针对所有植物防病、促生、抗逆的解淀粉芽胞杆菌Y15及其应用的制作方法

本发明属于植物保护领域，涉及针对所有植物防病、促生、抗逆的解淀粉芽胞杆菌Y15及应用。

背景技术：

中国是农业大国,我国作物(包括蔬菜、果树、中药材、粮食作物等)生产总面积已超过22亿亩,为世界农业发展做出了巨大贡献。但是，我国亦是病虫害多发、频发和重发大国，病虫害与水灾、旱灾并称为我国三大自然灾害。联合国粮农组织估计，我国每年病虫害引起的农作物损失达700亿-900亿元，其中病害占33％，作物病害正日趋成为限制我国农林业生产可持续发展的重要因素。

植物病害主要包括土传病害以及地上部病害。植物土传病害通常引起植物根部乃至全株性的病症,其发生和流行通常属于积年流行病害，如引发纹枯、枯萎、黄萎、立枯、猝倒、根腐、青枯、软腐、根结线虫、胞囊线虫、根肿等病害。地上部病害主要危害叶片、茎干、果实等地上部位，主要是借助气流和人们的农事活动从温室外面传入外，如缩叶病、霜霉病、炭疽病、锈病、灰霉病、病毒病等。这些病害病原物都有寄主范围广、抗逆性强、难以根除等特点。

不良环境包括干旱、洪涝、高温、寒冷等恶劣天气，均会对草本作物的生长产生不良影响。20世纪90年代，中国平均每年受旱面积为2733万hm²，粮食因旱减产量与总产量之比达到了4.7％。而且每年因涝渍灾害损失粮食62.3亿kg,年均经济损失46.7亿元。高温、寒冷等天气亦会对作物生产造成严重损害。增加草本作物抵抗外界不良环境能力受到了国内外研究者的高度重视，目前有效的方法非常少。

利用土壤有益微生物来控制病害的发生以及诱导提高作物抗逆能力是近些年来研究的热点，尤其这些微生物对环境无污染，引起了科学家们利用生物防治手段控制病害、以及应对不良环境的兴趣。解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)是一种与枯草芽孢杆菌亲缘性很高的细菌，在其自身的生长过程中可以产生一系列的代谢产物，这些代谢产物使得解淀粉芽胞杆菌能够具有广泛地抑制真菌和细菌的活性，或者诱导植物抗性。因此，近些年大量学者在对解淀粉芽胞杆菌的新发现与新应用以及基因功能研究和发酵条件的优化做了大量的探索。它可以不同方式或途径影响植物的许多代谢过程，增加植物根长，改变植物根系形态建成，促进根系对水份和营养元素的吸收，解淀粉芽胞杆菌可以提高植物的抗病能力，抵抗病原菌的侵染，以及抗逆能力，增强植物应对寒冷、盐分、干旱等环境的胁迫。

解淀粉芽胞杆菌在自然界中分布十分广阔，同时能够对多种真菌与细菌产生抑制作用，并且具有丰富的自身代谢产物。因此，在生物防治方面具有广阔的应用前景，可以适当的代替传统的化学农药。同时，随着分子研究技术的提高，解淀粉芽胞杆菌的基因功能更多地被了解，增加可应用的可行性。以及发酵条件的优化使得解淀粉芽胞杆菌的大规模应用也具备了客观条件。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有防治植物病害以及抵抗不良环境技术的不足，提供一种绿色环保的能提高广谱植物防病、促生、抗逆的解淀粉芽胞杆菌Y15。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

针对广谱植物的防病、促生、抗逆的解淀粉芽胞杆菌Y15，该菌株分类命名为解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，于2016年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.13327。

本发明所述的解淀粉芽胞杆菌Y15在制备广谱性植物防病、促生、抗逆的制剂中的应用；优选在水果、蔬菜、粮油作物等农作物，菊等园艺花卉，以及铁皮石斛等中药材等所有植物上的病害、促进其生长及提高品质、提高其抗逆性的制剂中的应用。所述的解淀粉芽孢杆菌Y15进一步优选在防治西瓜细菌性果斑病、番茄黄化曲叶病毒病、桃树缩叶病，或促进西瓜、番茄、黄瓜、水稻、空心菜、菊花、铁皮石斛生长，提高其品质；提高番茄抗旱性中的应用。用本发明所述的针对多种植物防病、促生、抗逆的解淀粉芽胞杆菌Y15制备的菌剂。

所述的的菌剂优选通过以下方法制备得到：

解淀粉芽胞杆菌Y15在LB培养液中28℃180rpm振荡培养12-16h，然后6000rpm离心10min得到菌体，用灭菌水将菌体进行稀释制成菌剂，菌剂成品中活菌总浓度为1×10⁹-1×10¹⁰CFU/mL。

本发明所述的菌剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

解淀粉芽胞杆菌Y15在LB培养液中28℃180rpm振荡培养12-16h，然后6000rpm离心10min得到菌体，用灭菌水将菌体进行稀释制成菌剂，菌剂成品中活菌总浓度为1×10⁹-1×10¹⁰CFU/mL。

本发明所述菌剂在草本植物防病、促生抗逆中的应用；优选在水果、蔬菜、粮油作物等农作物，菊等园艺花卉，以及铁皮石斛等中药材等所有植物上的病害、促进其生长及提高品质、提高其抗逆性的制剂中的应用。

所述的由解淀粉芽孢杆菌Y15制备的菌剂在防治西瓜细菌性果斑病、番茄黄化曲叶病毒病、桃树缩叶病，或促进西瓜、番茄、黄瓜、水稻、空心菜、菊花、铁皮石斛生长，提高其品质；提高番茄抗旱性中的应用。

所述的菌剂优选通过灌根处理进行应用。

有益效果

本发明利用对环境无毒害的微生物菌剂防治广谱性植物土传病害以及地上部病害(尤其是防治西瓜果斑病)，提供了一种绿色环保的解淀粉芽胞杆菌菌剂，防治优选在水果、蔬菜、粮油作物等农作物，菊等园艺花卉，以及铁皮石斛等中药材等所有植物上的土传病害和地上部病害，促进上述各类作物的生长并提高品质和提高其抗逆性(包括抗旱、抗寒、耐热、耐涝等，抵抗倒春寒等不良气候)。解决了化学药剂等其它方法效果不佳或者有残留等问题，保护环境，促进农业可持续发展。

该制剂对解淀粉芽胞杆菌Y15灌根处理后对多种植物病害生防效果达到52.17％以上，，作用十分明显；且对植物的株高以及根长有明显地提高，对植株具有一定的促生作用，经Y15处理的农田作物与对照组相比，增产超53.99％。该解淀粉芽胞杆菌菌剂，可室温保存6个月-1年。解淀粉芽胞杆菌Y15菌剂处理的植物田间防病促生试验结果表明，对病害防效高达52.17％，增产效果超过53.99％。

附图说明

图1、解淀粉芽胞杆菌Y15菌剂处理对作物病害的生防效果

图2、解淀粉芽胞杆菌Y15菌剂处理对作物生物量的影响

图3、解淀粉芽胞杆菌Y15菌剂处理对作物抗逆性的影响

生物保藏

解淀粉芽胞杆菌Y15，为解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens，于2016年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.13327,地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所。

具体实施方式

实施例1解淀粉芽胞杆菌菌株Y15的分子学鉴定

Y15由浙江梨园根围土壤中分离得到。

细菌基因组试剂盒(赛百盛公司)提取细菌基因DNA后，用gyrB通用引物gyrB1(5'–GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3')；gyrB2R(5'–AGCAGGATACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3')从基因组DNA中扩增出gyrB基因片段。具体扩增体系及程序(25ul)如下：引物1、2(10μM)各1μl；Mix:12.5μl；Taq:0.5μl。ddH₂O:10μl；模板:1μl。94℃预变性5min，94℃变性1min，56℃退火2min，72℃延伸2min，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，90V，30min；EB染色30min，检测扩增产物。扩增产物纯化后连接到pMD19-T载体，转化于Escherichia coli DH5α，提取阳性克隆质粒，委托TaKaRa公司测序，提交NCBI(National Center for Biotechnology Information)进行比对。比对结果显示该菌株与Bacillus amyloliquefaciens相似度为100％，故金鼎味解淀粉芽孢杆菌。

实施例2

解淀粉芽胞杆菌Y15菌剂的制备方法如下：

解淀粉芽胞杆菌Y15在LB培养液中28℃180rpm振荡培养12-16h，然后6000rpm离心10min得到菌体，用灭菌水将菌体进行稀释制成菌剂，菌剂成品中活菌总浓度为1×10⁹-1×10¹⁰CFU/mL。

实施例3解淀粉芽胞杆菌Y15温室促生试验

方法：将参试西瓜、番茄、黄瓜种子用10％H₂O₂表面消毒10min，无菌水洗净后晾干备用。每个营养钵播种10粒种子。正常浇水管理4周后，将长势一致的苗移栽至330ml塑料杯中，移栽时将悬浮好的解淀粉芽胞杆菌Y15菌剂以1.0×10⁷CFU/mL的浓度灌根施用于作物根部，每株30mL量。然后置于温室中培养，28℃，70％相对湿度。以清水处理作为对照，每组处理48株苗，随机放置，共重复三次。30d后测定西瓜、番茄、黄瓜植株株高、茎粗、鲜重、干重等生物量。

将参试水稻、空心菜种子用10％H₂O₂表面消毒10min，无菌水洗净后晾干备用。将水稻、空心菜种子用1.0×10⁷CFU/mL的浓度的解淀粉芽胞杆菌Y15菌剂浸种5min。再在每个营养钵(高13cm，直径9cm)播种4粒种子，出苗后(7d)，将悬浮好的解淀粉芽胞杆菌Y15菌剂以1.0×10⁷CFU/mL的浓度灌根施用于作物根部，每株30mL量。以清水处理作为对照。每组处理48株苗，随机放置，共重复三次。接种30d后测定水稻、空心菜植株株高、茎粗、鲜重、干重等生物量。

将参试的菊花从宿根(老根)萌发的新枝上剪取长12cm的嫩梢作为插条，从节基部削平，切去基部的两片大叶，再将上部的叶子修去一半(减少水分蒸发，防止插条萎蔫)即可扦插至盆钵中(直径9cm，高13cm)。将悬浮好的解淀粉芽胞杆菌Y15菌剂以1.0×10⁷CFU/mL的浓度灌根施用于作物根部，每株30mL量。以清水处理作为对照。每组处理48株苗，随机放置，共重复三次。接种30d后测定植株株高、茎粗、鲜重、干重等生物量。

生物量增加(％)＝(处理组植株干重-对照植株干重)/对照植株干重×100％

如表1、2、3、4、5、6所示，解淀粉芽胞杆菌Y15能够显著促进茄科番茄、葫芦科西瓜、黄瓜，水稻，叶类蔬菜空心菜，菊花的生长，表现在作物的鲜重干重，茎长，茎粗与对照相比，都有显著的增加，结果计算得解淀粉芽胞杆菌Y15对茄科番茄、葫芦科西瓜、黄瓜，水稻，叶类蔬菜空心菜，菊花的生物量增加分别达到27.87％、12.93％、29.70％、40.00％、23.08％、43.90％。

表1解淀粉芽胞杆菌Y15对西瓜生物量的影响

注：不同小写字母者表示在0.05水平上差异显著。

表2解淀粉芽胞杆菌Y15对番茄生物量的影响

注：不同小写字母者表示在0.05水平上差异显著。

表3解淀粉芽胞杆菌Y15对黄瓜生物量的影响

注：不同小写字母者表示在0.05水平上差异显著。

表4解淀粉芽胞杆菌Y15对水稻生物量的影响

注：不同小写字母者表示在0.05水平上差异显著。

表5解淀粉芽胞杆菌Y15对空心菜生物量的影响

注：不同小写字母者表示在0.05水平上差异显著。

表6解淀粉芽胞杆菌Y15对菊花生物量的影响

注：不同小写字母者表示在0.05水平上差异显著。

实施例4解淀粉芽胞杆菌Y15温室大棚对细菌性病害防效试验

方法：将参试西瓜种子用10％H₂O₂表面消毒10min，无菌水洗净后晾干备用。

将催芽后的西瓜种子播种于装有无菌土壤中盆砵中，每盆一粒，播种前保持土壤较为干燥。待西瓜长到6叶期时，将悬浮好的解淀粉芽胞杆菌Y15生防菌剂以1.0×10⁷CFU/mL的浓度灌根施用于作物根部，随后置于温室中培养，28℃，70％相对湿度以上，16/8h光周期。待接种生防菌5天后，进行病原菌的接种，接种浓度为10⁷CFU/ml，采用手动式喷器将该菌成雾状喷施于叶片的表面，使叶片湿润而菌液又恰好不流下来，接种前所有植株均未发病，接种病原菌3天后，开始发病并统计其发病率，并计算防效。

西瓜细菌性果斑病叶片分级标准:(Ofir Bahar(2009))

发病率统计(病情统计)：

0级:不发病；

1级:病叶上有零星病斑，病斑占叶面积的10％以下；

2极:病叶上有少量病斑，病斑占叶面积的11％～25％；

3级:病叶上病斑数量中等，病斑占叶面积的26％～50％；

4级:病叶上病斑数量较多，病斑占叶面积的51％～75％；

5级:病叶上有许多病斑，病斑占叶面积的76％～90％；

6级：病叶上有大量病斑，病斑占叶面积90％以上；

病害严重度％＝[Σ(病级株数×代表级数)/植株总数×最高代表级值]×100％；

防效％＝(对照发病率－处理防病率)/对照发病率×100％.

试验结果显示，解淀粉芽胞杆菌Y15能够显著降低西瓜细菌性果斑病的发病率，其平均防效达50.17％。

表7.解淀粉芽胞杆菌Y15对西瓜细菌性果斑病的防效

注：不同小写字母者表示在0.05水平上差异显著。

实施例5解淀粉芽胞杆菌Y15菌剂处理的防治病毒病试验

方法：将番茄种子(上海合作903)表面消毒(70％无水乙醇浸泡1～2min，0.05％次氯酸钠溶液浸泡10min，灭菌水冲洗6次)，播种于育苗穴盘中并放置于28℃，16/8h光周期、70％相对湿度的温室中进行培育。待番茄苗长到3～4叶期时(25d)进行移栽。将番茄苗移栽至装满基质的盆钵中，每钵一株，置于条件为28℃、16/8h光周期、70％相对湿度的温室内培育。番茄移栽当日进行生防菌第一次灌根处理，灌根处理菌液浓度约为5×10⁷CFU/mL，每株苗用量为30mL，缓慢浇灌于番茄根部，同时进行喷雾处理，菌液浓度为5×10⁷CFU/mL，按照0.01％的终浓度加入表面活性剂吐温-20，对番茄叶片均匀喷雾。番茄移栽7d后进行病毒接种。接种方法为：将没有携带TYLCV的烟粉虱在表现TYLCD症状的番茄植株上饲养48h，然后将待接种的健康植株移至粉虱温室内，每株番茄30头左右，接种3d后使用吡虫啉除去烟粉虱，将各处理移至防虫温室(28℃，16/8h光周期，70％相对湿度)中(Sade D,Eybishtz A,Gorovits R,et al.A developmentally regulated lipocalin-like gene is overexpressed in tomato yellow leaf curl virus-resistant tomato plants upon virus inoculation，and its silencing abolishes resistance[J].Plant Molecular Biology.2012,80:273-287.)。以清水处理作为空白对照，每个处理48株苗，3次重复。病毒接种40d左右，统计病情。

番茄黄化曲叶病毒病病情指数分级标准(Friedmann M,Lapidot M,Cohen S,et al.A novel source of resistance to tomato yellow leaf curl virus exhibiting a symptomLess reaction to viral infection[J].Journal of the American Society for Horticultural Science.1998,123:1004-1007.)：

0级：无症状；

1级：顶部叶片轻度黄化，叶边缘轻度卷曲，花期花轻度脱落；

2级：顶部叶片中度黄化，叶边缘中度卷曲褶皱，花期花轻度脱落，结果期产量轻度减产；

3级：叶片严重黄化，卷曲，褶皱，花期花中度脱落，结果期产量中度减产；

4级：大面积叶片严重畸形缩小，植株生长缓慢，明显矮化，花期花严重脱落，结果期产量严重减收或绝产。

病害严重度％＝[∑(发病植株数×病级数)/(总植株数×最高病级数)]×100；

生防效果％＝[(对照病害严重度－处理病害严重度)/对照病害严重度]×100

试验结果显示，解淀粉芽胞杆菌Y15能够显著降低番茄黄化曲叶病毒病的发病率，其平均防效达47.05％。

表8解淀粉芽胞杆菌Y15对番茄黄化曲叶病毒病的防效

注：不同小写字母者表示在0.05水平上差异显著。

实施例6解淀粉芽胞杆菌Y15菌剂处理的防治果树病害及提高果实产量试验

方法：选择3年生桃树，于上年秋季施基肥时，当年初春长出新叶时以及开花前采用1.0×10⁷CFU/mL浓度的解淀粉芽孢杆菌Y15菌剂浇灌于处理组根部，共3次。每处理选择100颗桃树，同时设置清水对照组。于当年夏季桃树采收期对桃树缩叶病发病率进行统计，并对果实产量以及品质进行调查。

发病率％＝[发病植株数/调查总植株数]×100；

生防效果％＝[(对照病发病率－处理发病率)/对照病发病率]×100

试验结果显示，解淀粉芽胞杆菌Y15能够显著降低桃树缩叶病的病害严重度，其平均防效达57.40％；并且能够显著提高产量以及品质。

表9解淀粉芽胞杆菌Y15对桃树缩叶病的防效

注：不同小写字母者表示在0.05水平上差异显著。

表10解淀粉芽胞杆菌Y15对桃树果实生物量的影响

注：不同小写字母者表示在0.05水平上差异显著。

实施例7解淀粉芽胞杆菌Y15菌剂处理的中药材温室促生长试验

选取前期准备的已生长约45d的铁皮石斛组培苗为材料。在无菌的超净台内,在每株铁皮石斛组培苗基部接种1.0×10⁷CFU/mL浓度的解淀粉芽孢杆菌Y15菌剂1mL,所有实验组培苗进行(25±1)℃恒温光照培养,每天连续光照12h,光照强度为2000lx。定期观察各组培苗的生长状况,90d后,观察组培苗的叶片数、株高、茎粗等,比较实验组与对照组的组培苗生长长势,判断菌株的促生效果。

结果显示，解淀粉芽胞杆菌Y15能够显著促进铁皮石斛的生长并且提高其有效成分含量。

表11解淀粉芽胞杆菌Y15对铁皮石斛生长的影响

注：不同小写字母者表示在0.05水平上差异显著。

实施例8解淀粉芽胞杆菌Y15菌剂处理的诱导抗逆性试验

方法：将参试番茄种子用10％H₂O₂表面消毒10min，无菌水洗净后晾干备用。

将催芽后的番茄种子播种于装有无菌土壤中盆砵中，每盆一粒，播种前保持土壤较为干燥。待番茄长到6叶期时，将悬浮好的解淀粉芽胞杆菌Y15生防菌剂以1.0×10⁷CFU/mL的浓度灌根施用于作物根部，随后置于温室中培养，1个月后进行断水干旱，干旱胁迫持续15d，干旱胁迫后正常浇水，观察番茄幼苗的恢复生长情况。每组处理48株苗，随机放置，共重复3次。在温室中按照完全随机区组设计摆放。

浇水进行恢复生长1d后，解淀粉芽胞杆菌Y15处理组植株恢复正常生长，而对照组植株全部死亡。

表12解淀粉芽胞杆菌Y15对番茄耐旱性的影响

注：不同小写字母者表示在0.05水平上差异显著。