本发明属于生物防治植物病害技术领域。具体涉及一株具有广谱抗菌性能的长枝木霉及其应用。
背景技术：
尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)是一种世界性分布的土传病原真菌，寄主范围广泛，可引起瓜类、茄科、豆科、香蕉、棉花以及花卉等100多种植物枯萎病的发生。禾谷镰刀菌(fusariumgraminearum)能侵染小麦、大麦、水稻、燕麦等禾谷类作物的穗、茎和根等部位，引起穗腐、茎腐、根腐病等病害。立枯丝核菌(rhizoctoniasolani)的腐生性较强，其菌丝体或菌核均可在土壤中的病残体上长时间休眠，当土壤温度和湿度适宜时，就开始萌发侵染植株，并且迅速向四周蔓延。这三种病原真菌均可以通过雨水、流水、沾有带菌土壤的农具以及带菌的堆肥传播，在农业生态系统中非常普遍，严重危害作物的产量和品质。
目前，农业生产中主要通过施用大量化肥和农药防御尖孢镰刀菌、禾谷镰刀菌和立枯丝核菌，这种方法不仅导致土壤养分比例失调、肥力下降，还会造成极为严重的环境污染；同时化肥农药残留带来的食品安全问题也备受关注。生物防治是利用生态系统中各种生物间的相互作用关系，尤其是有益微生物抑制或者消灭病虫害的一种有效方法，具有成本低、效果好、无污染等优点。因此通过添加外源有益微生物提高植物抗病性具有良好的应用前景。
技术实现要素：
本发明提供提供一株具有广谱抗菌性能的长枝木霉，是对多种病原真菌(立枯丝核菌、尖孢镰刀菌和禾谷镰刀菌)有显著抑制效果的长枝木霉菌(trichodermalongibrachiatum)mf-3株。
本发明所述的长枝木霉(trichodermalongibrachiatum)mf-3已于2018年4月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.15665。
本发明所筛选的mf-3株用于预防和治疗植物病原真菌；
所述的病原真菌，为立枯丝核菌、尖孢镰刀菌和禾谷镰刀菌；
本发明的mf-3株用于治疗植物植物枯萎病；
本发明的mf-3株还可用于促进黄瓜生长。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明通过实验证实本发明的长枝木霉菌株mf-3对多种病原真菌具有良好的抑制效果。实验结果表明，平板对峙5天，该菌对立枯丝核菌、尖孢镰刀菌和禾谷镰刀菌的抑制率分别为42.89％、36.39％和52.44％。
(2)本发明中的菌株mf-3对黄瓜有显著的促生功能，经过该菌株发酵液处理后，黄瓜种子的发芽长度有显著提高。
(3)本发明中的菌株mf-3具有显著的耐盐效果，实验结果表明，0％、1％和5％的nacl条件均不会影响菌株生长，培养72h后，菌液od值分别为5.84、5.29、4.11。因此，本发明的长枝木霉菌株mf-3不仅能够直接抑制立枯丝核菌、尖孢镰刀菌和禾谷镰刀菌对瓜果、蔬菜以及农作物生长的影响，还有一定的促生潜力，尤其在盐渍化土壤中，对广谱病原真菌有显著的防治效果。
附图说明
图1为长枝木霉菌mf-3对立枯丝核菌、尖孢镰刀菌和禾谷镰刀菌的抑制效果。
图2为长枝木霉菌mf-3对黄瓜的促生效果。
图3为长枝木霉菌mf-3的耐盐能力。
具体实施方式
下面结合具体的实施例和附图对本发明作进一步详细说明。
实施例1、长枝木霉菌株mf-3的分离与鉴定
1、菌株分离与纯化
本发明实验中使用的培养基配方(w/v)：
pda培养基：马铃薯20％，葡萄糖2％，琼脂2％，ph自然。
pdb培养基：马铃薯20％，葡萄糖2％，ph自然。
(1)菌株分离
土壤样品采集自不同耕作地区的未发病植物的根际土壤，采用10倍梯度稀释法，称取10g土壤充分混匀并研磨后，倒入盛有90ml无菌水的三角瓶中，充分震荡混匀，取上清液稀释成浓度为10-3、10-4、10-5、10-6土壤悬液。真菌分离采用稀释涂布平板法，用移液枪吸取200μl稀释液于孟加拉红固体培养基平板上进行涂布。28℃培养3-5天后在平板上选择不同形态特征的菌落，继续在pda平板上多次纯化。纯化的温度和时间与分离相同。
(2)拮抗菌株的筛选
在超净工作台上，用直径为6mm的无菌打孔器从新鲜培养的真菌菌落边缘打取菌丝薄片，置于培养皿的一侧，同时相距50mm的另一侧放置同样大小的病原真菌菌丝薄片，以单独接种病原菌真菌作为对照。于28-30℃条件下恒温培养。连续培养5天，观察并记录抑制效果。拮抗菌株对病原真菌的生长抑制率按照以下公式计算：
抑菌率(％)＝(对照组中病原真菌菌落直径-处理组中病原真菌菌落直径)/对照组中病原真菌菌落直径×100％。
最终筛选获得了长枝木霉菌mf-3株，并将其保藏。保藏时间：2018年4月23日，保藏地点：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)：保藏编号为：cgmccno.15665。
结果表明，本发明中的菌株mf-3对立枯丝核菌、尖孢镰刀菌和禾谷镰刀菌有显著的抑制效果，如图1所示，添加菌株mf-3后立枯丝核菌、尖孢镰刀菌和禾谷镰刀菌的菌丝直径分别从44.67mm、43.00mm和55.33mm，显著降低到25.33mm、27.33mm和26.33mm。通过抑菌率公式计算得到，菌株mf-3对立枯丝核菌、尖孢镰刀菌和禾谷镰刀菌的抑制率分别为42.89％、36.39％和52.44％。
2、分子鉴定
将菌株进行dna提取，然后利用真菌its序列的pcr通用引物，上游引物its1(5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3’)和下游引物为its4(5’-tcctccgcttattgatatgc-3’)进行pcr扩增。pcr采用50μl反应体系，具体包括：2μl模板dna，2μl上游引物(0.25μm)，2μl下游引物(0.25μm)，25μlpcrmaster-mix(2×)，19μl无菌双蒸水。pcr反应条件如下：93℃3min；93℃1min，53℃1min，72℃90s，共30个循环；72℃10min。
对扩增结果进行测序，测序结果在genbank核酸数据库中进行blast比对，结果发现，菌株mf-3与trichodermalongibrachiatumsp.的同源性为100％，覆盖度为99％。
本发明的长枝木霉菌mf-3，属于半知菌门，丝孢目，木霉菌属。菌落在pda培养基上生长较快，分生孢子倾向于形成同心轮纹排列，菌落开始为白色，后被大部分绿色产孢区所覆盖。在pda培养基上25-35℃，平板培养4-5天，菌落直径可达75-80mm。在pdb培养基上，180-200r/min，25-35℃，摇瓶培养3-5天，发酵液中活菌数可达5.3x106cfu/ml。
用ctab法提取本发明菌株的dna，然后采用通用引物its1/its4进行pcr扩增，获得扩增片段，扩增片段测序。序列经genbank中blast比对，与trichodermalongibrachiatumsp.的同源最高。
实施例2、长枝木霉菌mf-3促生能力测定
选取大小一致的饱满的黄瓜种子在2％(m/v)次氯酸钠溶液中浸泡15min，进行消毒，然后用去离子水清洗干净，进行发酵液拌种处理。将黄瓜种子放在发酵液中，对照采用等体积的无菌发酵液处理，28℃，180r/min，震荡培养4h后，将种子取出，置于9cm培养皿中。培养皿中放2层滤纸，无菌水浸湿，最后盖一层滤纸在种子上。每个平皿20粒，每个处理3次重复，28℃黑暗培养72h，期间用定时补加无菌水保持水分。测定种子的发芽率和发芽长度。发芽率测定按下公式计算：
发芽率(％)＝总发芽种子数/种子总数×100
结果表明，如图2所示，经过长枝木霉mf-3处理后，种子发芽率为97％±6％(均值±标准差)，对照组中种子发芽率为90％±10％(均值±标准差)，长枝木霉mf-3处理的发芽率有一定提高。同时经过长枝木霉mf-3处理后，黄瓜种子的发芽长度有显著提高，长枝木霉mf-3处理后种子发芽长度是对照组的4.14倍。
实施例3、长枝木霉菌mf-3耐盐能力的测定
在100ml的pdb液体培养基中添加不同量的nacl，配置成不同盐浓度的培养基(0％、1％、5％nacl)，用灭菌的打孔器在长满真菌菌丝的平板上打孔，然后用镊子夹取琼脂片放入nacl培养基中，28℃，180r/min，震荡培养72h，测定菌液od600值。
结果表明，如图3所示，随着nacl浓度升高，菌株的od600值没有显著下降，说明该菌具有一定的耐盐能力，在盐渍化土壤中对立枯丝核菌、尖孢镰刀菌和禾谷镰刀菌这些广谱病原真菌的防治方面有巨大的应用潜力。