甘蓝型油菜开花期基因BnFLC.A2和Bnflc.a2的克隆及应用的制作方法

本发明属于油菜分子育种技术领域，具体涉及包含甘蓝型油菜早花基因Bnflc.a2及其晚花等位基因BnFLC.A2的两条DNA片断的分离克隆、功能验证及应用。

背景技术：

甘蓝型油菜(Brassica napus L.)是一种异源四倍体作物，约7500年前由二倍体作物白菜(B.rapa)和甘蓝(B.oleracea)的自然杂交并通过天然加倍而形成(Chalhoub et al 2014)。甘蓝型油菜(B.napus)是一种重要的油料作物，在我国广泛种植。适时开花不仅影响着甘蓝型油菜的产量和品质，也决定了其对生态区域的适应性，因此开花期是甘蓝型油菜育种的重要目标性状之一。根据甘蓝型油菜的春化需求划分为冬性油菜、半冬性油菜和春性油菜，其中半冬性油菜主要分布在我国的长江流域，而春性油菜则主要分布于甘肃，青海，内蒙等省。目前，在实际生产中甘蓝型油菜和水稻、棉花等作物茬口矛盾突出，导致甘蓝型油菜种植面积大幅度下降，菜籽油的自给率严重不足。解决这一问题的关键就是缩短甘蓝型油菜的生育期，开展甘蓝型油菜早熟育种。前人研究表明甘蓝型油菜早花和早熟呈现出显著正相关，通过早花材料的选择可以选育出早熟油菜(Campbell and Kondra 1978；高永同1979；刘后利1985；Amiri-Oghan et al 2009)。因此，调控甘蓝型油菜适时开花，除了对其产量和品质具有重要意义之外还能够避免甘蓝型油菜同稻、棉争地的现状。

目前，甘蓝型油菜开花期研究仍集中在开花期QTL的定位工作上，成功通过图位克隆技术克隆甘蓝型油菜开花期基因的报道还很少。Ferreira等(1995)在很早就利用冬油菜Major和春油菜Stellar构建了DH群体，进行了在春化处理条件下和没有春化处理情况下的花期QTL的定位。他们共检测到3个QTL位点，其中位于LG9(N2连锁群)上的QTL位点在不春化、春化处理4周以及春化处理8周这三种条件下均和该群体花期显著相关；其中春化处理8周条件下，该位点可以解释表型变异的28％。Butruille等(1999)利用德国冬油菜栽培品种Ceres和澳大利亚春油菜品种Marno以及加拿大春油菜品种Westar构建了多个IBLs群体，他们用这些IBLs群体检测到多个与花期显著相关的位点，其中位于N2连锁群上的一个QTL位点可以解释表型变异的22.6％，该位点和Ferreira等人检测到的位于LG9上的花期QTL位点在同一个区间；此外，他们还检测到一个位于N12连锁群上的主效花期位点，该位点可以解释表型变异的26％。Raman等(2016)通过搜集182份甘蓝型油菜品种，在三种不同的环境下(大田环境、温室以及人工控制的环境)记录花期表型然后进行关联分析，他们共发现69个SNPs位点和花期表型显著相关，而且这些位点可以重复的检测到。

技术实现要素：

本发明人首次通过图位克隆技术成功克隆了甘蓝型油菜开花基因BnFLC.A2，而且通过比较测序，遗传互补实验以及表达实验证实了BnFLC.A2是一种甘蓝型油菜晚花基因。

此外，通过双亲比较测序，发明人在甘蓝型油菜中第一次发现了一个包含约2.8kb长片段插入的Bnflc.a2基因。通过Bnflc.a2基因的序列分析及表达分析证实该基因是一个功能缺失型突变。该基因的功能丧失导致了开花时间提早。通过自然群体分析表明Bnflc.a2中的长片段插入导致该拷贝功能丧失是影响甘蓝型油菜开花时间自然变异的重要因素，说明该基因具有重要的应用价值。

因此，本发明的目的在于从甘蓝型油菜中分离克隆早花基因Bnflc.a2以及晚花等位基因BnFLC.A2，并对这两个基因进行功能验证及应用。

为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验研究并不懈努力，最终从甘蓝型油菜中分离得到一种甘蓝型油菜晚花基因BnFLC.A2，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。

根据本领域的常规技术手段，本发明人可以采用已克隆的多核苷酸序列作为探针，从基因组或cDNA文库中筛选得到本发明的基因或同源基因。同样，采用PCR技术也可以从基因组和cNDA中扩增得到本发明的基因或任何一段感兴趣的核苷酸序列或与其同源的核苷酸序列。因此，在严格条件下与序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列杂交且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列也属于一种甘蓝型油菜晚花基因序列。

进一步地，上述任一一种核苷酸序列经核苷酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体也属于甘蓝型油菜晚花基因序列。

另外，本发明还提供了一种表达甘蓝型油菜晚花基因BnFLC.A2的蛋白，其氨基酸序列由上述任一一种核苷酸序列编码。进一步优选地，所述表达甘蓝型油菜晚花基因BnFLC.A2的蛋白，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

再者，本发明还提供了一种甘蓝型油菜早花等位基因Bnflc.a2，其核苷酸序列选自以下的任意一种：

(1)序列表中SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；

(2)与(1)限定的核苷酸序列经核苷酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。

最后，本发明还提供了上述的甘蓝型油菜晚花基因BnFLC.A2在油菜生育期改良中的应用。以及，上述的甘蓝型油菜早花等位基因Bnflc.a2在油菜早花、早熟改良中的应用。

与现有技术相比，本发明首次提供了一种甘蓝型油菜晚花基因BnFLC.A2和一种甘蓝型油菜早花基因Bnflc.a2，早花隐性基因Bnflc.a2是BnFLC.A2基因的功能丧失突变体。本发明开发早花基因的功能标记，通过甘蓝型油菜495份自然群体基因型及花期表型分析发现，Bnflc.a2基因在自然群体中对开花期的影响在七个环境下均表现出显著水平，说明Bnflc.a2中的长片段插入导致该拷贝功能丧失是影响甘蓝型油菜开花时间自然变异的重要因素。利用该基因本身的序列设计功能标记进行分子标记辅助选择选育早花材料进而培育出早花、早熟油菜，具有准确、高效、经济的特点。

附图说明

图1：本发明鉴定、分离、克隆并验证甘蓝型油菜早花基因Bnflc.a2以及晚花等位基因BnFLC.A2的技术流程图。

图2：BnFLC.A2基因效应下的双亲开花期表型示意图。图2A为播种后第99天拍摄的L06、F1和L04表型图；图2B为播种后第136天拍摄的L06、F1和L04表型图；标尺，10cm。

图3：NIL-F2群体开花期表型分布图。图3A为冬油菜环境下NIL-F2开花期表型分布图；图3B为春油菜环境下NIL-F2开花期表型分布图。

图4：特异标记STA2-18鉴定白菜、甘蓝、双亲及NIL-F2小群体。检测样品依次为22份白菜、11份甘蓝、L06、L04、NIL-F2(15-43)及另外两份甘蓝型油菜R15和R11。其中NIL-F2小群体的花期表型数据在目标带下面，-表示数据缺失；M表示DL2000marker。

图5：覆盖甘蓝型油菜开花期基因BnFLC.A2区段的物理图谱。图中分子标记下面的数字表示在近等基因系群体中检测到的BnFLC.A2基因位点与分子标记之间发生重组交换的单株数目。

图6：双亲比较测序目标基因BnFLC.A2。图6A和图6B分别表示引物组合STA2-6L/STA2-6R，STA2-55L/STA2-1R，STA2-1L/STA2-42R，STA2-8L/STA2-8R的位置示意图及该四对引物组合在双亲L04和L06及另外两个材料R15和R11中扩增图；以上四对引物是根据甘蓝型油菜Darmor-bzh的参考基因组序列将目标候选基因BnFLC.A2及其上下游区间设计成四段进行扩增；图6C和图6D分别表示引物组合STA2-13L/STA2-17R和STA2-17L/STA2-13R的位置示意图及该两对引物组合在双亲L04和L06及另外两个材料R15和R11中扩增图；图6C蓝色箭头指的是目标带，而红色箭头指的是包含长片段插入的条带；图6E和图6F分别表示引物组合STA2-55L/STA2-46R，STA2-54L/STA2-54R STA2-45L/STA2-1R，STA2-1L/STA2-42R的位置示意图及该引物组合在双亲L04和L06中扩增图；以上四对引物是根据L06中测得的Bnflc.a2基因序列设计成四段进行扩增。M1代表DL2000marker，M2代表1Kb DNA ladder marker。

图7：转基因所用的功能性载体图pFGC5941骨架。

图8：T1代株系及双亲花期表型示意图及花期数据统计图。图8A为双亲L06，L04以及转基因T1代阳性和阴性单株表型；图8B为双亲L06，L04以及4个单拷贝株系BnA2-2，BnA2-10，BnA2-14和BnA2-37的T1代阳性和阴性单开花期数据表型。–和+分别代表单拷贝株系T1代中的阴性单株和阳性单株。花期数据用平均值±标准误表示。***表示P<0.0001。标尺，10cm。

图9：候选基因启动子分析载体的结构示意图。

图10：拟南芥T2代遗传转化植株花蕾GUS染色结果。图10A-10D为野生型对照，图10E-10H为BnFLC.A2基因启动子转化苗各部位染色GUS染色结果，图10I-10L为Bnflc.a2基因启动子转化苗各部位染色GUS染色结果。

图11：冬油菜环境下BnFLC.A2基因和Bnflc.a2基因的表达图片，使用的材料是L04和L06。图11A为RT-PCR(32个循环)检测L04和L06中不同时期BnFLC.A2基因的表达；图11B，图11C和图11D分别表示qRT-PCR分析L04和L06中不同时期BnFLC.A2，BnFT和BnSOC1的表达情况。样品1-8分别表示播种后第34d，76d，83d，105d，124d，132d，150d和174d时取样。BnACTIN7基因的表达作为对照。每个取样点均有三次生物学重复(平均值±标准误(SEM))。

图12：Bnflc.a2基因的功能标记分析自然群体中开花期变异。根据Bnflc.a2基因型分组，开花期差异在七个环境下达到显著水平。Bnflc.a2-表示被检测的材料不包含Bnflc.a2基因，Bnflc.a2+表示被检测的材料包含Bnflc.a2基因。开花天数是用开花期均值±标准误(s.e.m.)表示。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步定义本发明，并描述了本发明在上述前期工作基础上分离克隆包含有BnFLC.A2基因以及Bnflc.a2基因完整编码区段的DNA片段和验证这两个基因的方法(技术路线如图1所示)。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明的保护范围以权利要求书为准，不受下面公开的具体实施的限制。下述所使用的实验方法若无特殊说明，均为本技术领域现有的常规方法和技术，所使用的试剂配方或材料，均通过商业途径得到。

实施例1：构建BnFLC.A2基因的近等基因系并初步定位该基因

1.实验材料

本实验所用的材料为甘蓝型油菜高世代近等基因系材料：晚花材料L04和早花材料L06(图2)。材料来源：利用两个甘蓝型油菜纯系材料HZ396E和Y106作为原始亲本杂交，并用HZ396E作为轮回亲本连续回交五代之后自交得到高世代分离群体，发现花期分离，我们从中选择一个早花纯合型材料，并命名为L06和一个晚花纯合型材料，并命名为L04。冬油菜环境下多年田间观察该NILs材料花期稳定，其中早花材料L06播种后93天左右开花，而晚花亲本L04播种后135天左右开花，二者花期差异达到42天。利用L04和L06作为亲本杂交并自交构建NIL-F2分离群体，用于该开花基因的定位。

2.NIL-F2分离群体花期表型考察

通过2014年冬油菜环境和2015年春油菜环境条件下NIL-F₂群体的开花期表型分布图进行统计发现：2014年冬油菜环境下，NIL-F2群体花期分离经卡方检测表明晚花和早花分离符合3:1的分离比(χ²＝3.20，P＝0.064)(图3A)，2015年春油菜环境下，NIL-F2群体花期分离经卡方检测表明晚花和早花分离符合3:1的分离比(χ²＝1.16，P＝0.24)(图3B)。各NIL-F₂群体开花期表型均符合一对主基因控制的孟德尔遗传定律，说明该群体中开花期表型是由单个基因控制，因此，可以通过构建大群体对该位点进行精细定位，进而确定候选基因。

3.初步定位晚花基因BnFLC.A2

为了确定该开花期QTL的位置，我们从本实验室公共引物中挑选了共计400对SSR引物，这些引物均匀分布在甘蓝型油菜19条连锁群上。首先我们利用双亲筛选有多态性的引物，然后用一个NIL-F₂分离群体来验证这些引物是否与开花期表型连锁。通过这一策略我们发现SRA2-6，SSA2-2，SSA2-6，SRA2-31这四对引物与该NIL-F₂分离群体的花期表型连锁，花期差异均达到极显著水平(表1)，以上四对引物序列如表2所示。针对该NIL-F₂分离群体，我们利用Mapmaker3.0进行局部遗传连锁图谱的构建。同时结合群体表型利用QTL 1.1软件进行QTL扫描。结果表明该花期QTL位点位于SSA2-2和SSA2-6之间，该位点解释了96.4％的表型变异，加性效应为18.96天，LOD值为58.1，说明该群体中花期性状只受一对基因控制。

表1 NIL-F₂分离群体验证连锁标记

表中花期均值表示该F₂群体中标记基因型和L06相同的所有单株花期的平均值，以及标记基因型和L04相同的所有单株花期的平均值。开花期是用花期均值±标准误表示。

表2连锁标记引物序列

通过上述四对标记的序列比对发现该开花基因更可能位于A2染色体(表3，表4)，此外，我们同时开发了一个能够特异区分A2/C2的SCAR标记STA2-18(图4)，进一步验证目标基因位于A2染色体上，本研究中该位点命名为qFT-A2。我们利用两侧最远的标记SRA2-6和SRA2-31的序列将qFT-A2限定在对应白菜A2染色体约1Mb的物理区间内。

表3连锁标记引物序列与白菜及甘蓝基因组比对情况

表中位置表示左引物序列比对的位置，-表示引物没有比对到基因组上。

表4连锁标记引物序列与甘蓝型油菜基因组比对情况

表中位置表示左右引物序列比对的位置，*表示引物没有比对到基因组上。

实施例2：精细定位晚花基因BnFLC.A2

1.分子标记的开发

根据初定位结果，我们针对两侧最远的标记SRA2-6和SRA2-31之间的区间，以白菜基因组A2染色体序列为参考序列，针对共约1Mb的物理区间开发了119对SSR标记。通过双亲L06和L04筛选有多态性的标记即可用于大群体基因型分析，通过标记筛选，共筛选到有多态性的SSR标记28对。从这28对SSR标记中挑选出均匀分布在目标区间且带型较好的10对SSR标记用于后续群体分析以及交换单株基因型的鉴定。这些标记的序列信息见表5。

表5精细定位标记序列

2.BnFLC.A2的精细定位及候选基因预测

为了进一步缩小目标区间，2014年10月初我们在武汉冬油菜环境下又种植了2065株的NIL-F₂大群体，用于qFTA2-1位点的进一步精细定位。和前面的思路一样，首先我们利用两侧标记SRA2-6和SRA2-31分析该群体的标记基因型，共鉴定出了66株可能的交换单株；其中标记SRA2-6一侧有14株，标记SRA2-31一侧有52株(图5A)；接着将该区间的其他标记直接检测这66株交换单株，经过分析发现这66株交换单株只有14种交换类型(图5B)；最终发现在标记SRA2-77一侧有2个交换单株，标记SRA2-114一侧有1株交换单株；而标记SRA2-80，SRA2-81，STA2-18，SSA2-6和SRA2-86均和目标基因共分离(图5A和5B)。2015年5月我们将这66株交换单株中共计14种交换类型各选1株的自交后代送往甘肃种植，并记录花期表型进行交换单株的后代验证，其他交换单株于2015年10月种植于武汉并记录分离情况。最终通过交换单株后代验证将qFT-A2位点限定在标记SRA2-77和SRA2-114之间(图5B)，序列比对分析表明，该区间参照甘蓝型油菜基因组A2染色体约86kb的物理区间，该区间内包含23个候选基因(图5C)。为了进一步缩小候选基因的范围，我们将这23个候选基因对应的白菜和拟南芥同源基因全部标注出来，并进行功能注释，分析发现该区间仅有一个候选基因BnaA02g00370D基因是拟南芥中开花基因AT5G10140(FLC)的同源基因(图5C)。FLC基因是拟南芥春化途径中调控开花的关键基因，因此，我们初步确定目标候选基因为拟南芥春化途径过程中的FLC基因，在本研究中将其命名为BnFLC.A2。

实施例3：比较测序确定BnFLC.A2等位基因间的自然变异

为了进一步确认候选基因，我们根据甘蓝型油菜A2染色体目标区间候选基因BnaA02g00370D基因及其上下游的参考序列我们设计了特异引物，分别扩增目标候选基因BnFLC.A2编码区及其上游启动子区和下游区间。我们用这些引物分析了双亲L04和L06，其中标记STA2-6L/STA2-6R扩增的是BnFLC.A2基因起始密码子上游一直到上一个基因的最后一个外显子，理论大小约2.3kb；STA2-8L/STA2-8R扩增的是BnFLC.A2基因终止密码子下游一直到下一个基因的第一个外显子，理论大小约2.4kb(图6A)；针对BnFLC.A2编码区我们设计了两对引物扩增，分别是STA2-55L/STA2-1R(理论大小约1.6kb)，STA2-1L/STA2-42R(理论大小约1.9kb)(图6A)。我们利用各对引物进行扩增双亲L04和L06时发现：和晚花亲本L04相比，早花亲本L06中BnFLC.A2编码区前半段STA2-55L/STA2-1R没有扩增产物(图6B)，说明早花亲本L06中BnFLC.A2编码区前半段序列有变异，因此没有扩增产物。而其他三对引物组合在双亲中均能扩增出目标带，我们将双亲L04和L06所有能扩增出的片段进行了TA克隆测序。对L04来说，将四段序列进行拼接进而得到了该材料中BnFLC.A2拷贝的序列。针对早花亲本L06，为了找到变异所在，我们改变了策略，将目标基因BnFLC.A2编码区以及上下游共约8kb的区间分成两段长片段，分别设计了引物STA2-13L/STA2-17R和STA2-17L/STA2-13R，理论扩增产物大小分别是3.8kb和4.2kb(图6C)。扩增结果发现，早花亲本L06中引物组合STA2-13L/STA2-17R扩增出一条长约6.6kb的片段；而L04中STA2-13L/STA2-17R引物组合扩增产物除了目标3.8kb的条带，也扩增出了一条较弱的约6.6kb的片段(图6D)。理论上引物组合STA2-13L/STA2-17R扩增片段只有3.8kb大小，而在L06中却扩增出一条6.6kb的片段，因此说明这段序列存在较大的变异。L04中也有一条与L06大小相近的6.6kb的条带，该条带很弱，回收产物浓度太低，因此没有对其进行克隆测序。而针对L06中6.6kb大小的扩增产物，我们按照同源重组一步法克隆的要求，通过同源重组酶将该片段连接到载体PFGC5941上面，然后进行克隆转化，并选择阳性克隆L06-13L/17R-01和L06-13L/17R-03这两个克隆进行测序。利用同样的方法把L06中另外一段片段(4.2kb)STA2-17L/STA2-13R克隆转化之后进行测序。最终将这两部分序列拼接进而得到L06中目标候选基因编码区及其上下游的序列，我们把L06中的等位基因型记为Bnflc.a2(图6E)。在完成L06中Bnflc.a2及其上下游序列的拼装之后，有了该拷贝完整的序列作为参考，我们又在该序列的基础上设计引物STA2-55L/STA2-46R(1.577kb)，STA2-54L/STA2-54R(1.762kb)，STA2-45L/STA2-1R(1.264kb)结合之前的引物组合STA2-1L/STA2-42R(1.954kb)共四对引物将该拷贝分成四段分别在L04和L06中进行扩增(图6F)，然后将扩增片段回收并进行TA克隆测序，得到的序列分别进行拼接之后发现L04中得到的Bnflc.a2拷贝的序列和L06中Bnflc.a2拷贝的序列完全一致。比较测序所用的引物序列信息见表6。

表6比较测序引物序列

实施例4：BnFLC.A2基因的转基因互补实验

1.转基因载体构建

根据之前候选基因预测以及双亲比较测序结果，我们以晚花材料L04基因组DNA为模板，利用引物STA2-13L/STA2-13R(引物序列见表6)扩增BnFLC.A2基因全长7.645-kb(包含上游2.195kb，编码序列3.259kb及下游2.191kb)序列，选用高保真酶Phanta^TMSuper-Fidelity DNA Polymerase(诺维赞，南京)进行扩增。之后连接到表达载体PFGC5941(图7)上面。PCR扩增体系(总体积20μl)如下：

模板DNA：2μl

5×SF Buffer：4μl

dNTP：0.4μl

左引物：0.8μl

右引物：0.8μl

DNA Polymerase：0.4μl

ddH₂O：11.6μl

PCR反应条件如下：95℃，2min；95℃，10sec，60℃，10sec，72℃，4min，35个循环；72℃，10min；20℃，5min。通过1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，并对目标片段进行挖胶，挖胶后使用Promega的琼脂糖胶回收试剂盒(http://cn.promega.com/)回收DNA。与此同时提取载体PFGC5941质粒DNA，直接用Fermentas(Thermo Scientific，http://www.thermoscientificbio.com)快速限制性内切酶EcoRI和SmaI进行双酶切，双酶切体系如下：

模板DNA：5μl

EcoRI：0.5μl

SmaI：0.5μl

FD Green Buffer：1.5μl

酶切反应在37℃的恒温箱中进行，酶切时间为2h。载体PFGC5941质粒酶切后再通过琼脂糖凝胶电泳检测回收酶切后的质粒并通过Promega的琼脂糖胶回收试剂盒(http://cn.promega.com/)回收质粒DNA。然后将目标片段和线性化的PFGC5941质粒利用诺唯赞重组克隆试剂盒(ClonExpress^TM II)通过同源重组的方法将该序列连接到PFGC5941载体上并通过热激转化法转入大肠杆菌感Top10的感受态细胞中用于测序。选择测序完全正确的单克隆扩大培养保存菌种，并利用质粒提取试剂盒(Plasmid mini Kit,OMEGA)提取质粒，并进行EcoRI和SmaI双酶切检测。将构建成功的载体利用电击转化法将其转入农杆菌感受态细胞GV3101中，涂布于含有三种抗生素(利福平、庆大霉素和卡那霉素)的LB平板上。挑取平板上生长的单克隆扩大培养后提取质粒并进行EcoRI和SmaI双酶切检测，最后选择6个阳性克隆活化并保存于-70℃备用，我们将从L04中扩增的BnFLC.A2基因构建的载体分别命名为PFGC5941-L04-BnFLC.A2。

2.BnFLC.A2转基因流程

1)无菌受体材料的准备

选取饱满、干净的油菜种子用75％乙醇浸泡1min，然后在0.1％升汞中灭菌10～15min，无菌水冲洗4～5次，用无菌滤纸吸干多余的水分，接种于发芽培养基上，25～28℃下置于纸盒子中暗培养一周。

种子发芽培养基

2)受体材料的预处理

取4～6d的无菌苗子叶或下胚轴作为转化受体。用解剖刀切下完整的子叶(带1～2mm子叶柄)或下胚轴(5～10mm)，将切下的外植体置于预培养基NMS1上进行预培养3d即可进行接种浸染。

预培养培养基：NMS1

3)供体菌株培养

a.固体培养基和液体培养基的配制：此处给出常用LB培养基(Luria-Bertani)培养基的配制方法。

LB液体培养基：称取胰蛋白胨(bacto-tryptone)10g，酵母提取物(bacto-yeast extract)5g，NaCl 10g，溶于800ml去离子水中，用1mol/L NaOH调节pH至7.0，加入去离子水至总体积为1L。高压蒸气灭菌20min。

LB固体培养基：在LB液体培养基每升中加入细菌培养用琼脂粉(bacto-agar)12g，高压蒸气灭菌后，待溶液冷却至60℃左右时，加入Kan(使终浓度为50mg/L)，Gen(硫酸庆大霉素，终浓度50mg/L)和Rfi(利福平，终浓度50mg/L)旋转混匀(避免产生气泡)，从烧瓶中倾出培养基至培养皿内，90mm直径的培养皿约需20ml培养基。完全凝固后，应倒置平皿并贮存于4℃备用。使用前1～2h应取出贮存的平皿。

b.单菌落农杆菌的培养：取出-70℃长期保存的菌种管，置于冰上，在无菌条件下，用接种针刮取冻结的培养物表面，迅速把黏附在接种针上的农杆菌划线于含50mg/L Kan+50mg/L Gen+50mg/L Rfi的LB琼脂平板表面。菌种管重新置于-70℃保存。将接种的琼脂平板在28℃下暗培养36～48h。

c.农杆菌扩增液体培养：用灭菌的牙签从琼脂平板上挑取生长良好的单菌落，接种到液体LB培养基(加入50mg/L Kan+50mg/L Gen+50mg/L Rfi)中，28℃振荡培养(200r/min)过夜(16～18h)，使农杆菌培养至对数生长期，OD₆₀₀值达0.4左右。

d.以小型离心机6000r/min转速离心2ml离心管中装有的菌液，5min后收集菌体，用MS液体培养基洗2次，再用MS液体培养基(添加100μmol/L AS，pH 5.4)重悬菌体，调OD₆₀₀至0.4左右，轻微振荡培养2～3h备用。

4)浸染

于超净工作台上，将培养的根癌农杆菌液倒入无菌培养皿中(可根据材料对菌液敏感情况进行不同倍数的稀释)。取出经过预培养的外植体，放入菌液中，浸泡30min(不同材料处理时间不同)，用无菌滤纸吸干外植体表面的菌液。

5)外植体与农杆菌的共培养

将浸染过的外植体接种到铺有一层无菌滤纸的共培养基(即NMS1培养基上面盖张滤纸)，光照培养室内暗培养2天。

6)脱菌筛选培养基

将经过共培养的外植体取出后用无菌滤纸吸干或在超净工作台上吹干多余的水分，下胚轴平放于脱菌筛选培养基NMS3上进行脱菌培养7～10d。

选择培养基：NMS3

灭菌后降至50℃时加入

Carb 1ml

PPT 50μl

7)诱导愈伤培养基

将NMS3上放置一周后的外植体(两端略微出现膨大，有的可能出现绿色愈伤)转移到诱导愈伤培养基NMS4，此过程经历2周之间，中间要继代一次。

诱导愈伤组织培养基：NMS4

灭菌后降至50℃时加入

Carb 1ml

PPT 50μl

AgNO₃ 100μl

8)诱导出芽培养基

将NMS4上两端出现绿色愈伤组织的外植体转移到诱导出芽的培养基NMS5(MS+3mg/L BAP+2mg/L Zeatin+30g/L Sucrose+5.5g/L Phytal-胶+500mg/L Carb+10mg/L PPT)上直至芽出现。此过程经历时间最长，中间继代2-3次。

诱导芽的培养基：NMS5

灭菌后降至50℃时加入

Carb 1ml

PPT 50μl

9)芽延长培养基

将NMS5培养基上愈伤组织分化出的芽组织用刀从其与愈伤的粘合处切下置于NMS6培养基上，直至芽生长到1-2cm。

芽延长的培养基：NMS6

灭菌后降至50℃时加入

Carb 1ml

PPT 50μl

10)生根培养基

将延长的芽组织转移到生根培养基中直至生根。

生根培养基

灭菌后降至50℃时加入

Carb 500μl

经过遗传转化，PFGC5941-L04-BnFLC.A2载体共得到66株独立转化的T₀代转化苗，编号为BnA2-1-BnA2-66；经检测共得到T₀代阳性单株48株，最终只有只有11个T₀代阳性株系收获到比较多的种子可以用于T₁代分析；我们分析了这11个阳性株系的T₁代发现只有4个单拷贝阳性株系，分别是BnA2-2、BnA2-10、BnA2-14和BnA2-37，这四个株系中转基因T₁代阳性单株的花期显著晚于转基因T₁代阴性株系，晚开花23到30天(图8)；并且其T₁代共分离检测发现，开花期和相对表达量之间在0.001水平上显著相关(r＝0.793)(表7)；以上结果最终确认BnFLC.A2基因就是qFT-A2的目的基因。

表7 BnFLC.A2转基因T₁代共分离检测

实施例5：BnFLC.A2基因的启动子分析

前期比较测序发现BnFLC.A2和Bnflc.a2的启动子区间仅在起始密码子上游1.8kb的位置存在3个单碱基的变化，我们推测该变异对启动子的功能没有影响。为了验证这一推测，此外，为了探究目标基因的表达模式，我们将BnFLC.A2和Bnflc.a2的启动子序列通过酶切连接的方法连接到表达载体PMDC162(图9)上面，分别构建了P_BnFLC.A2:GUS和P_Bnflc.a2:GUS启动子连接GUS载体。通过农杆菌介导的花序侵染法将目标载体转入拟南芥Col-0生态型植株中，待收获到种子之后，利用含有潮霉素抗性的筛选培养基对种子进行筛选，存活下来的苗子移到土里种植并取样检测。针对P_BnFLC.A2:GUS载体共筛选得到11株阳性苗，而P_Bnflc.a2:GUS共筛选得到16株阳性苗。我们选取两个载体阳性转化苗的T2代，并在各个生长阶段取样进行GUS染色分析。GUS染色结果表明，BnFLC.A2和Bnflc.a2的启动子均具有功能，而且具有相似的功能。通过启动子GUS表达分析实验，我们证实了Bnflc.a2拷贝的启动子是具有正常功能的，而在早花亲本L06中却检测不到Bnflc.a2的表达(图10)，说明不是启动子区间的变异导致的Bnflc.a2功能丧失，结合比较测序的分析结果进一步表明可能是长片段插入之后，导致Bnflc.a2的转录发生紊乱，进而检测不到该拷贝的表达。

实施例6：BnFLC.A2基因及其等位基因的表达分析

2014年10月我们将双亲L06和L04播种在湖北武汉冬油菜环境下，我们在播种后第34天开始取样，然后每隔一段时间继续取样直至晚花亲本L04花期结束。该过程从秋末到春天，跨越了整个冬季，一共取样8次，分别是播种后第34天，76天，83天，105天，124天，132天，150天，174天。所有样品取样结束之后提RNA并进行表达分析。我们对冬油菜环境下不同时期的样品进行了表达分析实验。如图11A所示，RT-PCR检测结果显示，与L04相比，L06中均检测不到目标基因的表达；而L04中BnFLC.A2的表达量呈现逐渐降低的趋势。为了更准确的反应出双亲中BnFLC.A2的表达趋势，我们利用荧光定量PCR(qRT-PCR)分析了BnFLC.A2在不同阶段样品中的表达情况。如图11B所示，只有晚花亲本L04中可以检测到BnFLC.A2的表达。在播种后第34天时，属于秋末时期，该阶段还没有连续的低温，因而，BnFLC.A2表现出较高的表达水平，随着冬季的到来，气温逐渐降低，BnFLC.A2的表达水平呈现出逐渐降低的趋势，冬季结束之后，气温回升，然而BnFLC.A2依旧维持在非常低的水平。同时，我们分析了成花素基因BnFT的表达情况，如图11C所示，播种后第34天时，L06和L04均处于非常低的水平，随着植株的生长，早花亲本L06中由于没有BnFLC.A2基因的抑制，BnFT基因很快就能够表达到一个很高的水平；而晚花亲本L04中由于BnFLC.A2基因的抑制，BnFT基因前期一直在一个很低的水平，直到第105天时才开始逐渐上升表达。对比发现，晚花亲本L04中，BnFLC.A2和BnFT呈现出相反的表达趋势，这和拟南芥中的研究结果相似。接着我们分析了BnSOC1基因在双亲中的表达情况，如图11D所示，同样由于早花亲本L06中由于没有BnFLC.A2基因的抑制，BnSOC1基因很快就能够表达到一个很高的水平；而晚花亲本L04中由于BnFLC.A2基因的抑制，BnSOC1基因表现出逐渐升高的趋势。这一过程同双亲中BnFT基因的表达模式类似。综上所述，说明在甘蓝型油菜中BnFLC.A2仍然可以通过抑制BnFT和BnSOC1的表达来达到抑制开花的作用，说明这一调控开花的机制在甘蓝型油菜中具有一定的保守性。

表达实验引物序列：

qBnFLC.A2-L 5’GCGATAACCTGGTCAAGATCC 3’

qBnFLC.A2-R 5’CTCCAGCTGAACGAGGGAG 3’

qBnFT-L 5’TAACAGAGATCCTCTTGTGGTAGG 3’

qBnFT-R 5’CCACCAATCTCAACTCTTGGC 3’

qBnSOC1-L 5’AGAGAATGCAACAAGCAGACAAG 3’

qBn SOC1-R 5’TGATCAGAGAAACTTCAGCATCAC 3’

BnACTIN7-L 5’GGAAGCTCCTGGAATCCATGAGA 3’

BnACTIN7-R 5’TCTTTGCTCATACGGTCAGCAATTCC 3’

实施例7：自然群体中分析Bnflc.a2基因对开花期的影响

为了检测Bnflc.a2基因在自然群体中的分布情况以及对开花期的影响，我们分析了一个包含495个甘蓝型油菜不同品种及自交系材料的自然群体，该群体来自于Xu等(2016)用于甘蓝型油菜开花期关联分析的群体。我们针对该基因设计了特异引物STA2-55L/STA2-46R用来检测Bnflc.a2基因在自然群体中的分布情况，统计495份材料的检测结果发现59份材料中包含有Bnflc.a2基因，结合开花期表型进行单标记分析发现8个环境下有7个环境开花期差异达到显著水平(图12)。由该实验结果可知，Bnflc.a2基因在该自然群体中分布较少，仅占有约12％的比例；通过Bnflc.a2基因与开花期的关联分析表明：Bnflc.a2基因在自然群体中对开花期的影响在七个环境下均表现出显著水平，说明Bnflc.a2中的长片段插入导致该拷贝功能丧失可能是影响甘蓝型油菜开花时间的自然变异的重要因素。

特异引物序列：

STA2-55L 5’GCTTCTCGGAGACAGAAGCC 3’

STA2-46R 5’TCAGAGTGGAAGACAAATGATGC 3’。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉联农种业科技有限责任公司；华中农业大学

<120> 甘蓝型油菜开花期基因BnFLC.A2和Bnflc.a2的克隆及应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5624

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）

<400> 1

gaggaggaag agctcatcgt gcttaatgtc ttcatcgaag caaaccaaga attgaaaact 60

attttagcat aaagtaacga atgatgatta gaataacaca gtatttaatg ctacaggtgg 120

tatgagtaat gaactagatg ttgctgtttt tattatcggg aatatatttc cccactttat 180

catttctatt ctattttatc ttctcgcgtt ctaaagttga atgttctgta accattaaaa 240

actaataaaa ttttaacaat ttaaaaagga taattgacat atccagaaat atggaaagcg 300

ggtgagatga ttggataaaa accatgccgt acattcaccc atcgattcgt ataagtacgt 360

ttcgcattaa gtttataata ataaatatag tattttctct gccacataat ttagcatata 420

gggttaatac atttcccttc tctccacaaa cgtttagttt atcgtatagg aaaattgcat 480

catctttaac tttgtagctc tttgttgggg atttttggta tacgaccttt gtgtaagttg 540

tttcttgggt ttgtattggc tcagttgcag ttttcacctg tttttggtat taatatattt 600

ttcaagttga caaaaaaaaa aaaacttttc atcctacatt atatagacga ttataatggg 660

attgcgcaaa attctaaaca aaaattaaat actaactttt gtatactatt ttctaaaaca 720

tctaaaaaat acattagtga gaacaatgtc tattaagtaa caatgtcaat taaacaacga 780

attcaacata ttaagaatat aaatttatca aaaaaaagtg ggccaaaatc tccaaatttc 840

atccttgtat aaataaagag agattttttt ctggacaaag tataaataaa gagatatttt 900

gcctaaaata gaggataaaa attatttagg caacatgttt tgaacaacca cagtgaaaca 960

aacaaaaata cattcgtcta ggcaacgagg catgtcatct aagcacatgg gctattttct 1020

aggcgcgcat cacctctcat gtaggcatcg cctactatct agttataact aatactacaa 1080

tctttttatg tttttcttcc tacttcagac ctcacatgaa agtttgcctt aaatccatca 1140

tcaaattgta cgtgccaaat tcagattaaa caattagagt ggcatatcaa acatctaaat 1200

acactagccg tccacgctaa atattctctt tggcagaaaa ataacaatca ttgttagtgg 1260

ttattcagat tggactcaga tcgaattcag acgaaatgag taatagtagt atttatatat 1320

caaactgtcc aatagatatt taagaatttt ggtttatgtt tattttttaa tcctaacaat 1380

tggtctgact tgtaggaagt aaaatattga atatgcaaga aacgaagaga aacaaaaatg 1440

tgggttaaat aaaaactctc atgtataaga agtaagataa actaaaattt ataagatcta 1500

aagagaaaaa ttaacgcctt atagacaaaa aaaaaccagt aaattttgtg ctaaataagc 1560

aaattgaaag gtttgtaggt tggctttagg tcaagttata ttattagaca cgtacgttag 1620

gtcaagttgt ctatattagt caggagtttc agtttggtca gcagattgga aaataaataa 1680

ccagatttta taacgaagtt tatgtatatt tgtcgtttaa gttataagta tagtgtaatg 1740

tgtgtaaaaa gtttgtttta agtagtatag tgtattctat tctttttggc aacagttctg 1800

cattagttaa gatataattt tccatagtat ttgagatcta accatgtaat ataacttgaa 1860

atttgaaaac ttgataaatt attcgataaa agataataaa ggcaagaggc aagagccaac 1920

gagggaactc gtcatgcggt acacgtggct gtcttgtccc tgaaccacat tggttctttc 1980

tacgaatttt tattttcatc tctctcgttt accctaataa aaagtggccc gagggagaaa 2040

aaggagagac acaaaaagaa agaaataaaa gcaaaaaaga aagaaaataa aagcaaaaat 2100

aagaaagaac aaaaaacgct cagtatctcc ggcgagagtt gaaaccgaac ctcaggatca 2160

aattagggca caaaggcttc tcggagacag aagccatggg aagaaagaaa ctagagatca 2220

agcgaattga gaacaaaagt agccgacaag tcaccttctc caaacgacgc aatggtctca 2280

tcgagaaagc tcgtcagctt tcagttctct gcgatgcatc cgtcgctctt ctcgttgtct 2340

cagcctccgg caagctttac aacttctccg ccggcgataa gtatgacttc tcctcttctg 2400

ggtcttcctt tatttgccct tttcgcttcc gttcctcttc tctttactat ttataggaaa 2460

ataaaataaa gtacaaataa aataaaataa aaaattaaaa gacactttga ttttccggca 2520

gatctcatgt ggatttctcg gttttgtgtt tgttattgtt tcttctatga acatgagaga 2580

tacatgaggt aaccagattt gagaaagaac aatgtcctga tgagctaaag cttcttactt 2640

tgttcatttc tctctctcaa tctttttctg catggatttt tttttttttt gtaaaaaaga 2700

ttgcatgtta ttcaaggtct tttgataagc tgtgatgcat acttgatgtt gtgtagtgaa 2760

gtttcaatac atctttgatt gtttaattgg atttaggact cctaattaag tatctgaaga 2820

gttccttatc agaatgagta ttagtggttt tctttttaga gtaattttgg tcgatggatc 2880

tcttgatttg taatgcaatg cacttcgggg agatctataa aaaatgtggg attaatgctt 2940

aataatagat taagagtttt aattcgaatg tatgccacat tttgcagcaa atgtgaactc 3000

cgtagaactc cttaagtatc tgaagagttc attataagaa taaataatga ttaatgtttc 3060

tatttttaga gtaattcaag tcaatgaatc tcttggagtt cgatgcaatg cacttcgggg 3120

agatctataa aattgatgta ggattaatgc agaataatag atcaagagtt ttaatatgaa 3180

tgcatatatg ccacattgtg cagccattaa cttaaaaaga taattgtaga tcttcaaaaa 3240

aaaattacct ctttgccatg gatttattgc ttgaagatta tccaaattat aaggctacta 3300

gttggttctt agtatccaca tatatgtgta aagtaatttt gaaatttggt agatttaaga 3360

aaactcagcc tcacaattag tacttaacca cacatatgct acactactta tgttctccgc 3420

gatcgccatt acaatggtgt tgaacaagga ttagctagtt gttttgatct taacttattt 3480

tgttttgtct cctcttcagc ctggtcaaga tccttgatcg atatggaaaa caacatgctg 3540

atgatcttaa agctctggta atacaaattt tttgaattag tcctgatgca gttttaagag 3600

taattagtgc ctagagggct ccatacatac tggtcaaagc caacacatgt ttaggacttc 3660

aaaactgtgg agatctagat tagagttatt gcattattga tccactcatg agccattagt 3720

tcgtcaaaag atcctatgtg aggctgtgga tccgcatgca ttcccagttt ctcaaatccc 3780

ttgttttaat tgcctattct atcccttctc cgtggacagg atcttcagtc aaaagctccg 3840

aagtatggtt cacaccatga gctactagag cttgtcgaaa ggttagtatt gtctaagact 3900

tttttttgct ctcctccttt gatgacaaag gaattagtgt ttcttggcaa actattaata 3960

tttgcagtaa gcttgtggaa tcaaattctg atgtaagcgt cgactccctc gttcagctgg 4020

aggaccacct tgagactgcc ctctccgtaa ctagagctag gaaggtacgt tcactacaaa 4080

atctcttttt ttttcttact ttcagagcgc ttatatttaa tccgttgcag acagaactaa 4140

tgttgaagct tgttgatagc ctcaaagaaa aggttagata tcttatttta tagcacttaa 4200

ttagatatct taccttgtgt cgagagcctc aaaacttttg cgtattgtat tagtttccct 4260

aagtgtgctt tatgagctgg caaatctaca ttaaacttct tcacagttca tgtagtcttt 4320

ttggggatga tgcaaatgat ttgggttcta gaatctgaaa ttaggtttag aaacttggta 4380

agtgataatc atgttgacct ttaaaacagg agaaattgct gaaagaagag aaccagggtt 4440

tggctagcca ggtaacaaag ctacattctt catatatgca aaagctaaca agcactttta 4500

cacatactct tatacttgca gatataacat gtacaataga tattatactt aaggtattat 4560

agaaaagaat atgtcgagat tagggcattt tggtttatct taattttgat gagagtatta 4620

ctgtatgaaa accaaaaatg attggtctgg atttggttgg ggaaaatttt ggtttggttc 4680

taatttggat tattataaat tagtaaaaca gttaaaaccc taacgctaaa agtaaaacct 4740

aaactctgtc ataaacctta atacttcaac aaaagtctta aaccctaatt cctaaaagta 4800

gtatagttct ttgaagttag aggatgcagc atttccttaa acttaagggt tctgagtttt 4860

actgattata tatccaaatc gaatgaagcc tggatctgga agaaaaaacc gaagtttgtg 4920

tacattttta tattcacgac tacctaaaca attcttaacc aaaagaagaa gaaaaactaa 4980

ataatctcat atgtcatttg ggtaaagtca aaataatttc ttttcaggtt gttggacatc 5040

attctgtttt ggtaatttgg ttagagattt atgaaactga atgattgttt actgttacgg 5100

tttaggttgg gatccgattg gttagtttca agtagtctta gtttttcagt tttacttgtt 5160

caggttaatc aggaaaaagt agatatatat acatgatttg agattcgtta taagcttgat 5220

gaaagaccct aaaagctcga caaattatga aaaccagatt gctatatatt tttgatggtt 5280

ggtgggaaaa gaattttctt tgtgttaatt aatgactata aatggttttg acctaaaact 5340

atattacaga tggagaagaa taatcttgcg ggagccgaag ctgataaaat ggagatgtca 5400

cctggacaaa tctctgacat caatcgtccg gtaactctcc gactgcttta ttagccacct 5460

taagtccaaa acttgtgact aaaaacaaaa ataagttatc gaactattcc cctataaggg 5520

tgaacgttgt atatcttcat tctctctggc tgagagaccc cgtgtgtaaa actacggtta 5580

gatttaagta aaaatatata tttaagacat actaattatg gatc 5624

<210> 2

<211> 196

<212> PRT

<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）

<400> 2

Met Gly Arg Lys Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ile Glu Asn Lys Ser Ser

1 5 10 15

Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Asn Gly Leu Ile Glu Lys Ala

20 25 30

Arg Gln Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Ser Val Ala Leu Leu Val Val

35 40 45

Ser Ala Ser Gly Lys Leu Tyr Asn Phe Ser Ala Gly Asp Asn Leu Val

50 55 60

Lys Ile Leu Asp Arg Tyr Gly Lys Gln His Ala Asp Asp Leu Lys Ala

65 70 75 80

Leu Asp Leu Gln Ser Lys Ala Pro Lys Tyr Gly Ser His His Glu Leu

85 90 95

Leu Glu Leu Val Glu Ser Lys Leu Val Glu Ser Asn Ser Asp Val Ser

100 105 110

Val Asp Ser Leu Val Gln Leu Glu Asp His Leu Glu Thr Ala Leu Ser

115 120 125

Val Thr Arg Ala Arg Lys Thr Glu Leu Met Leu Lys Leu Val Asp Ser

130 135 140

Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Leu Lys Glu Glu Asn Gln Gly Leu Ala

145 150 155 160

Ser Gln Met Glu Lys Asn Asn Leu Ala Gly Ala Glu Ala Asp Lys Met

165 170 175

Glu Met Ser Pro Gly Gln Ile Ser Asp Ile Asn Arg Pro Val Thr Leu

180 185 190

Arg Leu Leu Tyr

195

<210> 3

<211> 8452

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜（Brassica napus）

<400> 3

gaggaggaag agctcatcgt gcttaatgtc atcatcgaag caaaccaaga attgaaaaat 60

attttagcat aaagtaacga atgatgatta gaataacaca gtatttaatg ctacaggtgg 120

tatgagtaat gaactagatg ttgctgtttt tattatcggg aatatatttc cccactttat 180

catttctatt ctattttatc ttctcgcgtt ctaaagttga atgttctgta accattaaaa 240

actaaaattt ttttaacaat ttaaaaagga taattgacat atccagaaat atggaaagcg 300

ggtgagatga ttggataaaa accatgccgt acattcaccc atcgattcgt ataagtacgt 360

ttcgcattaa gtttataata ataaatatag tattttctct gccacataat ttagcatata 420

gggttaatac atttcccttc tctccacaaa cgtttagttt atcgtatagg aaaattgcat 480

catctttaac tttgtagctc tttgttgggg atttttggta tacgaccttt gtgtaagttg 540

tttcttgggt ttgtattggc tcagttgcag ttttcacctg tttttggtat taatatattt 600

ttcaagttga caaaaaaaaa aaaaaacttt tcatcctaca ttatatagac gattataatg 660

ggattgcgca aaattctaaa caaaaattaa atactaactt ttgtatacta ttttctaaaa 720

catctaaaaa atacattagt gagaacaatg tctattaagt aacaatgtca attaaacaac 780

gaattcaaca tattaagaat agaaatttat caaaaaaaag tgggccaaaa tctccaaatt 840

tcatccttgt ataaataaag agagattttt ttctggacaa agtataaata aagagatatt 900

ttgcctaaaa tagaggataa aaattattta ggcaacatgt tttgaacaac cacagtgaaa 960

caaacaaaaa tacattcgtc taggcaacga ggcatgtcat ctaagcacat gggctatttt 1020

ctaggcgcgc atcacctctc atgtaggcat cgcctactat ctagttataa ctaatactac 1080

aatcttttta tgtttttctt cctacttcag acctcacatg aaagtttgcc ttaaatccat 1140

catcaaattg tacgtgccaa attcagatta aacaattaga gtggcatatc aaacatctaa 1200

atacactagc cgtccacgct aaatattctc tttggcagaa aaataacaat cattgttagt 1260

ggttattcag attggactca gatcgaattc agacgaaatg agtaatagta gtatttatat 1320

atcaaactgt ccaatagata tttaagaatt ttggtttatg tttatttttt aatcctaaca 1380

attggtctga cttgtaggaa gtaaaatatt gaatatgcaa gaaacgaaga gaaacaaaaa 1440

tgtgggttaa ataaaaactc tcatgtataa gaagtaagat aaactaaaat ttataagatc 1500

taaagagaaa aattaacgcc ttatagacaa aaaaaaacca gtaaattttg tgctaaataa 1560

gcaaattgaa aggtttgtag gttggcttta ggtcaagtta tattattaga cacgtacgtt 1620

aggtcaagtt gtctatatta gtcaggagtt tcagtttggt cagcagattg gaaaataaat 1680

aaccagattt tataacgaag tttatgtata tttgtcgttt aagttataag tatagtgtaa 1740

tgtgtgtaaa aagtttgttt taagtagtat agtgtattct attctttttg gcaacagttc 1800

tgcattagtt aagatataat tttccatagt atttgagatc taaccatgta atataacttg 1860

aaatttgaaa acttgataaa ttattcgata aaagataata aaggcaagag gcaagagcca 1920

acgagggaac tcgtcatgcg gtacacgtgg ctgtcttgtc cctgaaccac attggttctt 1980

tctacgaatt tttattttca tctctctcgt ttaccctaat aaaaagtggc ccgagggaga 2040

aaaaggagag acacaaaaag aaagaaataa aagcaaaaaa gaaagaaaat aaaagcaaaa 2100

ataagaaaga acaaaaaacg ctcagtatct ccggcgagag ttgaaaccga acctcaggat 2160

caaattaggg cacaaaggct tctcggagac agaagccatg ggaagaaaga aactagagat 2220

caagcgaatt gagaacaaaa gtagccgaca agtcaccttc tccaaacgac gcaatggtct 2280

catcgagaaa gctcgtcagc tttcagttct ctgcgatgca tccgtcgctc ttctcgttgt 2340

ctcagcctcc ggcaagcttt acaacttctc cgccggcgat aagtatgact tctcctcttc 2400

tgggtcttcc tttatttgcc cttttcgctt ccgttcctct tctctttact atttatagga 2460

aaataaaata aagtacaaat aaaataaaat aaaacaatta aaagacactt tgattttccg 2520

gcagatctca tgtgcatttc tcggttttgt gtttgttatt gtttcttcta tgaacatgag 2580

agatacatga ggtaaccaga tttgaagaag aacaatgtcc tgatgagcta aagcttctta 2640

ctttgttcat ttctctctct ctcaaccttt ttctgcatgg atttttttta tctgtaaaaa 2700

aaattgcatg ttattcaagg tcttttgata agctgtgatg catacttgat gttgttttgt 2760

gaagtttcaa tacatctttg attgtttaat tggatttagg actcctaatt aagtatctga 2820

agagttcctt atcagaatga gtattagtgg ttttcttttt agagtaattt tggtcgatgg 2880

atctcttgat ttgtaatgca atgcacttcg gggagatcta taaaaaatgt gggattaatg 2940

cttaataata gattaagagt tttaattcga atgtatgcca cattttgcag caaatgtgaa 3000

ctccgtagaa ctccttaagt atctgaagag ttccttataa gaataaataa tgattaatgt 3120

ttctattttt agagtaattc aagtcaatga atctcttgga gttcgatgca atgcacttcg 3180

gggagatcta taaaattgat gtaggattga tgcagaataa tagatcaaga gttttaatat 3240

gaatgcatat atgccacatt gtgcagccat ctatatatat aaagtattgt ttgcctctct 3300

cctgtgcttc cacgtcacta attcatctct tcctagcctg ccacgtgtcc acttgaccaa 3360

aacgtacggt ttcctcattt aattgttaag ggcttcgcta ttgttttgtg ttatgttcat 3420

gggctggccc atgacacttg catcttcttc tcagtctgaa atttagggtt caccagcttt 3480

aggaatcttc cattctgtat gttaacaatt gcagttctga gattttcgta tacattttgt 3540

caataatctc aaagtccatt tatgttctga tcgttttgtc ttacctccga accgttacaa 3600

gttgcagaga ttggcataat taacacaaac ttaactcttc ctcgccacta ggaccacgat 3660

caagaattca atgaatctta ttcagtttcc agtctgtgat tctctcctat aaaaaggtaa 3720

ttattcatcc cttgaacatc atcttttcat ctcctattat cgagagattt cttatttttt 3780

ctataatggc tgcatcattt gtcttccact ctgatttgaa agcaaatgtt gttcttccac 3840

ggctgttatg tttatcaaac tctagatttt gtttgtcttt ttgtttttct ctttcctctc 3900

cataagattt gttgataaac actatggatt gcttatgctt ttgtcttata tactcttggc 3960

tcaatacaaa ccagatggag gtggaagatc ttagctgcca ctggaaaaaa gctatggcaa 4020

agattatttt tcaggagatg gagttgagat gaggatgaga gttcaggctg cgctgaaact 4080

ggaaaaagct attcccttta gtcacgagat ggaaatcatt caactcaagt tgcatgatca 4140

agctagatac gacatattgt tacagtcaca cggcagatta ttaaatatcc tgtcaaggga 4200

acttttgatc ctttagttgt tgggtaacta aagtttccat ctttatcttc tcaatacatg 4260

attttaattg cctataaggt gtttgagtta ttgtctgctt ttctcatgtc tcaatcaaat 4320

agttgtttct ctggttttgt tgtcttctgc tcagtttggt gttcgtattt taaacagatc 4380

atactacacg aaattgcggc tgtgatctcc cccaagagcc ttttacgtac agattgacac 4440

atgaggtgat gttttgtggg ttagttgtgc tttttgcaat ggctgccctc aaaccagtaa 4500

actcctcaag taaattctct gatttgagtt aatgtgattc actgtgatgt tttgtgattt 4560

tcatgtcttt tttattttaa aatcctctga tttgagatta atctgttgct atgacttact 4620

ctgatccagg gagctcagta acaacgacac caatctcatg ttctgaccaa agatgcagct 4680

ggggtgttca gtcctctaat tcaggctgtt ctactcagaa caacatttgc gcttacacgt 4740

ttcggtatgg ggatggaagt tgcacctcag ggttcttcgt ctctgatgtc ttacagttcg 4800

tttgagtact atgactcttg gccagacatg ttgtctcatt ttttatttag tgctctgctt 4860

ttcagtgttt tcttcttgca tcgcttgaac agtgatgagc ccaaggccga tgtcaccttt 4920

tagaataaca tgtaagaccc atgaatacac tagaattgat taaaaaaatt taatgcatgg 4980

agatagttca ttttaccttg atcgagtgtt gagagagtgc ttgcagtttt ggcactgaag 5040

cctcaagatg atcttcttcg tggtctaagc atgttcaacg gataacacaa atacacatca 5100

cccttaaaac aaattatgac ataaaaaaca tagagcaaaa taatcccaaa tttaaaaaca 5160

ctaataaaat tttcatatga ttttaatctg aaaggatcaa atacagaatc ataaaaacaa 5220

ctcagtccct aaaactacaa gataaatggc tcactatatt gattaagaat atctaaaaat 5260

tgctcaagat ttaactaact ggtttaattc aaacacacaa aacacacttt gtaaaaaaga 5280

agtgtctatt gtacctttga tgacacccaa aaacaacaat ccactgagat gaagaatgga 5340

tattaaaaat atcaaacaaa agaaagacca aaggagacgc catgaaaatg ttaaaatttg 5400

cagttaaaaa ttaattatct tagtatcagt tttagtacca attattttta atccaaaggg 5460

attctttgat gtttttattt acagaaatta cataatatat ctagcaataa tgacaataag 5520

taattgtagt gtaactaatt tgtttttcca aaatcattta attaaagaaa gttaatctta 5580

taattaatta tacatcatgg aacataaaca aatgtcaatc catttctaag tattttttca 5640

aataagtacc acatcaaaat tcttttaaac attaagtaaa tagtaaaatt atatagggta 5700

gtattatgtg tttttccaat aactatttta gtttgattat gtatatctga ttgaaatatt 5760

attcattttg tttaacaatt attcttttgt cattttgtag tgatctataa caaaaaaata 5820

aatgatacgt attttataaa aagcagaaga caaatcatct atcacataat ttacttaact 5880

gcattgattt tggggttcaa ttttctgaaa ttcagtataa agcgatttca tagaaataat 5940

gccctataca aaatatataa ttgaatttta gaaattattt taaaaaatca tgtcaattac 6000

ttagcgaatc cactcgccgc gcgaagcgcg gcccggccct agttaactta aaagataatt 6060

gtagatcttc aaaaaaaatt acctctttgc catggattta ttgcttgaag attatccaaa 6120

ttataaggct actaattagt atccatatat atgtgtaaag taattttgaa atttggtaga 6180

tttaagaaaa ttcagcctca caattagtac ttaaccacac atatgctaca ctacttatgt 6240

tctccgcgat tgccattaca atggtgttga acaaggatta gctagttgtt ttgatcttaa 6300

cttattttgt tttgtctcct cttcagcctg gtcaagatcc ttgatcgata tggaaaacaa 6360

catgctgatg atcttaaagc tctggtaata caattttttt gaattagtcc tgatgcagtt 6420

ttaagagtaa ttagtgccta gagggctcca tacattctgg tcaaagccaa cacatgttta 6480

ggacttcaaa actgtggaga tctagattag agtcattgca ttattgatgc acccatgagc 6540

cattagttcg tcaaaagatc ctatgtgagg ctgtggatcc acatgcattc ccagtttctt 6600

aaatcccttg ttttaattgc ctattctatc ccttctccgt ggacaggatc ttcagtcaaa 6660

agctccgaag tatggttcac accatgagct actagagctt gtcgaaaggt tagtattgtc 6720

taagactgtt tttgctctcc tcctttgatg acaaaggaat tagtgtttct tgtcaaacta 6780

ttaatatatg cagtaagctt gtggaatcaa attctgatgt aagcgtcgac tccctcgttc 6840

agctggagga ccaccttgag actgccctct ccgtaactag agctaggaag gtacgttcac 6900

tacaaaatct cttttttttt ttcttacttt cagagcgctt atatttaatt cgttgcagac 6960

agaactaatg ttgaagcttg ttgatagcct caaagaaaag gttagatatc ttatcttata 7020

gcacttaatt agatatccta ccttgtgtcg agagcctcaa tacttttgtg tattgtatta 7080

gtttccctaa gtgtgcttta tgagctccca agtctacatt aaacttcttc acagttcatg 7140

tagtcttttt ggtgatgatg caaatgattt gggttctaga atctgaaatt aggtttagaa 7200

acttggtaag tgataatcat gttgaccttt aaaacaggag aaattgctga aagaagagaa 7260

ccagggtttg gctagccagg taacaaagct acattcttca tatatgcaaa agctaacaag 7320

cacttttaca catactctta tacttgcaga tataacatat acagtagata ttatacttta 7380

ggtattatag aaaagaatat gtcgagatta aggcattttg gtttacctta attttgatga 7440

gagtattact gtatgaaaac caaaatttga ttggtctgga tttggttggg gaaaattttg 7500

gtttggttct aatttggatt attataaatt attaaaacag tttaaaccct aacgctaaaa 7560

gtaaacccta aactctgtca taaaccttaa tacttcaaca aaagtcttaa accctaattc 7620

ctaaaagtat tatagttctt tgaagttaga ggatgcagca tttctttata cttgggggtt 7680

ctgagtttaa ctgattatat atccaaatcg aatgaagcct ggatctggaa gaaaaaaccg 7740

aagtttgtgt acatttttat attcacgact acctaaacaa ttcttaacca aaagaagaag 7800

aaaaactaaa taatctcata tgtcatttgg gtaaagtcaa aataatttat tttcaggttg 7860

ttggacatca ttctgttttg gtaatttggt tagagattta tgaaactgaa tgattgttta 7920

ctgttacggt ttaggttggg atccgattgg ttaggttcaa gtagtcttag tttttcagtt 7980

ttacttgttc aggttaatca ggaaaaagta gatatatata catgatttga gattcgttat 8040

aagcttgatg aaagacccta aaagctcgac aaattatgaa aaccagattg ctatatattt 8100

ttgatggttg gtaggaaaag aattttcttt gtgttaatta atgactataa atggttttga 8160

cctaaactat attacagatg gagaagaata atcttgcggg agccgaagct gataaaatgg 8220

agatgtcacc tggacaaatc tctgacatca atcgtccggt aactctccca ctgctttatt 8280

agccacctta agtccaaaac ttgtgactaa aaacaaaaat aaattaccga actattcccc 8340

tataagggtg aacgttgtat atcttcattc tctctggctg agagaccccg tgtgtaaaac 8400

tacggttaga tttaagtaaa aatatatatt taagacatac taattatgga tc 8452