暗色丝孢霉病病原菌RT‑PCR检测引物和探针组合及试剂盒的制作方法

本发明属于微生物检测技术领域，具体地说，涉及暗色丝孢霉病病原菌实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测引物和探针组合及试剂盒。

背景技术：

暗色丝孢霉病(phaeohyphomycosis)，是指由于一大组暗色真菌所致的皮肤、皮下等浅表组织，乃至深部脏器的感染。这些感染的共同特点是寄生组织内形成暗色的菌丝。暗色丝孢霉病，在世界范围内都有散在病例报道，但主要集中于热带地区。暗色丝孢霉病包括浅表型暗色丝孢霉病、暗色真菌性角膜炎、皮肤和皮下组织的暗色丝孢霉病、系统性暗色丝孢霉病。其中，以皮肤和皮下组织的暗色丝孢霉病最为常见，而其最主要的致病菌主要来自于外瓶霉属(Exophiala)和瓶霉属(Phialophora)。其中，又以外瓶霉属病原菌包括皮炎外瓶霉、甄氏外瓶霉、棘状外瓶霉和瓶霉属的疣状瓶霉较常见。

目前，皮肤和皮下组织的暗色丝孢霉病，通常是以镜检、培养、组织病理等方法进行诊断，并结合临床症状进行经验性用药。因此，开发精准的分子诊断技术，用于对暗色丝孢霉病的诊疗，有着非常重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种暗色丝孢霉病病原菌实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测引物和探针组合及试剂盒。

本发明的另一目的是提供一种用于非疾病诊断目的检测暗色丝孢霉病病菌的方法。

本发明的再一目的是提供一种改良的DNA提取方法。

为了实现本发明目的，本发明的暗色丝孢霉病病原菌实时荧光定量PCR检测引物和探针组合，该组合包括：

(I)用于检测暗色真菌的通用引物和探针，所述暗色真菌包括瓶霉属、外瓶霉属、枝孢霉属和着色霉属的暗色真菌(SEQ ID NO:1-3)

Panblack-F：5′-CTGATCTGTCCTCCTAATCG-3′

Panblack-R：5′-GCCTGCTTTGAACACTCTAAT-3′

Panblack-P：5′-FAM-ATGCCCTTC[A][C][T]GGGTGT-BHQ1-3′

其中，[A]、[C]、[T]表示锁核酸；

(II)用于检测皮炎外瓶霉的特异性引物和探针(SEQ ID NO:4-6)

Eder-F：5′-GTGTTGGACGGTCTGGTC-3′

Eder-R：5′-ATACGTGCTCAGTGAAGAAG-3′

Eder-P：5′-FAM-AATGACGGCGGCCTGGTTGGAC-BHQ1-3′；

(III)用于检测甄氏外瓶霉的特异性引物和探针(SEQ ID NO:7-9)

Ejea-F：5′-CTTCAAACCGTCCTCTGG-3′

Ejea-R：5′-AACAACGGATCTCTTGGTT-3′

Ejea-P：5′-FAM-GCCCGCGCTCGTCGGTGG-BHQ1-3′；以及

(IV)用于检测疣状瓶霉的特异性引物和探针(SEQ ID NO:10-12)

PV-F：5′-CTTGCTGCATGTTGCTTTGGC-3′

PV-R：5′-TAGGTTGGCTATCGGCGGAC-3′

PV-P：5′-FAM-GGACCCGTCTCACGACCGCC-BHQ1-3′。

本发明还提供与上述引物和探针组合配套使用的竞争性内参模板(SEQ ID NO:13-15)和内参探针(SEQ ID NO:17)。

本发明还提供含有所述引物和探针组合的用于实时荧光定量PCR检测暗色丝孢霉病病原菌的试剂盒。

所述试剂盒还包括竞争性内参模板Panblack-IAC、Eder-IAC、Ejea-IAC、PV-IAC和内参探针IACP，其序列信息如下：

Panblack-IAC：5′-CTGATCTGTCCTCCTAATCGAGCTGACTTG AACTGACTGGACCTGCCATGATTAGAGTGTTCAAAGCAGGC-3′(SEQ ID NO:13)

Eder-IAC：5′-GTGTTGGACGGTCTGGTCAGCTGACTTGAACT GACTGGACCTGCCATGCTTCTTCACTGAGCACGTAT-3′(SEQ ID NO:14)

Ejea-IAC：5′-GCCTTCAAACCGTCCTCTGGAGCTGACTTGAA CTGACTGGACCTGCCATGAACCAAGAGATCCGTTGTT-3′(SEQ I D NO:15)

PV-IAC：5′-CTTGCTGCATGTTGCTTTGGCAGCTGACTTGAAC TGACTGGACCTGCCATGGTCCGCCGATAGCCAACCTA-3′(SEQ I D NO:16)

IACP：5′-TAMRA-ACTTGAACTGACTGGACCTG-BHQ1-3′(SEQ ID NO:17)。

所述试剂盒进一步包括消化液、蛋白酶K、DNA裂解液、玻璃珠等中的至少一种。

其中，所述消化液配方如下：

100mM Tris-HCl pH 8.5

20mM EDTA pH 8.0

0.5％ SDS

所述DNA裂解液配方如下：

所述玻璃珠的直径为710-1180μm，优选为直径800μm的酸洗玻璃珠。

本发明还提供一种用于非疾病诊断目的检测暗色丝孢霉病病菌的方法，包括以下步骤：

1)提取待测样品的DNA；

2)以上述提取的DNA为模板，利用本发明的试剂盒，分别进行实时荧光定量PCR扩增；

3)分析PCR扩增产物。

实时荧光定量PCR扩增反应体系的配制如下：

(1)依次配制如下试剂

①PCR mixture A，配方如下：

②PCR mixture B，配方如下：

③PCR mixture C，配方如下：

④PCR mixture D，配方如下：

⑤PCR mixture E，配方如下：

(2)暗色真菌检测体系的配制

取15μl的PCR mixture A和13μl的PCR mixture B混合，加入2μl DNA模板，即得；

(3)皮炎外瓶霉检测体系的配制

取15μl的PCR mixture A和13μl的PCR mixture C混合，加入2μl DNA模板，即得；

(4)甄氏外瓶霉检测体系的配制

取15μl的PCR mixture A和13μl的PCR mixture D混合，加入2μl DNA模板，即得；

(5)疣状瓶霉检测体系的配制

取15μl的PCR mixture A和13μl的PCR mixture E混合，加入2μl DNA模板，即得。

实时荧光定量PCR扩增反应程序如下：95℃10min；95℃15s，54℃20s，72℃30s(采集数据)，共40个循环。

前述方法中，步骤3)根据是否出现扩增曲线，分析待测样品中是否含有相应的暗色丝孢霉病病原菌；含有病原菌的待测样品会出现对应的扩增曲线，表现为阳性结果；不含有病原菌的待测样品不出现扩增曲线或扩增曲线信号始终低于阈值，表现为阴性结果。

由于暗色丝孢霉病的皮损标本通常会含有较多的人类细胞，因此，本发明在DNA提取方案和分子检测方法上均做了一些针对性对性的优化，以确保暗色丝孢霉病中的病原菌准确检出。

本发明提供一种能快速、稳定地组织标本中提取核酸的方法，具体如下：

S1、采集皮损样本100-500mg，置于800μl消化液中，并加入50μl的20mg/ml蛋白酶K，于58℃温育1h；

S2、8000g离心10min，弃上清；

S3、向沉淀中加入700μl DNA裂解液；

S4、加100mg酸洗玻璃珠，30Hz震荡10min；

S5、95℃温育10min，10000g离心，取上清，作为DNA模板。

可将上述提取核酸的方法用于非疾病诊断目的检测暗色丝孢霉病病菌方法的步骤1)。

本发明提供的暗色丝孢霉病病原菌实时荧光定量PCR检测引物和探针组合及试剂盒，能够快速、特异、灵敏、稳定对暗色丝孢霉病病原菌进行分子诊断。在建立了可靠的暗色丝孢霉病病原菌检测体系的基础上，本发明针对性地设计了竞争性内参，确保阴性结果的真实可信。同时，本发明在DNA提取方案和分子检测方法上均做了一些针对性对性的优化，以确保暗色丝孢霉病中的病原菌准确检出。

附图说明

图1为本发明实施例1中暗色真菌的18S rDNA序列保守区比对图。

图2为本发明实施例3中四个检测体系的标准曲线。

图3为本发明实施例3中Panblack检测体系扩增曲线。

图4为本发明实施例3中特异性检测体系的扩增曲线；其中，7条扩增曲线分别对应于7个检测标本。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1DNA提取方案优化及引物、探针的设计

暗色丝孢霉病的标本，含有较多人类细胞。真菌细胞与人类细胞，存在较厚的细胞壁。在蛋白酶K的作用下，人类细胞会发生裂解，但真菌细胞却一般不会。因此，在DNA提取前，可以考虑事先对人类细胞进行降解，可有助于提高检出率。事实上也确实如此。以Panblack的引物探针对7份临床标本进行验证，证明当Ct值大于30时(即真菌DNA浓度较低时，表1的样品4和样品6)，蛋白酶K预处理，可以使Ct值降低1-2个循环，如表1所示：

表1蛋白酶K对检测结果的影响

优化后的快速、稳定从组织标本中提取核酸的方法如下：

S1、采集皮损样本100-500mg，置于800μl消化液中，并加入50μl的20mg/ml蛋白酶K，于58℃温育1h；

S2、8000g离心10min，弃上清；

S3、向沉淀中加入700μl DNA裂解液；

S4、加100mg酸洗玻璃珠，30Hz震荡10min；

S5、95℃温育10min，10000g离心，取上清，作为DNA模板。

目前，暂无关于暗色真菌的分子检测文献资料。因此，从NBCI下载四个属的物种的18S rDNA序列，包括外瓶霉属(Exophiala attenuata、Exophiala bergeri、Exophiala dermatitidis、Exophiala jeanselmei、Exophiala oligosperma、Exophiala spinifera、Exophiala xenobiotica)、瓶霉属(Phialophora verrucosa)、着色霉属(Fonsecoea pedrosoi、Fonsecaea monophora)、枝孢霉属(Cladophialophora carrionii)。通过seqman软件比对，从中找出序列相对稳定的区域(图1)，用于检测的目标序列。利用primer select软件进行引物初筛(确定相对稳定的区段设置引物)，并辅以经验性的人工校正，选定不存在碱基变异的区域作为扩增引物。

初步选定引物后，通过采用浓度依赖的近似法(nearest-neighbor)的Tm估算公式，结合体系的离子进行计算。

具体公式如下：

上述公式中，△H为反应热；△S为熵变；R为气体常数；C为引物的起始浓度；M为单价阳离子的总浓度。

通过调整引物长度和5'端碱基，使引物和探针体系趋于合理，所得引物信息如下：

同时检测瓶霉属、外瓶属、枝孢霉属、着色霉属暗色真菌的通用引物和探针，其序列信息如下：

Panblack-F：GCTGATCTGTCCTCCTAATCG(SEQ ID NO:1)Tm值为52.57℃

Panblack-R：GCCTGCTTTGAACACTCTAAT(SEQ ID NO:2)Tm值为51.46℃

Panblack-P：ATGCCCTTC[A][C][T]GGGTGT(SEQ ID NO:3)Tm值为67.8℃

Panblack-P的5’用FAM修饰，3’用BHQ1修饰。

同理，设计得到皮炎外瓶霉、甄氏外瓶霉和疣状瓶霉的特异性引物和探针，其序列信息如下：

Eder-F：GTGTTGGACGGTCTGGTC(SEQ ID NO:4)Tm值为52.58℃

Eder-R：ATACGTGCTCAGTGAAGAAG(SEQ ID NO:5)Tm值为50.60℃

Eder-P：AATGACGGCGGCCTGGTTGGAC(SEQ ID NO:6)Tm值为64.97℃

Eder-P的5’用FAM修饰，3’用BHQ1修饰。

Ejea-F：caCTTCAAACCGTCCTCTGG(SEQ ID NO:7)Tm值为53.39℃

Ejea-R：gtAACCAAGAGATCCGTTGTT(SEQ ID NO:8)Tm值为54.06℃

Ejea-P：GCCCGCGCTCGTCGGTGG(SEQ ID NO:9)Tm值为63.67℃

Ejea-P的5’用FAM修饰，3’用BHQ1修饰。

PV-F：gaCTGCATGTTGCTTTGGC(SEQ ID NO:10)Tm值为52.98℃

PV-R：GTTGGCTATCGGCGGAC(SEQ ID NO:11)Tm值为52.70℃

PV-P：GGACCCGTCTCACGACCGCC(SEQ ID NO:12)Tm值为62.28℃

PV-P的5’用FAM修饰，3’用BHQ1修饰。

设定竞争性内参(即内参引物与目标基因的引物相同)，以确保阴性结果的可靠性，内参模板信息如下：

Panblack-IAC：(SEQ ID NO:13)

CTGATCTGTCCTCCTAATCGagctGACTTGAACTGACTGGACCTGCcatgATTAGAGTGTTCAAAGCAGGC

Eder-IAC：(SEQ ID NO:14)

GTGTTGGACGGTCTGGTCagctGACTTGAACTGACTGGACCTGCcatgCTTCTTCACTGAGCACGTAT

Ejea-IAC：(SEQ ID NO:15)

GCCTTCAAACCGTCCTCTGGagctGACTTGAACTGACTGGACCTGCcatgAACCAAGAGATCCGTTGTT

PV-IAC：(SEQ ID NO:16)

CTTGCTGCATGTTGCTTTGGCagctGACTTGAACTGACTGGACCTGCcatgGTCCGCCGATAGCCAACCTA

内参探针为：

IACP：ACTTGAACTGACTGGACCTG(SEQ ID NO:17)，探针5’用TAMRA修饰，3’用BHQ1修饰。

此处所设计的内参体系，为竞争性内参，内参体系和检测体系的引物完全相同，但探针不同。由于内参体系和检测体系使用了相同的引物，所以不存在引物的优势扩增(这就避免了由于内参引物的扩增能力与检测引物存在较大差别，从而抑制其中扩增能力较弱的体系)。同时，通过加入高浓度的内参明确内参模板的加入不会影响检测体系。

实施例2用于实时荧光定量PCR检测暗色丝孢霉病病原菌的试剂盒

试剂盒(20人份)包含：

1)DNA提取管(20个)

提取管为2ml离心管，每管含800μl消化液，消化液成分为：

100mM Tris-HCl pH 8.5

20mM EDTA pH 8.0

0.5％ SDS

2)蛋白酶K(20mg/ml)一管，1ml；5g酸洗玻璃珠(直径710-1180μm，sigma，货号G1152)

3)DNA裂解液配方2ml，成分如下：

4)PCR mixture A(2×预混液，300μl)，配方如下：

5)PCR mixture B(260μl)，配方如下：

6)PCR mixture C(260μl)，配方如下：

7)PCR mixture D(260μl)，配方如下：

8)PCR mixture E(260μl)，配方如下：

9)positive control(40μl)，为1ng/μl的皮炎外瓶霉、甄氏外瓶霉和疣状瓶霉基因组DNA。

试剂盒的使用方法如下：

1)DNA提取：

①将取得的皮损样本200mg，置于800μl的消化液中，并加入50μl的蛋白酶K(20mg/ml)。于58℃温育1个小时

②8000g离心10min，弃上清；

③加入700μl的DNA裂解液；

④加100mg酸洗玻璃珠(直径为800μm)，30Hz震荡10min；

⑤95℃温育10min，10000g离心，取上清。

2)暗色真菌检测：

取15μl的PCR mixture A和13μl的PCR mixture B混合，加入2μl上一步所得DNA模板，混匀，上机运行即可。

3)皮炎外瓶霉检测：

取15μl的PCR mixture A和13μl的PCR mixture C混合，加入2μl上一步所得DNA模板，混匀，上机运行即可。

3)甄氏外瓶霉检测：

取15μl的PCR mixture A和13μl的PCR mixture D混合，加入2μl上一步所得DNA模板，混匀，上机运行即可。

4)疣状瓶霉检测：

取15μl的PCR mixture A和13μl的PCR mixture E混合，加入2μl上一步所得DNA模板，混匀，上机运行即可。

5)PCR程序为：

95℃10min；{95℃15sec，54℃20sec，72℃30sec(采集数据)}40个循环。

本试剂盒适用于ABI 7500/7500Fast/Vii7，Stratagene Mx3000P，Mx3005P，Mx4000，MJ Research Chromo4，Opticon(II)，Corbett Rotor Gene 3000等仪器。

实施例3试剂盒效果检测

1)标准曲线制作和灵敏度检测

①构建质粒标准品

a、分别以Panblack-F和Panblack-R、Eder-F和Eder-R、Ejea-F和Ejea-R、PV-F和PV-R四对引物，扩增出单一片段(以TAKARA的Premix TaqTM完成，货号：R004A)后，连入pUC18DNA质粒载体(TAKARA，货号：3218)，转入E.coli DH5α(TAKARA，货号：9057)。通过PCR检测筛选出阳性克隆，在摇菌培养后以碱裂解法提取纯化质粒。

b、以Qubit 3.0Fluorometer(Thermo Fisher Scientific)检测质粒浓度，计算出质粒的拷贝数，计算公式如下：

c、稀释为每微升含如下拷贝数的不同溶液，拷贝数为：10⁵、10⁴、10³、10²、10、1。

②构建质粒标准曲线

以上一步所得的质粒标准品，分别以四个检测体系进行扩增，其扩增数值和扩增曲线分别如表2所示，而据此构建标准曲线如图2所示。

表2扩增的质粒标准品Ct数值表

③灵敏度确定

从上述数据可以看出，四个检测体系的检测下限10拷贝的质粒数。由于所检测的目标基因为多拷贝基因(每个基因组约有200个拷贝)。因此从理论上说，当有一个基因组存在时，就可以有效被检测体系所识别。

2)稳定性检测

以确定的临床标本，同一份标本重复96次检测，结果如表3所示。

表3稳定性检测

由表3可知，在96次检测中，四个检测体系表现得非常稳定。

3)特异性检测：

以下列物种的高浓度基因组(5-10ng/μl)，用于特异性检测，除人类基因组外，还包括(共计11个属32个种)：外瓶霉属(皮炎外瓶霉、棘状外瓶霉、甄氏外瓶霉、Exophiala bergeri、Exophiala alcalophila)、瓶霉属(疣状瓶霉)、着色霉属(Fonsecaea monophora、Fonsecaea pedrosoi)、枝孢霉属(卡氏枝孢霉)、毛癣菌属(红色毛癣菌、趾间毛癣菌、断发毛癣菌、紫色毛癣菌、疣状毛癣菌)、小孢子菌属(犬小孢子菌、石膏小孢子菌、猪小孢子菌、铁锈色小孢子菌、桃色小孢子菌)、表皮癣菌属(絮状表皮癣菌)、念珠菌属(白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平光滑念珠菌)、曲霉属(烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、黑曲霉、构巢曲霉)、马尔尼菲青霉、新型隐球菌。其中，所用的菌株都事先经过形态学和分子方法的鉴定。

结果如下：

①Panblack检测体系，能有效检测到外瓶霉属、瓶霉属、着色霉属和枝孢霉属，但不能检测其他真菌物种；

②Eder检测体系、Ejea检测体系、PV检测体系，有效检测到各自的目标物种，而其他无关物种都扩增不出产物。

4)内参体系验证

加入高浓度的内参模板后，检测内参是否对目标检测有影响。取1-3份明确已知的阳性临床标本，加入高浓度内参(10⁵拷贝/体系)，结果见表4：

表4内参加入对检测体系的影响

从表4可见，内参的Ct值稳定在24左右，证明了内参这一体系中能得较好扩增。在这一前提下，不同浓度的标本在是否加入内参，Ct未呈现出明显的变化。可知，内参对检测影响基本可以忽略。

5)临床标本验证

在临床上共收集到7份培养阳性的临床标本，检测结果见表5和图3、图4)：

表5培养阳性临床标本的检测结果

其中，Ejea指甄氏外瓶霉，Eder指皮炎外瓶霉，PV指疣状瓶霉。以上结果表明，本发明能够有效检测到阳性临床标本，因此，适用于暗色真菌的临床分子检测。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所

<120> 暗色丝孢霉病病原菌RT-PCR检测引物和探针组合及试剂盒

<130> KHP171110609.6TQ

<160> 17

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ctgatctgtc ctcctaatcg 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcctgctttg aacactctaa t 21

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgcccttc[a] [c][t]gggtgt 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtgttggacg gtctggtc 18

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atacgtgctc agtgaagaag 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aatgacggcg gcctggttgg ac 22

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cttcaaaccg tcctctgg 18

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aacaacggat ctcttggtt 19

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gcccgcgctc gtcggtgg 18

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cttgctgcat gttgctttgg c 21

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

taggttggct atcggcggac 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ggacccgtct cacgaccgcc 20

<210> 13

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ctgatctgtc ctcctaatcg agctgacttg aactgactgg acctgccatg attagagtgt 60

tcaaagcagg c 71

<210> 14

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gtgttggacg gtctggtcag ctgacttgaa ctgactggac ctgccatgct tcttcactga 60

gcacgtat 68

<210> 15

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gccttcaaac cgtcctctgg agctgacttg aactgactgg acctgccatg aaccaagaga 60

tccgttgtt 69

<210> 16

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

cttgctgcat gttgctttgg cagctgactt gaactgactg gacctgccat ggtccgccga 60

tagccaacct a 71

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

acttgaactg actggacctg 20