一种稻纵卷叶螟颗粒体病毒PCR检测的特异引物和检测方法与应用与流程

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种应用于稻纵卷叶螟颗粒体病毒PCR检测的特异性引物和检测方法与应用。

背景技术：

稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis Güenée)是为害水稻的重要迁飞性害虫，其发生水平与气候、水稻品种等呈一定的相关性，爆发时失治田块损失超过30％，对水稻产量造成重大影响，严重威胁我国粮食安全。目前稻纵卷叶螟的防治主要使用化学农药，随着“十三五”药肥减量使用政策的逐步落实，及对安全、优质、无公害农产品需求的提高，亟需开发新型、安全、高效的生物农药来防治稻纵卷叶螟。稻纵卷叶螟颗粒体病毒(CnmeGV)是对稻纵卷叶螟具有较强致病力的杆状病毒，在田间能引起疾病流行，是一种潜在的生物防治药剂。同时，CnneGV与苏云金杆菌Bt的联合作用也显示了对稻纵卷叶螟较好的控制作用。目前用于检测CnmeGV的技术仍是空白，过去检测其它颗粒体病毒主要有免疫法、ELISA、电泳法等蛋白质分析法。这些技术相对来说比较繁琐，对实验人员要求较高，而PCR技术具有较高的灵敏性、特异性和操作简便性，已经成为实验室常规技术。通过特异性引物PCR检测技术的建立，不仅可以快速鉴别稻纵卷叶螟感病情况，用于病毒的流行病检测，而且为后期病毒产品的检测提供依据。

技术实现要素：

针对CnmeGV检测技术的空白，本发明通过设计CnmeGV特异性引物，并建立检测方法，该方法能快速、准确鉴定出稻纵卷叶螟未表症但感病的虫体，为病毒的流行检测提供方法。

本发明的第一个目的是提供一种CnmeGV PCR检测的特异性引物，所述引物为：

上游引物：5′-CTTGCAACAAGTTCGC-3′

下游引物：5′-CCATGATGTAGTGACACG-3′

所述引物扩增的目标核苷酸序列为：

5′-CAATTGCAACAAGTTCGCATAAAAGCTGGTAATAAAAAAGCTTTTAAACAAATTAATTCGATTATACAACCTGGACGTTTTGAAGTATTGTTTACTTTGCAAAAAAACCTTTAGAAGAACAACAACAACAACAACAACAAGAAGAAGAAGAAAAGCAAAATTTACATGGATTGAGTTGAGCGGACTAAAATCGTGTCACTACATCATAAC-3′

本发明的第二个目的是提供一种CnmeGV PCR检测的方法，该方法是将上述引物与待测感病稻纵卷叶螟虫体样品的总DNA进行PCR反应，反应结束后对PCR产物进行电泳分析，以确定稻纵卷叶螟是否感染CnmeGV，具体包括以下步骤：

(1)引物的合成：合成权利要求1中所述的特异性引物；

(2)DNA模板提取：提取稻纵卷叶螟虫体样品的总DNA；

(3)PCR扩增反应：以步骤(2)提取得到的总DNA为模板，以步骤(1)中合成的特异性引物为引物，进行PCR扩增反应；(4)PCR产物分析：将步骤(3)中得到的PCR扩增产物进行琼脂糖电泳分析，所述引物扩增的目标核苷酸序列为：

5′-CAATTGCAACAAGTTCGCATAAAAGCTGGTAATAAAAAAGCTTTTAAACAAATTAATTCGATTATACAACCTGGACGTTTTGAAGTATTGTTTACTTTGCAAAAAAACCTTTAGAAGAACAACAACAACAACAACAACAAGAAGAAGAAGAAAAGCAAAATTTACATGGATTGAGTTGAGCGGACTAAAATCGTGTCACTACATCATAAC-3′；

检测判断PCR扩增产物中是否包括引物扩增的目标核苷酸序列，如果PCR扩增产物包含引物扩增的目标核苷酸序列，则说明待测稻纵卷叶螟样品感染稻纵卷叶螟颗粒体病毒；如果PCR扩增产物中没有检测到引物扩增的目标核苷酸序列，则说明待测稻纵卷叶螟样品没有感染稻纵卷叶螟颗粒体病毒。

根据上述稻纵卷叶螟虫体感染病毒的PCR检测方法，其中PCR扩增反应的反应体系为50μl：10×PCR Buffer 5μl，2.5mM/L的dNTPs 4μl，5U/μl的Taq DNA聚合酶0.5μl，10μM/L的上游引物2.0μl，10μM/L的下游引物2.0μl，DNA模板1μl，25mM/L的MgCl₂ 3μl，去离子水补至50μl。

根据上述稻纵卷叶螟虫体感染病毒的PCR检测方法，PCR扩增反应的反应条件为：

a：94℃预变性4min；

b：94℃变性30s，

c：52℃退火30s，

d：72℃延伸30s，b-d循环34个反应；

e：72℃延伸10min。

本发明的第三个目的是提供上述CnmeGV PCR检测的特异性引物在稻纵卷叶螟样品病毒流行和病毒制剂检测中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明建立了一种高灵敏度、快速鉴定稻纵卷叶螟虫体感染稻纵卷叶螟颗粒体病毒的检测方法，检测结果测序与病毒全基因组序列一致，该方法科学可行。以本发明的特异性引物为探针，可对田间稻纵卷叶螟虫体的感病情况进行系统调查，对病毒传播的研究具有重要的意义。同时，本发明的特异性引物也可用于含稻纵卷叶螟颗粒体病毒生物制剂的检测。

附图说明

图1为本发明实施例3(1)中特异性引物退火温度的确定分析的琼脂糖凝胶电泳结果：泳道1-8为特异性引物在不同退火温度下PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果：其中泳道1表示在退火温度为56.2℃时，PCR扩增效果；泳道2表示在退火温度为54.7℃时，PCR扩增效果；泳道3表示在退火温度为53.3℃时，PCR扩增效果；泳道4表示在退火温度为51.8℃时，PCR扩增效果；泳道5表示在退火温度为50.4℃时，PCR扩增效果；泳道6表示在退火温度为49.2℃时，PCR扩增效果；泳道7表示在退火温度为48.3℃时，PCR扩增效果；泳道8表示在退火温度为48℃时，PCR扩增效果。泳道M为GeneRuler DNA Ladder Mix，从上到下依次为：10000bp、8000bp、6000bp、5000bp、4000bp、3500bp、3000bp、2500bp、2000bp、1500bp、1200bp、1000bp、500bp。

图2为本发明实施例3(2)中特异性引物扩增灵敏度的检测分析的琼脂糖凝胶电泳结果：

泳道1-8为不同浓度的DNA模板下PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果：

其中泳道1表示模板浓度为80mg/L时PCR扩增效果；泳道2表示模板浓度为8mg/L时PCR扩增效果；泳道3表示模板浓度为800μg/L时PCR扩增效果；泳道4表示模板浓度为80μg/L时PCR扩增效果；泳道5表示模板浓度为8μg/L时PCR扩增效果；泳道6表示模板浓度为800ng/L时PCR扩增效果；泳道7表示模板浓度为80ng/L时PCR扩增效果；泳道8表示模板浓度为8ng/L时PCR扩增效果。

泳道M为GeneRuler DNA Ladder Mix，从上到下依次为：10000bp、8000bp、6000bp、5000bp、4000bp、3500bp、3000bp、2500bp、2000bp、1500bp、1200bp、1000bp、500bp。图3为本发明实施例3(3)中特异性引物可靠性验证分析的琼脂糖凝胶电泳结果：泳道1-7为不同物种的DNA模板PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果：其中泳道1表示模板为敏感稻纵卷叶螟幼虫DNA时PCR扩增效果；泳道2表示模板为大螟幼虫DNA时PCR扩增效果；泳道3表示模板为水稻叶片DNA时PCR扩增效果；泳道4表示模板为粘虫颗粒体病毒DNA时PCR扩增效果；泳道5表示模板为小菜蛾颗粒体病毒DNA时PCR扩增效果；泳道6表示模板为斜纹夜蛾核型多角体DNA时PCR扩增效果；泳道7表示模板为CnmeGV DNA时PCR扩增效果。

泳道M为GeneRuler DNA Ladder Mix，从上到下依次为：10000bp、8000bp、6000bp、5000bp、4000bp、3500bp、3000bp、2500bp、2000bp、1500bp、1200bp、1000bp、500bp。图4为本发明实施例3(4)中PCR检测稻纵卷叶螟种群病毒感染情况分析的琼脂糖凝胶电泳结果：泳道1-16为以不同稻纵卷叶螟幼虫个体DNA为模板PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果：其中泳道1为正常未显症稻纵卷叶螟幼虫DNA PCR扩增结果；泳道2为正常未显症稻纵卷叶螟幼虫DNA PCR扩增结果；泳道3为正常未显症稻纵卷叶螟幼虫DNA PCR扩增结果；泳道4为正常未显症稻纵卷叶螟幼虫DNA PCR扩增结果；泳道5为正常未显症稻纵卷叶螟幼虫DNA PCR扩增结果；泳道6为正常未显症稻纵卷叶螟幼虫DNA PCR扩增结果；泳道7为显症的稻纵卷叶螟感染病毒幼虫DNA PCR扩增结果；泳道8为正常未显症稻纵卷叶螟幼虫DNA PCR扩增结果；泳道9为正常未显症稻纵卷叶螟幼虫DNA PCR扩增结果；泳道10为正常未显症稻纵卷叶螟幼虫DNA PCR扩增结果；泳道11为正常未显症稻纵卷叶螟幼虫DNA PCR扩增结果；泳道12为正常未显症稻纵卷叶螟幼虫DNA PCR扩增结果；泳道13为正常未显症稻纵卷叶螟幼虫DNA PCR扩增结果；泳道14为正常未显症稻纵卷叶螟幼虫DNA PCR扩增结果；泳道15为正常未显症稻纵卷叶螟幼虫DNA PCR扩增结果；泳道16为正常未显症稻纵卷叶螟幼虫DNA PCR扩增结果。

泳道M为GeneRuler DNA Ladder Mix，从上到下依次为：10000bp、8000bp、6000bp、5000bp、4000bp、3500bp、3000bp、2500bp、2000bp、1500bp、1200bp、1000bp、500bp。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面通过实施例对本发明作进一步说明，但并不限制本发明的范围。除非特别说明，本发明采用的除引物之外的试剂、方法和设备均为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1：引物的设计与合成：

本发明通过分析已经测序完成的稻纵卷叶螟颗粒体病毒全基因组序列(Han GJ,Xu J,Liu Q,Li CM,Xu HX,Lu ZX.2016.Genome of Cnaphalocrocis medinalis granulovirus,the first Crambidae-infecting betabaculovirus isolated from rice leaffolder to sequenced.PLoS ONE,11(2):e0147882)，筛选特异性基因ORF123，其目标序列为：

TCATCTTTTTTTTCGAACAATTGCAACAAGTTCGCATAAAAGCTGGTAATAAAAAAGCTTTTAAACAAATTAATTCGATTATACAACCTGGACGTTTTGAAGTATTGTTTACTTTGCAAAAAAACCTTTAGAAGAACAACAACAACAACAACAACAAGAAGAAGAAGAAAAGCAAAATTTACATGGATTGAGTTGAGCGGACTAAAATCGTGTCACTACATCATAACAACAAACAAAAACATATTCCGCCAAATTTTAGAAATATGGAACCTTCTCATTTGCGTGTAGACAAATCAAGATTCTATGGTGGCAATTTATGTGTCTTCTGTTAGTGGTTATTAA

将上述序列输入Primer Primer 5.0软件中，控制参数(引物长度16-20碱基、Tm值50-55℃、GC含量40％-60％)进行引物设计，得到引物设计方案。然后将获得的引物序列在ORF123序列中进行回比筛选，选择保守性较高的引物序列，并进一步在Genbank中使用Blastn分析检测其特异性。最终得到的最佳引物序列为：

上游引物：5′-CTTGCAACAAGTTCGC-3′

下游引物：5′-CCATGATGTAGTGACACG-3′

本发明中引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

实施例2：模板的制备

(1)供试材料：本发明中使用的稻纵卷叶螟、大螟材料是2015年8月采集自江苏扬州邗江区甘泉镇南粳44品种水稻田块。本发明中病毒感染稻纵卷叶螟材料为室内人工接毒，饲养至显症收集。供试病毒分离自扬州水稻田块，后经人工为室内增殖，并纯化备用。水稻叶片为南粳44品种。粘虫颗粒体病毒、斜纹夜蛾核型多角体病毒、小菜蛾颗粒体病毒为室内增殖，并纯化。

(2)病毒DNA的提取：向感病的稻纵卷叶螟虫尸中加入适量的PBS(pH＝7.4)，研磨并用四层纱布过滤。经差速离心和蔗糖梯度离心，获得纯化的CnmeGV包涵体。在病毒包涵体中加入适量的蒸馏水混匀，吸取100μl用于病毒DNA的提取，经12000×g离心10min，倒掉上清，加入700μl病毒裂解液(0.1mol/L Na₂CO₃，0.1mol/L NaCl，0.01mol/L EDTA)37℃裂解2h。在裂解液中加入0.2mol/L HCl 75μl，10μl蛋白酶K，55℃水浴2h。加入10％SDS 100μl，55℃水浴30min。加入等等体积的苯酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1抽提2次，每次12000×g离心10min，吸取上清。在上清中加入2倍体积经冷却的异戊醇，混匀放置-20℃10min后12000×g离心10min，去上清。在沉淀中加入1ml 70％乙醇漂洗2次，每次12000×g离心10min，去上清。将沉淀干燥，加入100μl超纯水溶解，放置-20℃保存，备用。本方法同样适用于粘虫颗粒体病毒和斜纹夜蛾核型多角体病毒DNA的抽提。

(3)稻纵卷叶螟样品总DNA的抽提：取出感病、健康的稻纵卷叶螟幼虫，在75％酒精中进行多次漂洗以除去幼虫表面菌污染，然后在无菌水中浸泡1h去除酒精。使用灭菌的玻璃棒对稻纵卷叶螟幼虫样品进行研磨，加入750μl裂解液(0.1mol/L Tris，0.025mol/L EDTA(pH＝8.0)，0.5mol/L NaCl，1％SDS)，3.5μl蛋白酶K，55℃水浴4h，之后加入1μl RNase继续水浴30min。同实施例2(2)，在裂解液中加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇抽提2次，70％乙醇漂洗2次，最后使用100μl超纯水溶解，放置-20℃保存，备用。本方法同样适用于大螟总DNA的抽提。

(4)水稻叶片样品总DNA的抽提：将新鲜的水稻叶片在75％酒精中进行多次漂洗以除去表面菌污染，然后在无菌水中浸泡1h去除酒精。使用灭菌的玻璃棒在1.5ml试管中，以液氮进行快速研磨，然后使用植物基因组DNA快速抽提试剂盒(SK8231，上海生工生物工程有限公司)进行总DNA的提取，具体的操作参见试剂盒的使用说明。

实施例3：PCR扩增(1)特异性引物退火温度的确定：以CnmeGV DNA为模板，考察PCR扩增时引物退火温度的选择。上下游引物浓度均为10μm/L，模板浓度为80mg/L，Taq DNA Polymerase为Fermentas公司产品(EP0402)，DNA marker为Fermentas公司产品GeneRuler DNA Ladder Mix(SM0331)。

PCR扩增体系为50μl：10×PCR Buffer 5μl，2.5mM/L的dNTPs 4μl，5U/μl的Taq DNA聚合酶0.5μl，10μM/L的上游引物2.0μl，10μM/L的下游引物2.0μl，DNA模板1μl，25mM/L的MgCl₂ 3μl，去离子水补至50μl。梯度PCR仪设定8个温度梯度分别为：48℃、48.3℃、49.2℃、50.4℃、51.8℃、53.3℃、54.7℃、56.2℃。

PCR扩增反应的反应条件为：

a：94℃预变性4min；

b：94℃变性30s，

c：48-56.2℃退火30s，

d：72℃延伸30s，b-d循环34个反应；e：72℃延伸10min。梯度PCR扩增结果如图1中所示，泳道1-8分别为温度由高到低的扩增结果，M为DNA marker。从结果中可以看出，在退火温度高于53.3℃时，不能扩增出目的条带，而在退火温度低于或等于53.3℃时，能获得较好的扩增效果。因此，为了保证引物的特异性和较好的扩增效果，本发明选择引物的退火温度为52℃。

(2)特异性引物扩增灵敏度的检测：

将浓度为80mg/L的CnmeGV DNA模板依次稀释十倍，分别为80mg/L、8mg/L、800μg/L、80μg/L、8μg/L、800ng/L、80ng/L、8ng/L，以该八个样品为模板，进行PCR扩增，考察PCR检测模板的灵敏度。PCR扩增体系为50μl：10×PCR Buffer 5μl，2.5mM/L的dNTPs 4μl，5U/μl的Taq DNA聚合酶0.5μl，10μM/L的上游引物2.0μl，10μM/L的下游引物2.0μl，DNA模板1μl，25mM/L的MgCl₂ 3μl，去离子水补至50μl。

PCR扩增反应的反应条件为：

a：94℃预变性4min；

b：94℃变性30s，

c：52℃退火30s，

d：72℃延伸30s，b-d循环34个反应；e：72℃延伸10min。PCR扩增结果如图2，泳道1-8模板浓度由高到低，M为DNA marker。扩增结果显示，模板浓度为80μg/L时，能看见明显的目的条带，低于此值，PCR扩增后未出现特异性扩增条带。因此，本发明构建的PCR反应体系最低可以检测到病毒DNA浓度为80μg/L，具有较高的检测灵敏度。(3)特异性引物可靠性验证：分别以敏感的稻纵卷叶螟幼虫DNA，大螟DAN，水稻DNA，粘虫颗粒体病毒DNA，小菜蛾颗粒体病毒DNA，斜纹夜蛾核型多角体病毒DNA和CnmeGV DNA为模板，验证该特异性引物在其它物种中是否能扩增。PCR扩增体系为50μl：10×PCR Buffer 5μl，2.5mM/L的dNTPs 4μl，5U/μl的Taq DNA聚合酶0.5μl，10μM/L的上游引物2.0μl，10μM/L的下游引物2.0μl，DNA模板1μl，25mM/L的MgCl₂ 3μl，去离子水补至50μl。

PCR扩增反应的反应条件为：

a：94℃预变性4min；

b：94℃变性30s，

c：52℃退火30s，

d：72℃延伸30s，b-d循环34个反应；e：72℃延伸10min。PCR扩增结果如图3所示，该引物只能在CnmeGV中扩增出，属于特异性片段，和NCBI检测结果一致，说明本发明的特异性引物具有很好的特异性，能够用于CnmeGV的感染检测。(4)PCR检测稻纵卷叶螟种群病毒感染情况：以扬州甘泉田间收集的16头稻纵卷叶螟幼虫DNA为模板，其中显症幼虫1头，综合判断本发明的特异性引物及PCR反应体系对稻纵卷叶螟病毒感染检测的效果。PCR扩增体系为50μl：10×PCR Buffer 5μl，2.5mM/L的dNTPs 4μl，5U/μl的Taq DNA聚合酶0.5μl，10μM/L的上游引物2.0μl，10μM/L的下游引物2.0μl，DNA模板1μl，25mM/L的MgCl₂ 3μl，去离子水补至50μl。

PCR扩增反应的反应条件为：

a：94℃预变性4min；

b：94℃变性30s，

c：52℃退火30s，

d：72℃延伸30s，b-d循环34个反应；e：72℃延伸10min。

PCR结果如图4所示，显症的幼虫能明显扩增出目的条带(泳道7)，未显症的15头幼虫中也能扩增出两条特异性条带(泳道4和泳道5)。因此，本发明设计的特异引物对稻纵卷叶螟病毒感染幼虫检测具有较高的特异性，本发明的PCR鉴定方法可以应用在稻纵卷叶螟颗粒体病毒感染检测的相关工作中。

SEQ ID NO.1

<110>江苏里下河地区农业科学研究所

<120>一种稻纵卷叶螟颗粒体病毒PCR检测的特异引物和检测方法与应用

<160>3

<210>1

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过分析已经测序完成的稻纵卷叶螟颗粒体病毒全基因组序列设计合成

<400>1

CTTGCAACAA GTTCGC 16

SEQ ID NO.2

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>通过分析已经测序完成的稻纵卷叶螟颗粒体病毒全基因组序列设计合成

<400>2

CCATGATGTA GTGACACG 18

SEQ ID NO.3

<210>3

<211>218

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物扩增的目标核苷酸序列

<400>3

CAATTGCAAC AAGTTCGCAT AAAAGCTGGT AATAAAAAAG CTTTTAAACA AATTAATTCG 60

ATTATACAAC CTGGACGTTT TGAAGTATTG TTTACTAATG TTGCAAAAAA ACCTTTAGAA 120

GAACAACAAC AACAACAACA ACAAGAAGAA GAAGAAAAGC AAAACAGTTT TACATGGATT 180

GAGTTGAGCG GACTAAAATC GTGTCACTAC ATCATAAC 218