Grf表达质粒在制备降低仔猪出生弱仔率的药物中的用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及畜牧养殖领域，尤其涉及GRF表达质粒在制备降低仔猪出生弱仔率的 药物中的用途。
【背景技术】
[0002] 猪肉是我国肉类消费的主要来源，占肉类消费的65 %。2014年，我国猪肉产量达 5671万吨，占居世界第一位。因此，生猪生产直接关系到国计民生，有"猪粮安天下"之说。
[0003] 现代养猪业生产中，我国的生猪养殖生产水平较低，特别是母猪的生产水平更为 突出，导致生产养殖成本和资源消耗增加，直接影响生猪养殖的经济效益和健康发展，因此 开展提高母猪生产力的工作具有十分重要的意义。我国每头母猪每年提供的上市猪的数量 仅为17-18头左右，远远低于国外的26-28头的水平，成为制约我国生猪养殖生产水平的主 要因素。
[0004] 当前，困扰着母猪生产水平发展的问题主要是弱仔问题。有资料表明，我国猪弱仔 的发生率在15-20%。造成弱仔的因素很多，包括疾病、营养、胎盘效率、管理和环境气候因 素等。实际生产中，人们较多关心的是疾病因素，而对妊娠期子宫胎盘的发育及激素水平的 研究方面，即宫内发育迟缓（intrauterine growth retardation, IUGR)缺乏足够的认识和 重视。胎盘能分泌多种激素，如包括绒毛膜促性腺激素、绒毛膜生长激素(胎盘催乳激素）、 绒毛膜促甲状腺激素、雌激素和孕激素等，对于胎儿生长发育有重要的作用。通常胎儿初生 重的2/3部分在母猪妊娠后期的1/3的时段内发育形成，特别是妊娠13~14周至分娩前是胎 儿生长发育最快的阶段，同时也是胎儿体能储备的关键时期。若母猪在妊娠期胎盘功能不 足，则胎儿在母猪体内发育不良，出生体重小，生长缓慢，死亡率高，造成弱仔等无效仔猪比 例偏大。因此，胎盘的功能直接关系到的胎猪在子宫里的正常发育和生长。
[0005] 哺乳动物的生长发育由一系列复杂的神经内分泌免疫调节系统调控，它起源于下 丘脑。而下丘脑分泌两种对于脑垂体细胞很重要的肽类:促生长激素释放激素 GRF和生长抑 素 SSTARF作用于脑垂体促进生长激素 GH的分泌，从而增加肝脏和其他组织中胰岛素样生 长因子类IGF-1的生成，而GH在肝脏以IGF-1的形式促进机体新陈代谢。动物在生长过程中， 动物神经内分泌生长轴各因子(激素、受体、结合蛋白等)及其基因对动物的生长发育起着 关键的作用。整个过程的调控复杂，存在着基因的转录、表达、产物的修饰以及各水平的反 馈调节机制。
[0006] 1962年Frantz等发现猪的下丘脑含有刺激生长激素分泌的物质存在，1964年Due 等用纯化或部分纯化的下丘脑浸出液加入鼠垂体培养液中，能提高生长激素的分泌量。 1971年Schally等从猪下丘脑浸出液和垂体门静脉血中分离出一种10肽，可刺激GH的分泌。 1982年，Guillemin、Ri ver先后分别报道了胰岛细胞肿瘤及类癌患者有典型肢端肥大症，且 临床表现中GH明显升高而无垂体病变，并由肿瘤组织中成功地提取和纯化了具有刺激GH分 泌活性的肽及其降解产物，确定了其一级结构，其中分子量最大，具有代表性的为44肽，称 为人膜生长激素释放因子（Human pancreatic growth hormone releasing factor, hpGRF)。另外还发现 了其降解产物，包括 hpGRFl-43、hpGRFl-40、hpGRFl-39、hpGRFl-37、 hpGRFl-32、hpGRFl-29等。以后的研究证明，hpGRF和下丘脑合成的GRF结构完全一致，其成 熟形式为GRF1 - 44 一 NH2。随着分离纯化GRF方法的不断改进，相继从不同动物的下丘脑中 分离到各种GRF，包括猪、牛、山羊和绵羊、鼠的GRF。随着科学技术的发展，已能应用多肽合 成和基因工程技术生产GRF，使对GRF的研究进入了新的阶段。
【发明内容】
[0007] 有鉴于此，有必要针对仔猪出生时弱仔率较高、母猪生产水平较低的问题，本发明 提供GRF表达质粒在制备降低仔猪出生弱仔率的药物中的用途。
[0008] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0009] GRF表达质粒在制备降低仔猪出生弱仔率的药物中的用途。
[0010] 优选地，所述GRF表达质粒为pVAXl-GRF质粒。
[0011] 优选地，所述降低仔猪出生弱仔率的药物为注射剂。
[0012] 优选地，所述降低仔猪出生弱仔率的药物为肌肉注射剂。
[0013] 优选地，所述降低仔猪出生弱仔率的药物为孕猪注射药物。
[0014] 优选地，所述孕猪为怀孕60-80天的母猪。
[0015] 优选地，所述PVAX1-GRF质粒的注射剂量为1~8mg/头。
[0016]优选地，所述pVAXl-GRF质粒的注射剂量为4mg/头。
[0017] -种降低仔猪出生弱仔率的方法，将GRF表达质粒注射入孕猪肌肉组织中，经基因 转移后，测定母猪产仔弱仔率的变化。
[0018] 优选地，所述基因转移利用体外基因转移仪进行，基因转移的电压为20~40V，脉 冲频率为4~9Hz，脉冲脉宽为10~100ms。使用电转移技术增强了质粒的转移，从而可以使 注射部位的肌肉成为一个生物反应器，用来持久产生和分泌蛋白质到血液循环系统中。相 比于用腺病毒介导的基因转移，在一次注射后电转移可以使蛋白质的表达水平量增加至少 2~3个以上数量级，并有可能达到生理所需的水平。
[0019] 优选地，所述降低仔猪出生弱仔率的方法包括以下步骤：
[0020] S1.对怀孕60~80天的母猪后肢肌肉注射pVAXl-GRF质粒，注射剂量为1~8mg/头；
[0021] S2.经体外基因转移仪处理，基因转移的电压为20~40V，脉冲频率4~9Hz，脉冲脉 宽10~100ms;
[0022] S3.于妊娠母猪产仔后检测仔猪的出生重。
[0023] 更优选地，所述基因转移的电压为32V，脉冲频率为8Hz，脉冲脉宽为100ms。
[0024] 肌肉组织可以表达外源的基因，但表达效率很低，难于达到明显的作用。所以，为 了使肌肉组织高效表达外源基因，采用提高肌肉组织表达效率的措施十分重要。SP启动子 是根据骨骼肌α-actin启动子能在肌肉组织中特异性启动外源基因表达的这一特性，将骨 骼肌a- actin启动子加以改造，将E-box、MEF-2、TEF-l和SRE序列随意组合所构建的合成启 动子重组库中筛选出的一种人工合成启动子，其在肌肉组织中的转录能力远远超过天然肌 肉特异启动子和病毒启动子。电穿孔介导转移外源基因的方法是依据细胞生物学和免疫学 等理论，采用微电子及计算机技术，通过设计特定的控制电路产生合适的脉冲电流，瞬间改 变靶细胞的通透性，促进DNA、RNA等核酸及蛋白、化学小分子物质快速进入细胞，提高转染 率、增强药物作用、增加表达量的效果。使用电穿孔技术增强了质粒的转移，从而可以使注 射部位的肌肉成为一个生物反应器，用来持久产生和分泌蛋白质到血液循环系统中。在一 次注射后电穿孔转移，相比于用腺病毒介导的基因转移，这种方法可以使蛋白质的表达水 平量增加至少2-3个以上数量级，并有可能达到生理所需的水平。本发明通过启动子的优化 及电转移的方法，可以使外源基因在肌肉组织中的表达效率大大提高。
[0025]与现有技术相比，本发明的有益效果：
[0026]本发明利用肌肉特异性表达pVAX 1-GRF质粒的特性，并通过注射特定剂量的质粒 和特定条件下的体外基因转移，使PVAX1-GRF质粒在母猪肌肉组织中