高效表达，进而促进胎 儿的发育，降低了出生仔猪的弱仔率，最终达到提高养猪业经济效益的目的，具有巨大的实 际应用价值。
【附图说明】
[0027] 图1为pVAXl-GRF质粒图谱。
【具体实施方式】
[0028] 为了更好的说明本发明，下面结合附图和【具体实施方式】做进一步说明。本发明中 所用试剂或仪器均可由市场购得，使用的检测方法等都是本领域所熟知的，在此不再赘述。 [0029]本发明中使用的GRF表达质粒为pVAX 1-GRF质粒，其图谱如图1所示，通过以下方法 制备：
[0030] (1)称取的工程菌（大肠杆菌DH5a，pVAXl-GRF质粒转化菌）菌体10g，重悬于50mL溶 液N(50mmol/L Tris，10mmol/L EDTA，RNaseA 40yg/mL，pH8 · 1)中。然后添加50mL溶液0 (0.12mol/L NaOH，l%十二烷基磺酸钠（SDS))，于室温下对菌体裂解5~lOmin。使用20mL 3mol/L的醋酸钾溶液，于4°C中和裂解液20min。然后将裂解液以5572r/min(8000g)离心 15min，取上清液;将上清液经过0.145/0.122μπι囊式过滤器过滤。
[0031] (2)将装填好的210mL离子交换色谱柱(215cmX 116cm)接入Biologic色谱系统。部 分澄清液体加入1/20体积含20%的1'1'；11:〇11溶液（7501]1111〇1凡他(]1，501]1111〇1凡1'1^8,20% Triton X-100或Triton Χ-114，ρΗ7·10)，稍作搅拌混合后，于4°C静止lh，然后进行色谱纯 化得到实验组样品。
[0032]实验组样品色谱纯化方法：用0.13mol/L NaOH清洗色谱柱，用3倍柱体积含 500mmo 1/L NaCl、50mmo 1/L Tris、15 % (体积分数)异丙醇和0.115 % (体积分数)非离子表 面活性剂的缓冲液(PH7.10)平衡色谱柱，将处理好的样品置于冰水浴中（0~4°C)用蠕动栗 进行上样，保持温度为10~13°C。然后用含625mmol/L NaCl、50mmol/L Tris和15%异丙醇 的缓冲液(PH7.10)淋洗色谱柱至基线平稳。接着用含1.125mol/L NaCl、50mmol/LTris和 15 % (体积分数)异丙醇的缓冲液(pH8.15)进行洗脱，线性流速为120cm/h，按照254nm紫外 吸收曲线分峰收集。将洗脱液收集入离心管中，加入等体积的异丙醇沉淀质粒。
[0033] 对照组样品不进行非离子表面活性剂处理，而且用于平衡色谱柱的缓冲液中不添 加非离子表面活性剂，其他色谱纯化条件同实验组相同。
[0034] 将异丙醇沉淀获得的质粒用75-80%乙醇浸泡60min灭菌，无菌生理盐水洗涤4次， 再用无菌生理盐水悬浮质粒，调节至适当浓度。
[0035] 实施例1
[0036] 将30头怀孕60天的母猪（大白猪）随机分成2组，第一组注射生理盐水lmL，第二组 注射浓度为2mg/mL的质粒lmL，注射部位为后肢肌肉。后经体外基因转移仪处理，转移电压 为32V，脉冲频率7Hz，脉冲脉宽100ms ;于妊娠母猪产仔后检测仔猪的体重，按800克为标准 计算弱仔数及弱仔率，结果第二组出生体重比第一组提高86克/头仔猪(P〈0.05)，弱仔率降 低 6·9%(Ρ〈0·05)。
[0037] 实施例2
[0038]将30头怀孕60天的母猪（大白猪）随机分成2组，第一组注射生理盐水lmL，第二组 注射浓度为2mg/mL的质粒lmL，注射部位为后肢肌肉。后经体外基因转移仪处理，转移电压 为30V，脉冲频率5Hz，脉冲脉宽50ms;于妊娠母猪产仔后检测仔猪的体重，按800克为标准计 算弱仔数及弱仔率，结果第二组出生体重比第一组提高82克/头仔猪(P〈0.05)，弱仔率降低 5·9%(Ρ〈0·05)。
[0039] 实施例3
[0040]将20头怀孕75天的母猪（长白猪）随机分成2组，第一组注射生理盐水lmL，第二组 注射浓度为3mg/mL的质粒lmL，注射部位为后肢肌肉。后经体外基因转移仪处理，转移电压 为36V，脉冲频率5Hz，脉冲脉宽40ms;于妊娠母猪产仔后检测仔猪的体重，按800克为标准计 算弱仔数及弱仔率，结果第二组出生体重比第一组提高98克/头仔猪(P〈0.05)，弱仔率降低 7·8%(Ρ〈0·05)。
[0041 ] 实施例4
[0042]将30头怀孕80天的母猪（大白猪）随机分成2组，第一组注射生理盐水lmL，第二组 注射浓度为3mg/mL的质粒lmL，注射部位为后肢肌肉。后经体外基因转移仪处理，转移电压 为30V，脉冲频率5Hz，脉冲脉宽90ms;于妊娠母猪产仔后检测仔猪的体重，按800克为标准计 算弱仔数及弱仔率，结果第二组出生体重比第一组提高92克/头仔猪(P〈0.05)，弱仔率降低 6·6%(Ρ〈0·05)。
[0043] 实施例5
[0044]将30头怀孕60天的母猪（大白猪）随机分成2组，第一组注射生理盐水lmL，第二组 注射浓度为4mg/mL的质粒lmL，注射部位为后肢肌肉。后经体外基因转移仪处理，转移电压 为30V，脉冲频率6Hz，脉冲脉宽80ms;于妊娠母猪产仔后检测仔猪的体重，按800克为标准计 算弱仔数及弱仔率，结果第二组出生体重比第一组提高99克/头仔猪(P〈0.05)，弱仔率降低 7·2%(Ρ〈0·05)。
[0045] 由实施例1-5可知，将pVAXl-GRF质粒注射入孕猪肌肉中，经基因转移后，可以明显 提高出生仔猪的体重，降低出生仔猪的弱仔率，详细结果如表1所示。
[0046] 表1、各实施例中出生仔猪体重及弱仔率统计表
[0047]
[0048] 注:在计算弱仔率时，仔猪的总数和计算平均体重时仔猪的总数相同。
[0049] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保 护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【主权项】
1. GRF表达质粒在制备降低仔猪出生弱仔率的药物中的用途。2. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于:所述GRF表达质粒为pVAXl-GRF质粒。3. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述降低仔猪出生弱仔率的药物为注射 剂。4. 根据权利要求3所述的用途，其特征在于:所述降低仔猪出生弱仔率的药物为肌肉注 射剂。5. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于:所述降低仔猪出生弱仔率的药物为孕猪注 射药物。6. 根据权利要求5所述的用途，其特征在于:所述孕猪为怀孕60-80天的母猪。
【专利摘要】本发明涉及GRF表达质粒在制备降低仔猪出生弱仔率的药物中的用途。本发明通过向孕猪肌肉注射GRF表达质粒，进行基因转移，使GRF表达质粒在母猪肌肉组织中高效表达，进而促进胎儿的发育，降低了出生仔猪的弱仔率，最终达到提高养猪业经济效益的目的，具有巨大的实际应用价值。
【IPC分类】A61K48/00, A61P15/00
【公开号】CN105617404
【申请号】CN201610058264
【发明人】张永亮, 习欠云, 史合群
【申请人】广州市科虎生物技术研究开发中心
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2016年1月27日