
采用本发明的引物探针及多重实时荧光定量PCR检测方法检测小麦和棉花的转基因情况的方法步骤如下：
1、DNA提取：
取待测样本50g液氮充分研磨，从中取50mg进行DNA提取，可用基因组DNA提取试剂盒进行提取，用超微量分光光度计检测所提DNA的浓度和纯度，要求OD值于1.7-1.8之间。
2、待测样品DNA的实时荧光定量PCR扩增
(1)单重实时荧光定量PCR体系的建立及条件优化
用TAKARA的Premix Ex Taq试剂作为反应体系，选定不同的退火温度：
PCR反应条件一为：95℃预变性3min，95℃变性15s，55℃退火后延伸1min。
PCR反应条件二为：95℃预变性3min，95℃变性15s，60℃退火后延伸1min。
PCR反应条件三为：95℃预变性3min，95℃变性15s，62℃退火后延伸1min。
每个反应体系均在退火阶段收集荧光，40个循环。随后对六个基因的引物探针的浓度进行优化，引物浓度优化范围为0.1μmol/L-1.0μmol/L，梯度为0.1μmol/L。探针浓度优化范围为0.1μmol/L-1.0μmol/L，梯度为0.1μmol/L。根据扩增曲线的Ct值和△Rn值来选择适宜的引物和探针浓度组合。
当退火温度为55℃时，六个基因均未出现平滑的扩增曲线，当退火温度为62℃时，nos基因、Mon531基因出现△Rn值偏低，Ct值增大等现象。因此本发明所选的PCR反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性15s，60℃退火后延伸1min，退火阶段收集荧光，40个循环。在这个反应条件下，六个基因均能扩增出Ct值偏低，△Rn值最大且扩增曲线平滑的结果。
经比较Ct值、△Rn值以及扩增曲线。最终确定六个基因的引物探针浓度范围为：Wx012基因的引物浓度为0.2μmol/L-0.6μmol/L，探针浓度为0.2μmol/L-0.3μmol/L；bar基因的引物浓度为0.2μmol/L-0.5μmol/L，探针浓度为0.2μmol/L-0.4μmol/L；nos基因的引物浓度为0.2μmol/L-0.6μmol/L，探针浓度为0.2μmol/L-0.5μmol/L；Acp1基因的引物浓度为0.3μmol/L-0.6μmol/L，探针浓度为0.2μmol/L-0.5μmol/L。Mon531基因的引物浓度为0.2μmol/L-0.5μmol/L，探针浓度为0.3μmol/L-0.6μmol/L。Mon15985基因的引物浓度为0.3μmol/L-0.7μmol/L，探针浓度为0.2μmol/L-0.4μmol/L。PCR反应体系为TAKARA的Premix Ex taq试剂12.5μL，相应量的各个引物探针组合，模板2μL(DNA浓度为50ng/μL)，加无RNA酶水至25μL。
多重实时荧光定量PCR的建立及条件优化
3.1引物、探针浓度的优化
PCR反应体系为TAKARA的Premix Ex Taq试剂12.5μL，以含所转基因的小麦和棉花所提DNA为模板进行多重实时荧光定量PCR实验，各基因组DNA在PCR反应体系中的量均为100ng，相应量的各个引物探针组合，加无RNA酶水至25μL。PCR反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性15s，60℃退火后延伸1min，退火阶段收集荧光，40个循环。在单重实时荧光定量PCR的基础上，取合理的引物探针浓度组合进行优化。先确定wx012基因和bar基因的最佳引物探针浓度，再以此为基础确定nos基因的引物探针最佳浓度，建立三重实时荧光定量PCR反应体系。然后在此三重实时荧光定量PCR的基础上确定acp1基因的最佳引物探针浓度，建立四重实时荧光定量PCR反应体系。在此四重实时荧光定量PCR的基础上确定Mon531基因的最佳引物探针浓度，建立五重实时荧光定量PCR反应体系。最后在此五重实时荧光定量PCR的基础上确定Mon15985基因的最佳引物探针浓度。建立可检测棉花和小麦的六重实时荧光定量PCR反应体系。在优化引物探针的浓度时，选择上下游引物浓度均相同，以Ct值最小、△Rn值最大且扩增曲线平滑、有明显的对数期和平台期时最低引物和探针浓度为标准来进行选取最佳的引物探针浓度。
经实验发现，wx012基因和bar基因在同一反应体系中，可同时扩增。当wx012基因引物浓度为0.5μmol/L，探针浓度为0.3μmol/L，bar基因引物浓度为0.3μmol/L，探针浓度为0.3μmol/L时，两者的Ct值较低且△Rn值较高、有平滑的扩增曲线和明显的对数期和平台期；同时两基因的Ct值和△Rn值差异性最小，扩增效率最接近，因此确定为最佳双重实时荧光定量PCR的引物探针浓度。当加入nos基因的引物探针时，于引物浓度为0.3μmol/L，探针浓度为0.4μmol/L处，三基因在同一反应中△Rn值差异性最小，且wx012基因和bar基因的Ct值和△Rn值及扩增曲线与双重时最相似。当加入acp1基因的引物探针时，于引物浓度为0.3μmol/L，探针浓度为0.4μmol/L处，Ct值较低且△Rn值较高、有平滑的扩增曲线和明显的对数期和平台期；且wx012基因和bar基因和nos基因的Ct值和△Rn值及扩增曲线与三重时最相似。当加入Mon531基因的引物探针时，于引物浓度为0.2μmol/L，探针浓度为0.5μmol/L处，Ct值较低且△Rn值较高、有平滑的扩增曲线和明显的对数期和平台期；且wx012基因、bar基因、nos基因和acp1基因的Ct值和△Rn值及扩增曲线与四重时最相似。当加入Mon15985基因的引物探针时，于引物浓度为0.3μmol/L，探针浓度为0.4μmol/L处，Ct值较低且△Rn值较高、有平滑的扩增曲线和明显的对数期和平台期；且wx012基因、bar基因、nos基因、acp1基因和Mon531基因的Ct值和△Rn值及扩增曲线与五重时最相似。因此本发明最终的引物探针组合为：wx012基因引物浓度为0.5μmol/L，探针浓度为0.3μmol/L；bar基因引物浓度为0.3μmol/L，探针浓度为0.3μmol/L；nos基因的引物浓度为0.3μmol/L，探针浓度为0.4μmol/L；acp1基因的引物浓度为0.3μmol/L，探针浓度为0.4μmol/L；mon531基因的引物浓度为0.2μmol/L，探针浓度为0.5μmol/L；mon15985基因的引物浓度为0.3μmol/L，探针浓度为0.4μmol/L。
3.2Mg2+和TaqDNA聚合酶浓度优化
Mg2+浓度优化范围为1.0mmol/L-9.0mmol/L，梯度为1.0mmol/L，DNA聚合酶优化范围扩大为1.0U-5.0U，梯度为1.0U；实验结果显示当Mg2+浓度为5.0mmol/L，TaqDNA聚合酶浓度为4U时，反应所得结果最优，因此最终得到的五重实时荧光定量PCR反应体系如下表所示：
表3：五重实时荧光定量PCR反应体系
反应条件为95℃预变性1min，95℃变性3s，60℃退火后延伸1min，退火阶段收集荧光，40个循环。所检六种目的基因均有平滑的扩增曲线和明显的对数期和平台期，且Ct值均小于36，说明本反应体系可满足六重实时荧光定量PCR的反应要求。
3、使用ABI ViiA7荧光定量PCR仪分析软件分析扩增结果，为确保检测结果的准确性，同时设置阴性对照实验和阳性对照实验。
3.1阴性对照实验
在将待测DNA样本加入PCR反应体系进行多重实时荧光PCR反应的同时，用双蒸水代替待检样本DNA进行对照实验，作为阴性对照。阴性对照实验结果显示正常时，实验进行正常。阴性对照实验结果显示不正常时，需重新修改实验条件后，再进行实验。
阴性对照试验检测结果判定标准如下表所示：
3.2阳性对照实验
在将待测DNA样本加入PCR反应体系进行多重实时荧光PCR反应的同时，用纯正的棉花DNA，小麦DNA代替待检样本DNA进行对照实验，作为阳性对照。阳性对照实验结果显示正常时，实验进行正常。阳性对照实验结果显示不正常时，需重新修改实验条件后，再进行实验。
阳性对照实验检测结果判定标准如下表所示：
3.3、待测样本检测结果判定：
在同时进行的阴性、阳性对照实验结果正常的情况下，实验结果具有可用性。测试样品中内源基因检测Ct值小于等于36，外源基因检测Ct值大于或等于40，判断该样品不含所检外源基因。测试样品中内源基因检测Ct值小于等于36，外源基因检测Ct值小于或等于40，判断该样品含所检外源基因。测试样品中内源基因检测Ct值在36～40之间，应调整模板浓度，重做实时荧光PCR，再次扩增后的外源基因Ct值仍小于40，且阴性对照，阳性对照和空白对照结果正常则可判定为该样品检出所检外源基因。若再次扩增后的外源基因Ct值仍大于或等于40，且阴性对照，阳性对照和空白对照结果正常则可判定为该样品未检出所检外源基因。
实施例3：为了验证探针引物的性能，进行特异性试验：
分别用植物DNA提取试剂盒分别提取未转基因棉花、转Mon531基因棉花、转Mon15985基因棉花、未转基因小麦、转bar基因小麦、转nos基因小麦、未转基因大豆、未转基因玉米、白菜、菠菜、猪肉、羊肉、鸭肉、鱼肉、兔肉、驴肉、鸡肉、鹅肉的基因组DNA,以提取的基因组DNA为模板,按照上述优化的反应体系和反应条件分别进行荧光定量PCR检测,验证引物和探针的特异性。检测结果如下表所示。
通过以上结果可以看出，6对引物探针仅针对相对应的物种具有Ct值，而其他样本没有扩增。由此可见本实验设计的引物探针具有很高的物种特异性。
实施例4：引物的灵敏度试验
使用植物基因组DNA提取试剂盒提取相对应的六种植物基因组DNA，用Nanodrop定量到50ng，做10×的梯度稀释(10-1,10-2,10-3,10-4,10-5)，每个梯度取2μl为模板量，按照上述方法依次对六种基因组DNA进行检测并分析灵敏度。
通过实验得知：当荧光定量DNA模板用量为0.01ng时，各基因的特异性探针仍有扩增曲线；当荧光定量DNA模板用量为0.001ng时，基本无扩增曲线，Ct值＞35，所以本方法的引物探针组的灵敏度为0.01ng。
重复性试验
分别提取未转基因棉花、转Mon531基因棉花、转Mon15985基因棉花、未转基因小麦、转bar基因小麦、转nos基因小麦的基因组DNA，每个物种各提取3个样本DNA，按照上述优化好的体系、PCR条件进行实时荧光定量PCR，每个样本进行3次复孔的独立重复，考察方法的稳定性，结果如下表：
上表中Ctmean表示Ct的平均值，Ct SD表示Ct的标准方差，从表中可以看出，每个样本的3次独立重复实验的Ct值的标准方差均小于0.5，说明检测结果的重复性好，检测的稳定性高。
实施例5：检测实施例
选取实际要检测的样品，样品为从青岛各大超市、农贸市场等处采购的小麦制品和棉花制品，采用本发明所述的方法对小麦和棉花制品进行转基因检测，以验证本方法的使用价值。
步骤如下：
1、DNA提取：将待测样品提取DNA，用Nanodrop核酸检测仪检测DNA样本浓度为50ng/μL，OD值于1.7-1.8之间。
2、待测样品DNA的实时荧光PCR扩增在PCR反应管中加入如下所示的PCR反应体系，将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按以下条件完成扩增：95℃预变性3min，95℃变性15s，60℃退火后延伸1min，退火阶段收集荧光，40个循环，同时进行阳性对照实验和阴性对照实验。
PCR反应体系：
3、使用ABI ViiA7荧光定量PCR仪分析软件分析扩增结果，阳性对照和阴性对照实验显示结果正常，各种待检样品的检测结果如下表所示。由此可见，市售的小麦制品和棉花制品中，存在转基因现象。
SEQUENCE LISTING
<110> 青岛捷安信检验技术服务有限公司
<120> 一种转基因小麦和棉花的检测方法
<130>
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
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