本发明涉及微生物学和植物病害生防技术领域，具体地说，涉及马铃薯枯萎病拮抗菌nz-4及其应用。
背景技术：
马铃薯枯萎病是由尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)引起的一种马铃薯土传病害，分布广泛，在我国各种植区均有发生。马铃薯枯萎病可以对植株的整个生育期造成危害，病原菌主要从植株的根部伤口和根毛生长点侵入，进而破坏其根、茎以及叶的维管束，导致部分或整个维管束变褐，使植株吸收和运输水分功能丧失，最终造成植株枯萎死亡。近几年来，随着马铃薯主粮化战略的实施，马铃薯种植面积逐年扩大，由此带来的连作重茬导致马铃薯枯萎病日益加重，严重制约了马铃薯产业的发展。因此，深入研究有效防治马铃薯枯萎病的方法己成为当前生产上亟待解决的重要问题。
利用微生物防治植物真菌性病害，对环境和人类的安全性、减缓病原菌抗药性等具有重要意义，已经成为当前植物病害防治的研究热点。1973年澳大利亚植物病理学家kerr利用放线土壤杆菌(agrobacteriumradiobacterk84)成功防治了植物根癌病，此后人们对植物病害的生物防治研究陆续深入。
芽孢杆菌属是一类好氧或兼型厌氧、产生抗逆性内生孢子的杆状细菌，由于能够产生脂肽类和蛋白类等抗真菌物质，具有广谱抗真菌活性和良好的稳定性，已成为重要的农业生防菌。目前，有关解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)和枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)的研究较多。枯草芽孢杆菌作为生防细菌已经被商业化生产，它能够控制黄瓜和番茄上的瓜果腐霉和烟草疫霉，同时还具有促进植株生长的作用。宋松等分离到一株解淀粉芽孢杆菌sqr11对烟草青枯病具有稳定的拮抗作用；郭荣君等利用营养竞争平板筛选法获得了可在大豆麦麸(swb)培养基上快速生长并拮抗大豆根腐病菌fusariumoxysporum和f.solani的枯草芽孢杆菌b006和b010；林峰从花生荚果际中筛选到37株对致癌物质黄曲霉毒素具有抑制作用的生防芽孢杆菌，其中，枯草芽孢杆菌为优势种，共27株，其次为5株蜡状芽孢杆菌(bacilluscereus)，还有2株解淀粉芽孢杆菌、2株苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)和1株地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)。
本发明从16个马铃薯枯萎病发生地块的健康植株根际分离筛选出1株对马铃薯枯萎病病原菌有极强抗性的芽孢杆菌菌株，并对其对马铃薯枯萎病的防治效果以及对马铃薯植株的促生作用进行了研究，旨在为马铃薯枯萎病的生物防治以及生防菌剂的开发提供科学依据。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一株新的马铃薯枯萎病拮抗菌nz-4。
本发明的另一目的是提供菌株nz-4在防治作物土传病害中的应用。
为了实现本发明目的，本发明从河北、内蒙古以及贵州16个马铃薯试验田采集根际土样，分离得到288株芽孢杆菌菌株。经筛选得到1株对尖孢镰刀菌马铃薯专化型具有较强拮抗作用的菌株nz-4。根据其菌落和菌体形态特征及gyrb基因序列分析，鉴定其为贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)。马铃薯枯萎病拮抗菌nz-4现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号保藏号cgmccno.13606，保藏日期2017年1月13日。
在lb培养基平板上，菌株nz-4菌落呈圆形、乳白色，菌落边缘不整齐、表面有突起或褶皱，具有一定的粘附性，直径为5mm左右；4d后可产生棕褐色色素。菌体杆状，长约2μm，单生。革兰氏染色为阳性(图2)。
gyrb序列(seqidno:1)分析表明，菌株nz-4与贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)(ncbi登陆号为dq903176)的相似性最高，初步认为其为bacillusvelezensis(系统发育树见图3)。
本发明还提供含有所述菌株nz-4的微生物菌剂。
本发明还提供所述菌株nz-4或所述菌剂在防治作物土传病害中的应用。
其中，所述土传病害的病原菌包括尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)、马铃薯炭疽病菌(colletotrichumcoccodes)、马铃薯疮痂病菌(streptomycesscabies)、小麦根腐病菌(cochliobolussativas)、梨黑斑病菌(alternariakikuchianatanaka)、苹果斑点落叶病菌(alternariaalternariaf.spmali)、番茄早疫病菌(alternariasolani)、红腐病菌(fusariumequiseti)等。
本发明所述作物包括马铃薯、番茄等。
拮抗菌nz-4防治马铃薯枯萎病的盆栽试验结果表明，拮抗菌nz-4对马铃薯枯萎病有显著的防治作用，防治效果为62.14％；且施用拮抗菌nz-4发酵液能显著促进马铃薯植株的生长。
本发明还提供所述菌株nz-4或所述菌剂在制备农用复混肥中的应用。
本发明进一步提供一种农用复混肥，由含有所述菌株nz-4的菌剂与氮肥、磷肥、钾肥或复合肥组成。
本发明从16个马铃薯枯萎病发生地块的健康植株根际分离筛选出对马铃薯枯萎病病原菌有极强抗性的芽孢杆菌菌株nz-4，菌株nz-4还对马铃薯炭疽病和疮痂病、小麦根腐病等病原菌有很强的拮抗作用。盆栽试验表明，拮抗菌nz-4对马铃薯枯萎病有显著的防治作用，防治效果为62.14％；且施用拮抗菌nz-4发酵液能显著促进马铃薯植株的生长。拮抗菌nz-4及其微生物菌剂对我国农田土传病害和连作障碍防治，粮食持续增产和保护农田生态环境具有重要意义。
附图说明
图1为本发明菌株nz-4对马铃薯枯萎病菌y10-2的平板拮抗作用结果；图中a为尖抱镰刀菌y10-2，b为菌株nz-4。
图2为本发明菌株nz-4的菌落形态(左)和营养菌体(右)。
图3为本发明构建的拮抗菌株nz-4gyrb基因序列系统发育树。
图4为本发明实施例4中菌株nz-4发酵液对马铃薯株高的影响。
图5为本发明实施例5中采用对峙培养法测定菌株nz-4对不同病原菌的拮抗效果；图中a为colletotrichumcoccodes马铃薯炭疽病菌，b为streptomycesscabies马铃薯疮痂病菌，c为cochliobolussativas小麦根腐病菌，d为alternariakikuchianatanaka梨黑斑病菌，e为alternariaalternariaf.spmali苹果斑点落叶病菌，f为alternariasolani番茄早疫病菌，g为fusariumequiseti红腐病菌，h为phytophthoranicotianae烟草疫霉菌。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1马铃薯枯萎病拮抗菌nz-4的分离及纯化
1材料与方法
1.1土样采集
从河北保定、承德、张家口、秦皇岛以及内蒙古、贵州的马铃薯枯萎病发病田块中采集健康植株的根际土壤，采集深度范围为10～20cm，用无菌自封袋封好后带回实验室，暂保存于4℃，用于分离拮抗菌。
1.2供试靶标病原菌
1株尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum，y10-2)菌株，为尖孢镰刀菌优势菌种，由本实验室(河北农业大学植物病理学实验室)提供。
1.3供试培养基
细菌为lb培养基，真菌为pda培养基。
1.4芽孢杆菌菌株的分离和纯化
采用热处理土壤稀释分离法分离芽孢杆菌，连续划线培养至纯，以1：1混合于70％甘油中，-80℃冰箱保存备用。
1.5拮抗菌的筛选
采用平板对峙法测定芽孢杆菌对尖孢镰刀菌y10-2的拮抗作用。初筛采用抑菌带法，将接种平皿置于25℃恒温培养箱内培养，以只接种病原菌的pda平板为对照，5d后根据抑菌情况筛选出抑菌效果较好的菌株，采用抑菌圈法进行复筛试验。
2结果与分析
2.1芽孢杆菌菌株的分离及拮抗菌株的筛选
从16份根际土壤中分离纯化到对马铃薯枯萎病菌具有潜在拮抗作用的芽孢杆菌有288株。通过平板对峙法初筛获得抑菌带宽度≥3mm的拮抗菌株188株，占所有菌株的65.3％，其中，20株拮抗菌抑菌带宽度达到5.7mm以上。继续对20株拮抗菌进行复筛，获得抑菌圈直径≥20mm的拮抗菌6株(表1，图1)。
表1分离菌株对马铃薯枯萎病菌生长抑制作用
注：同列数据后不同字母表示差异达5％显著水平
实施例2拮抗菌株的鉴定
采用菌落形态、革兰氏染色与分子生物学相结合的方法对筛选到的拮抗菌株进行鉴定。
gyrb基因的序列分析：gyrb基因扩增引物序列正向引物gyrb-f：5'-ttgrcgghrgygghtataaagt-3'；反向引物gyrb-r：5'-tccdccstcagartcwccctc-3'。pcr扩增程序为：95℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min，4℃终止反应。pcr产物于1.5％琼脂糖凝胶电泳上检测后，送生工生物工程(上海)有限公司进行测序。将所测序列通过ncbi数据库进行blast比对，利用clustalx和mega6.0软件对分离芽孢杆菌及模式菌进行系统发育分析。
在lb培养基平板上，菌株nz-4菌落呈圆形、乳白色，菌落边缘不整齐、表面有突起或褶皱，具有一定的粘附性，直径为5mm左右；4d后可产生棕褐色色素。菌体杆状，长约2μm，单生。革兰氏染色为阳性(图2)。
gyrb序列(seqidno:1)分析表明，菌株nz-4与贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)(ncbi登陆号为dq903176)的相似性最高，初步认为其为bacillusvelezensis(系统发育树见图3)。
菌株nz-4的发酵培养基配方为：nacl10g、蛋白陈10g、酵母膏5g，蒸馏水1000ml(lb培养基)。
发酵培养条件为：37℃，220rpm，250ml摇瓶，装液量50ml。
实施例3拮抗菌防治马铃薯枯萎病的盆栽试验
采用浸根法用1.0×108cfu/ml拮抗菌发酵液处理2h，以清水处理为对照，每处理30株，共计60株；24h后，用1×106个/ml的尖孢镰刀菌y10-2孢悬液浸根30min，接种病菌后的马铃薯植株置于黒暗条件下处理24h，保持环境湿度为95％，以促进病菌侵染。24h后转入正常光照条件(14h光照:10h黑暗)培养。20d后调查马铃薯发病情况，并采用常规的组织分离法对发病植株进行病菌的分离鉴定。参照krumholz等致病力分级标准计算病情指数。
病情指数：(di)＝∑(病级×该病级株数)/(最高病级×调查株数)×100
盆栽试验结果表明，20d后拮抗菌株nz-4发酵液处理后的马铃薯植株的发病率为56.67％，低于对照(清水处理)发病率83.3％，拮抗菌株nz-4处理后的植株病情指数为26.00，远低于对照的病情指数68.67，防治效果达到62.14％。说明拮抗菌株nz-4发酵液对马铃薯枯萎病具有良好的防治效果。
实施例4拮抗菌nz-4发酵液对马铃薯植株株高的影响
促生实验如下：采用浸种法分别以1.0×108cfu/ml菌株nz-4(原液)和1.0×106cfu/ml(100倍稀释液)处理马铃薯薯块，室温静置2h，去掉菌株发酵液，待自然风干后进行播种。7d后再分别浇灌原液和100倍稀释液于根部20ml，以清水为对照。每隔7d灌根一次，4周后调查马铃薯苗株高。
用不同浓度的nz-4菌株发酵液对马铃薯植株进行灌根处理，清水做空白对照，观察并统计植株在不同处理条件下的生长情况。结果显示，经nz-4菌株发酵原液处理4周后的植株的平均株高为72.58mm，高于稀释100倍后的处理株高62.66mm以及对照株高60.87mm(图4)。由此可得，nz-4菌株发酵液对马铃薯植株的生长具有促进作用。
实施例5拮抗菌抑菌谱测定
采用对峙培养法测定拮抗菌株对农业生产中危害严重的8株植物病原真菌的抑菌效果。
将菌株nz-4对8株病原菌株进行抑菌谱测定。结果显示，菌株nz-4对马铃薯炭疽病和疮痂病的抑菌效果最好，抑菌圈直径达到35mm；对小麦根腐病菌、梨黑斑病菌、苹果斑点落叶病菌以及番茄早疫病菌的抑菌圈直径均在24mm以上；对红腐病菌也有一定的拮抗作用；但对烟草疫霉菌的拮抗作用不明显(表2和图5)。说明菌株nz-4有比较广的抑菌谱，可以考虑将其应用于除马铃薯枯萎病外的其他作物病害的生防研究。
表2拮抗菌株nz-4对不同病原菌拮抗效果
注：同列数据后不同字母表示差异达5％显著水平
宋松等研究发现土壤分离的部分菌株在初始阶段其表现出较强的抑菌能力，随着菌体数量的增殖，其抑菌能力会发生较大程度的衰弱。芽孢杆菌由于其能够产生具有耐高温、抗逆性强的芽孢，使得该类菌株能够长期稳定存活于相对恶劣的生活环境中，并能够在条件适宜的情况下迅速萌发增殖，持续分泌抗菌活性物质，抑制多种病原菌。本发明在土壤细菌筛选过程中采用了土壤悬浮液热处理法，虽然该方法在加热过程中会杀死营养型芽孢杆菌，降低测定结果；但由于热处理杀死了非芽孢杆菌，可有目的地筛选到芽孢杆菌，同时，适当降低了稀释度，从而简化了分离和鉴定工作，是筛选生防芽孢杆菌简洁高效的方法。
本发明经对峙试验筛选到的拮抗菌株nz-4在温室盆栽试验中表现出较强的抑制作用。
微生物菌剂通过改善或者创造适合生防微生物生存的微环境，提高其对环境的适应能力，从而提高其生防效果。在微生物菌剂的研制过程中主要从湿度、生产工艺和载体等方面来提高其储存稳定性。田晓丽经筛选确定麸皮+玉米粉(5:3)为固态培养基质，以高岭土为载体，将生防放线菌f104与非致病性尖孢镰刀菌fo47结合，制成复配菌剂，大大地提高了fo47的生物防效。因此，我们需要进一步将nz-4菌株发酵液制成微生物菌剂，并且，严格设计后期盆栽试验，系统性验证nz-4菌株对马铃薯枯萎病的防控效果。
芽孢杆菌的拮抗机制通常是由于它能产生生物活性物质。芽孢杆菌产生的拮抗物质主要有细菌素、抗生素、细胞壁溶解酶、其它抑菌蛋白及挥发性抗菌物质等。脂肽类抗生素是芽孢杆菌产生的主要抑菌物质，这些物质中的一些只抗相同或相近的有特异受体位点的种类。研究结果表明，菌株nz-4对除马铃薯枯萎病以外的多种重要农业病害病原菌也能产生较强的拮抗作用，由此推测，菌株nz-4可能产生多种不同的抑菌物质，亦或该菌株产生的抑菌物质有较广的抑菌能力，具体的活性物质成分尚有待进一步研究。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
参考文献
[1]peggg.plantpathology,bygeorgen.agrios,3rdedition.sandiego,california:academicpressinc.(1988),pp.803,$45.00.[j].experimentalagriculture.1990(no.1):132.
[2]d.m.wellerartc.suppressionoftake-allofwheatbyseedtreatmentswithfluorescentpseudomonas[j].phytopathology.1983,73(3):463-469.
[3]groschr,jungeh,krebsb,etal.useofbacillussubtilisasabiocontrolagent.iii.influenceofbacillussubtilisonfungalrootdiseasesandonyieldinsoillessculture[j].zeitschriftfürpflanzenkrankheitenundpflanzenschutz/journalofplantdiseasesandprotection.1999(no.6):568-580.
[4]宋松.烟草土传青枯病生防菌bacillusamyloliquefacienssqr11的分离、鉴定及其相关生防机制的研究[d].南京农业大学,2012.
[5]郭荣君，李世东，王忠玉.基于营养竞争原理的大豆根腐病生防芽孢杆菌的筛选及其特性研究[j].植物病理学报.2010(03):307-314.
[6]林峰.生防芽孢杆菌物种与分子遗传多样性研究[d].哈尔滨工业大学,2011.
[7]hw,sw,jq,etal.expressionofhpagxoocproteininbacillussubtilisanditsbiologicalfunctions.[j].jmicrobiolbiotechnol.2009(no.2):194-203.
[8]郝士海.现代细菌学培养基和生化试验手册.[j].中国科学技术出版社.1992.
[9]张洪龚国淑author张世熔author.土壤芽孢杆菌分离方法的比较——以成都郊区土壤为例[j].中国农业科学.2008(11):3685-3690.
[10]el-tarabilyka,nassarah,hardygesj,etal.plantgrowthpromotionandbiologicalcontrolofpythiumaphanidermatum,apathogenofcucumber,byendophyticactinomycetes.[j].journalofappliedmicrobiology.2009(no.1):13-26.
[11]杨莹莹，朱育菁，刘波.番茄、茄子和辣椒枯萎病原菌分子鉴定及其致病性测定[j].热带作物学报.2012(05):906-912.
[12]krumholzmr,kleinri,mckeecf,etal.theformationofmassivestarsystemsbyaccretion.[j].science.2009(no.5915):754-757.
[13]吴常习，张雄强，唐炳方.赤霉素催芽在马铃薯生产中的运用[j].现代农业.2012(10):21.[14]陈太春.秦岭森林土壤芽孢杆菌的分离筛选、鉴定及抑菌作用研究[d].西北农林科技大学,2011.
[15]shargabmlgd.bacillussubtilisbs107asanantagonistofpotatoblacklegandsoftrotbacteria[j].canadianjournalofmicrobiology.1998.
[16]kumars,tamurak,neim.mega3:integratedsoftwareformolecularevolutionarygeneticsanalysisandsequencealignment.[j].briefingsinbioinformatics.2004(no.2):150-163.
[17]卢同.我国作物细菌性青枯菌的研究进展[j].福建农业学报.1998(第2期):33-40.
[18]张荣意宋卡魏author王星云author.培养条件对枯草芽孢杆菌b68芽孢产量的影响[j].中国生物防治.2007(03):255-259.
[19]许光辉郑洪元.土壤微生物分析方法手册[j].北京农业出版社.1986:103-105.
[20]赵蕾.液固两相法制备木霉菌高孢粉[j].中国生物防治.1999(03):49.
[21]khanw,prithivirajb,smithdldm.chitosanandchitinoligomersincreasephenylalanineammonia-lyaseandtyrosineammonia-lyaseactivitiesinsoybeanleaves[j].journalofplantphysiology.2003(no.8):859-863.
[22]洪永聪.生防菌株tl2的菌剂研制及大田防病试验[j].中国农学通报.2009(17):181-185.
[23]田晓丽.生防菌fo47菌剂的研制[d].西北农林科技大学,2010.
[24]christensenh,nordentofts,olsenje.phylogeneticrelationshipsofsalmonellabasedonrrnasequences[j].internationaljournalofsystematicbacteriology.1998,48(2):605-610.
[25]imc,lz,r.t.congruenceofevolutionaryrelationshipsinsidetheleuconostoc-oenococcus-weissellacladeassessedbyphylogeneticanalysisofthe16srrnagene,dnaa,gyrb,rpocanddnak[j].internationaljournalofsystematicandevolutionarymicrobiology.2007(part2):276-286.
[26]陈章良林东author徐庆author.枯草芽孢杆菌so113分泌蛋白的抑菌作用及抗菌蛋白的分离纯化[j].农业生物技术学报.2001(01):77-80.
[27]陈章良刘颖author徐庆author.抗真菌肽lp-1的分离纯化及特性分析[j].微生物学报.1999(05):441-447.
[28]kloeppejw,rodríguez-kábanar,zehnderaw,etal.plantroot-bacterialinteractionsinbiologicalcontrolofsoilbornediseasesandpotentialextensiontosystemicandfoliardiseases[j].australasianplantpathology.1999(no.1):21-26.
序列表
<110>河北农业大学
<120>马铃薯枯萎病拮抗菌nz-4及其应用
<130>khp171110083.2tq
<160>1
<170>patentinversion3.3
<210>1
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<213>贝莱斯芽孢杆菌（bacillusvelezensis）
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