用于羊草品种鉴定的SNP标记引物组合及鉴定方法与流程

本发明涉及一种用于羊草品种鉴定的SNP标记引物组合及鉴定方法。

背景技术：

羊草(Leymus chinensis(Trin.)Tzvel.)属于多年生禾本科赖草属植物，为异源四倍体(2n＝4x＝28)植物，它是欧亚大陆草原区东部草甸草原及干旱草原上的重要建群种之一。作为我国北方草原重要的乡土草，羊草不仅营养丰富、产量高、各类家畜均喜食，而且具有广泛的逆境适应能力和防风固沙作用，使得它在我国北方草原生态建设、植被恢复、畜牧业的发展等方面起着独特的作用。羊草优良新品种的培育与推广对国民经济的发展与农牧民生活水平的提高具有重要意义。新品种登记的品种DUS测试、商品种子的质量鉴别等都亟需一种高效、快速、准确和经济实用的品种鉴别方式。

DNA指纹鉴定技术具有不受环境影响、快速、准确的优点，成为目前品种鉴定的重要手段。国际植物品种保护联盟(UPOV)于2010年发布了DNA分子标记选择和数据库构建指南(简称BMT指南)，指出SSR和SNP标记是特别适用于品种鉴定的方法。SNP(Single Nucleotide Polymorphism)即单核苷酸多态性，是基因组上单个核苷酸变异形成的DNA序列多态性。SNP标记作为第三代分子标记，与SSR等类型的分子标记相比，具有明显的优势：一是多态性丰富，在基因组中密度高分布广泛；二是一般只有两种碱基组成，是二等位基因(Biallelic)，只需+/-的分析，适于快速、规模化筛查基因组；三是位于基因内部的SNP有可能直接影响蛋白质结构或表达水平；四是SNP等位基因频率容易估计，易于基因分型，遗传稳定性比SSR高，且更适合数据库整合和数据共享。因此，SNP被认为是应用前景最好的遗传标记之一。

SNP位点有基于测序、芯片及PCR等各种平台的检测方法。其中，KASP(KompetitiveAllele Specific PCR，即竞争性等位基因特异性PCR)技术是基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP分型，可在广泛的基因组DNA样品中对SNPs进行精准的双等位基因判断，该技术具有高度稳定性与准确性的特点。近年来，随着测序技术的发展和各种SNP基因分型平台的应用，许多植物的大量SNP位点被开发，SNP标记成为植物品种DNA指纹鉴定和数据库构建最具发展潜力的标记系统。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于羊草品种鉴定的SNP标记引物组合及鉴定方法。

本发明提供了鉴定羊草品种/品系的方法，为方法甲或方法乙。

所述方法甲包括如下步骤：

(a1)检测待测羊草基因组中的SNP位点1，如果该SNP位点1的基因型为杂合型、待测羊草为或候选为农牧1号品种羊草；

(a2)检测待测羊草基因组中的特异SNP位点2，如果该SNP位点2的基因型为CCCC(纯合型)、待测羊草为或候选为中科3号品种羊草，如果该SNP位点2的基因型为杂合型、待测羊草为或候选为吉生4号品种羊草；

(a3)检测待测羊草基因组中的特异SNP位点3，如果该SNP位点3的基因型为杂合型、待测羊草为或候选为S4-2品系羊草；

(a4)检测待测羊草基因组中的特异SNP位点4，如果该SNP位点4的基因型为杂合型、待测羊草为或候选为农牧1号品种羊草或NL16品系羊草或S4-2品系羊草；

(a5)检测待测羊草基因组中的特异SNP位点5，如果该SNP位点5的基因型为杂合型、待测羊草为或候选为中科2号品种羊草；

(a6)检测待测羊草基因组中的特异SNP位点6，如果该SNP位点6的基因型为杂合型、待测羊草为或候选为吉生2号品种羊草或中科2号品种羊草或中科3号品种羊草；

(a7)检测待测羊草基因组中的特异SNP位点7，如果该SNP位点7的基因型为杂合型、待测羊草为或候选为中科1号品种羊草或S4-2品系羊草；

(a8)检测待测羊草基因组中的特异SNP位点8，如果该SNP位点8的基因型为AAAA(纯合型)、待测羊草为或候选为中科1号品种羊草，如果该SNP位点8的基因型为CCCC(纯合型)、待测羊草为或候选为农牧1号品种羊草或NL16品系羊草或S4-2品系羊草；如果该SNP位点8的基因型为杂合型、待测羊草为或候选为吉生1号品种羊草或吉生2号品种羊草或吉生3号品种羊草或吉生4号品种羊草或中科2号品种羊草或中科3号品种羊草。

所述方法乙包括如下步骤：

(b1)检测待测羊草基因组中的SNP位点1，如果该SNP位点1的基因型为杂合型、待测羊草为或候选为农牧1号品种羊草；

(b2)检测待测羊草基因组中的特异SNP位点2，如果该SNP位点2的基因型为CCCC(纯合型)、待测羊草为或候选为中科3号品种羊草，如果该SNP位点2的基因型为杂合型、待测羊草为或候选为吉生4号品种羊草；

(b3)检测待测羊草基因组中的特异SNP位点4，如果该SNP位点4的基因型为杂合型、待测羊草为或候选为农牧1号品种羊草；

(b4)检测待测羊草基因组中的特异SNP位点5，如果该SNP位点5的基因型为杂合型、待测羊草为或候选为中科2号品种羊草；

(b5)检测待测羊草基因组中的特异SNP位点6，如果该SNP位点6的基因型为杂合型、待测羊草为或候选为吉生2号品种羊草或中科2号品种羊草或中科3号品种羊草；

(b6)检测待测羊草基因组中的特异SNP位点7，如果该SNP位点7的基因型为杂合型、待测羊草为或候选为中科1号品种羊草；

(b7)检测待测羊草基因组中的特异SNP位点8，如果该SNP位点8的基因型为AAAA(纯合型)、待测羊草为或候选为中科1号品种羊草，如果该SNP位点8的基因型为CCCC(纯合型)、待测羊草为或候选为农牧1号品种羊草；如果该SNP位点8的基因型为杂合型、待测羊草为或候选为吉生1号品种羊草或吉生2号品种羊草或吉生3号品种羊草或吉生4号品种羊草或中科2号品种羊草或中科3号品种羊草。

以上任一所述SNP位点1为基因组中的序列表中序列1自5’端第61位核苷酸，该SNP为T/A多态。

以上任一所述SNP位点2为基因组中的序列表中序列2自5’端第61位核苷酸，该SNP为G/C多态。

以上任一所述SNP位点3为基因组中的序列表中序列3自5’端第61位核苷酸，该SNP为C/T多态。

以上任一所述SNP位点4为基因组中的序列表中序列4自5’端第61位核苷酸，该SNP为A/G多态。

以上任一所述SNP位点5为基因组中的序列表中序列5自5’端第61位核苷酸，该SNP为C/A多态。

以上任一所述SNP位点6为基因组中的序列表中序列6自5’端第61位核苷酸，该SNP为G/C多态。

以上任一所述SNP位点7为基因组中的序列表中序列7自5’端第61位核苷酸，该SNP为T/C多态。

以上任一所述SNP位点8为基因组中的序列表中序列8自5’端第61位核苷酸，该SNP为C/A多态。

以上任一所述方法中，所述检测各个SNP位点的基因型的实现方法可为：以待测羊草基因组为模板，通过竞争性等位基因特异性PCR确定基因型。

以上任一所述方法中，所述“检测待测羊草基因组中的特异SNP位点1”的实现方法具体可为：以待测羊草基因组为模板，用引物探针组1进行竞争性等位基因特异性PCR，通过检测PCR扩增产物确定基因型。引物探针组1由引物组1和探针组组成。

以上任一所述方法中，所述“检测待测羊草基因组中的特异SNP位点2”的实现方法具体可为：以待测羊草基因组为模板，用引物探针组2进行竞争性等位基因特异性PCR，通过检测PCR扩增产物确定基因型。引物探针组2由引物组2和探针组组成。

以上任一所述方法中，所述“检测待测羊草基因组中的特异SNP位点3”的实现方法具体可为：以待测羊草基因组为模板，用引物探针组3进行竞争性等位基因特异性PCR，通过检测PCR扩增产物确定基因型。引物探针组3由引物组3和探针组组成。

以上任一所述方法中，所述“检测待测羊草基因组中的特异SNP位点4”的实现方法具体可为：以待测羊草基因组为模板，用引物探针组4进行竞争性等位基因特异性PCR，通过检测PCR扩增产物确定基因型。引物探针组4由引物组4和探针组组成。

以上任一所述方法中，所述“检测待测羊草基因组中的特异SNP位点5”的实现方法具体可为：以待测羊草基因组为模板，用引物探针组5进行竞争性等位基因特异性PCR，通过检测PCR扩增产物确定基因型。引物探针组5由引物组5和探针组组成。

以上任一所述方法中，所述“检测待测羊草基因组中的特异SNP位点6”的实现方法具体可为：以待测羊草基因组为模板，用引物探针组6进行竞争性等位基因特异性PCR，通过检测PCR扩增产物确定基因型。引物探针组6由引物组6和探针组组成。

以上任一所述方法中，所述“检测待测羊草基因组中的特异SNP位点7”的实现方法具体可为：以待测羊草基因组为模板，用引物探针组7进行竞争性等位基因特异性PCR，通过检测PCR扩增产物确定基因型。引物探针组7由引物组7和探针组组成。

以上任一所述方法中，所述“检测待测羊草基因组中的特异SNP位点8”的实现方法具体可为：以待测羊草基因组为模板，用引物探针组8进行竞争性等位基因特异性PCR，通过检测PCR扩增产物确定基因型。引物探针组8由引物组8和探针组组成。

所述引物组1由引物SNP1-F1、引物SNP1-F2和引物SNP1-R组成；所述引物SNP1-F1为自5’端到3’端依次为标签序列A和序列表中序列9第22-48位的DNA分子；所述引物SNP1-F2为自5’端到3’端依次为标签序列B和序列表中序列10第22-48位的DNA分子；所述引物SNP1-R如序列表的序列11所示。

所述引物组2由引物SNP2-F1、引物SNP2-F2和引物SNP2-R组成；所述引物SNP2-F1为自5’端到3’端依次为标签序列A和序列表中序列12第22-40位的DNA分子；所述引物SNP2-F2为自5’端到3’端依次为标签序列B和序列表中序列13第22-40位的DNA分子；所述引物SNP2-R如序列表的序列14所示。

所述引物组3由引物SNP3-F1、引物SNP3-F2和引物SNP3-R组成；所述引物SNP3-F1为自5’端到3’端依次为标签序列A和序列表中序列15第22-42位的DNA分子；所述引物SNP3-F2为自5’端到3’端依次为标签序列B和序列表中序列16第22-43位的DNA分子；所述引物SNP3-R如序列表的序列17所示。

所述引物组4由引物SNP4-F1、引物SNP4-F2和引物SNP4-R组成；所述引物SNP4-F1为自5’端到3’端依次为标签序列A和序列表中序列18第22-48位的DNA分子；所述引物SNP4-F2为自5’端到3’端依次为标签序列B和序列表中序列19第22-47位的DNA分子；所述引物SNP4-R如序列表的序列20所示。

所述引物组5由引物SNP5-F1、引物SNP5-F2和引物SNP5-R组成；所述引物SNP5-F1为自5’端到3’端依次为标签序列A和序列表中序列21第22-49位的DNA分子；所述引物SNP5-F2为自5’端到3’端依次为标签序列B和序列表中序列22第22-50位的DNA分子；所述引物SNP5-R如序列表的序列23所示。

所述引物组6由引物SNP6-F1、引物SNP6-F2和引物SNP6-R组成；所述引物SNP6-F1为自5’端到3’端依次为标签序列A和序列表中序列24第22-44位的DNA分子；所述引物SNP6-F2为自5’端到3’端依次为标签序列B和序列表中序列25第22-44位的DNA分子；所述引物SNP6-R如序列表的序列26所示。

所述引物组7由引物SNP7-F1、引物SNP7-F2和引物SNP7-R组成；所述引物SNP7-F1为自5’端到3’端依次为标签序列A和序列表中序列27第22-42位的DNA分子；所述引物SNP7-F2为自5’端到3’端依次为标签序列B和序列表中序列28第22-42位的DNA分子；所述引物SNP7-R如序列表的序列29所示。

所述引物组8由引物SNP8-F1、引物SNP8-F2和引物SNP8-R组成；所述引物SNP8-F1为自5’端到3’端依次为标签序列A和序列表中序列30第22-44位的DNA分子；所述引物SNP8-F2为自5’端到3’端依次为标签序列B和序列表中序列31第22-46位的DNA分子；所述引物SNP8-R如序列表的序列32所示。

以上任一所述探针组由荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B组成。所述荧光探针A的序列与标签序列A的序列相同，5’末端连接荧光基团。所述荧光探针B的序列与标签序列B的序列相同，5’末端连接荧光基团。所述淬灭探针A的序列与标签序列A的序列反向互补，3’末端连接淬灭基团。所述淬灭探针B的序列与标签序列B的序列反向互补，3’末端连接淬灭基团。

所述标签序列A具体可如序列表的序列9自5’端第1-21位核苷酸所示。所述标签序列B具体可如序列表的序列10自5’端第1-21位核苷酸所示。

所述荧光探针A的5’末端连接的荧光基团具体可为FAM；所述荧光探针B的5’末端连接的荧光基团具体可为HEX。

所述淬灭探针A的3’末端连接的淬灭基团具体可为BHQ。所述淬灭探针B的3’末端连接的淬灭基团具体可为BHQ。

上述各个引物均为单链DNA分子。上述各个探针均为单链DNA分子。

以上任一所述“检测待测羊草基因组中的特异SNP位点1”的实现方法更具体可为：采用所述引物探针组1对待测羊草基因组进行竞争性等位基因特异性PCR，将PCR扩增产物进行荧光信号扫描，Endpoint Genotyping软件对扫描数据进行基因分型分析，如果荧光信号经分析显示为蓝色、所述SNP位点1的基因型为TTTT(纯合型)，如果荧光信号经分析显示为绿色、所述SNP位点1的基因型为AAAA(纯合型)，如果荧光信号经分析显示为红色、所述SNP位点1的基因型为杂合型。

以上任一所述“检测待测羊草基因组中的特异SNP位点2”的实现方法更具体可为：采用所述引物探针组2对羊草基因组进行竞争性等位基因特异性PCR，将PCR扩增产物进行荧光信号扫描，Endpoint Genotyping软件对扫描数据进行基因分型分析，如果荧光信号经分析显示为蓝色、所述SNP位点2的基因型为GGGG(纯合型)，如果荧光信号经分析显示为绿色、所述SNP位点2的基因型为CCCC(纯合型)，如果荧光信号经分析显示为红色、所述SNP位点2的基因型为杂合型。

以上任一所述“检测待测羊草基因组中的特异SNP位点3”的实现方法更具体可为：采用所述引物探针组3对羊草基因组进行竞争性等位基因特异性PCR，将PCR扩增产物进行荧光信号扫描，Endpoint Genotyping软件对扫描数据进行基因分型分析，如果荧光信号经分析显示为蓝色、所述SNP位点3的基因型为CCCC(纯合型)，如果荧光信号经分析显示为绿色、所述SNP位点3的基因型为TTTT(纯合型)，如果荧光信号经分析显示为红色、所述SNP位点3的基因型为杂合型。

以上任一所述“检测待测羊草基因组中的特异SNP位点4”的实现方法更具体可为：采用所述引物探针组4对羊草基因组进行竞争性等位基因特异性PCR，将PCR扩增产物进行荧光信号扫描，Endpoint Genotyping软件对扫描数据进行基因分型分析，如果荧光信号经分析显示为蓝色、所述SNP位点4的基因型为AAAA(纯合型)，如果荧光信号经分析显示为绿色、所述SNP位点4的基因型为GGGG(纯合型)，如果荧光信号经分析显示为红色、所述SNP位点4的基因型为杂合型。

以上任一所述“检测待测羊草基因组中的特异SNP位点5”的实现方法更具体可为：采用所述引物探针组5对羊草基因组进行竞争性等位基因特异性PCR，将PCR扩增产物进行荧光信号扫描，Endpoint Genotyping软件对扫描数据进行基因分型分析，如果荧光信号经分析显示为蓝色、所述SNP位点5的基因型为CCCC(纯合型)，如果荧光信号经分析显示为绿色、所述SNP位点5的基因型为AAAA(纯合型)，如果荧光信号经分析显示为红色、所述SNP位点5的基因型为杂合型。

以上任一所述“检测待测羊草基因组中的特异SNP位点6”的实现方法更具体可为：采用所述引物探针组6对羊草基因组进行竞争性等位基因特异性PCR，将PCR扩增产物进行荧光信号扫描，Endpoint Genotyping软件对扫描数据进行基因分型分析，如果荧光信号经分析显示为蓝色、所述SNP位点6的基因型为GGGG(纯合型)，如果荧光信号经分析显示为绿色、所述SNP位点6的基因型为CCCC(纯合型)，如果荧光信号经分析显示为红色、所述SNP位点6的基因型为杂合型。

以上任一所述“检测待测羊草基因组中的特异SNP位点7”的实现方法更具体可为：采用所述引物探针组7对羊草基因组进行竞争性等位基因特异性PCR，将PCR扩增产物进行荧光信号扫描，Endpoint Genotyping软件对扫描数据进行基因分型分析，如果荧光信号经分析显示为蓝色、所述SNP位点7的基因型为TTTT(纯合型)，如果荧光信号经分析显示为绿色、所述SNP位点7的基因型为CCCC(纯合型)，如果荧光信号经分析显示为红色、所述SNP位点7的基因型为杂合型。

以上任一所述“检测待测羊草基因组中的特异SNP位点8”的实现方法更具体可为：采用所述引物探针组8对羊草基因组进行竞争性等位基因特异性PCR，将PCR扩增产物进行荧光信号扫描，Endpoint Genotyping软件对扫描数据进行基因分型分析，如果荧光信号经分析显示为蓝色、所述SNP位点8的基因型为CCCC(纯合型)，如果荧光信号经分析显示为绿色、所述SNP位点8的基因型为AAAA(纯合型)，如果荧光信号经分析显示为红色或粉色、所述SNP位点8的基因型为杂合型。

本发明还保护鉴定羊草品种/品系的方法，为方法丙或方法丁。

所述方法丙包括如下步骤：以待测羊草的基因组DNA为模板，分别采用所述引物探针组1、所述引物探针组2、所述引物探针组3、所述引物探针组4、所述引物探针组5、所述引物探针组6、所述引物探针组7和所述引物探针组8进行竞争性等位基因特异性PCR，将PCR扩增产物进行荧光信号扫描，Endpoint Genotyping软件对扫描数据进行基因分型分析，进行如下判断：

(c1)如果采用所述引物探针组1至引物探针组8对模板进行扩增得到的产物的荧光信号经分析依次显示为蓝色、蓝色、蓝色、蓝色、蓝色、蓝色、蓝色和粉色，待测羊草为或候选为吉生1号品种羊草；

(c2)如果采用所述引物探针组1至引物探针组8对模板进行扩增得到的产物的荧光信号经分析依次显示为蓝色、蓝色、蓝色、蓝色、蓝色、红色、蓝色和红色，待测羊草为或候选为吉生2号品种羊草；

(c3)如果采用所述引物探针组1至引物探针组8对模板进行扩增得到的产物的荧光信号经分析依次显示为蓝色、蓝色、蓝色、蓝色、蓝色、蓝色、蓝色和红色，待测羊草为或候选为吉生3号品种羊草；

(c4)如果采用所述引物探针组1至引物探针组8对模板进行扩增得到的产物的荧光信号经分析依次显示为蓝色、红色、蓝色、蓝色、蓝色、蓝色、蓝色和粉色，待测羊草为或候选为吉生4号品种羊草；

(c5)如果采用所述引物探针组1至引物探针组8对模板进行扩增得到的产物的荧光信号经分析依次显示为红色、蓝色、蓝色、红色、蓝色、蓝色、蓝色和蓝色，待测羊草为或候选为农牧1号品种羊草；

(c6)如果采用所述引物探针组1至引物探针组8对模板进行扩增得到的产物的荧光信号经分析依次显示为蓝色、蓝色、蓝色、蓝色、蓝色、蓝色、红色和绿色，待测羊草为或候选为中科1号品种羊草；

(c7)如果采用所述引物探针组1至引物探针组8对模板进行扩增得到的产物的荧光信号经分析依次显示为蓝色、蓝色、蓝色、蓝色、红色、红色、蓝色和粉色，待测羊草为或候选为中科2号品种羊草；

(c8)如果采用所述引物探针组1至引物探针组8对模板进行扩增得到的产物的荧光信号经分析依次显示为蓝色、绿色、蓝色、蓝色、蓝色、红色、蓝色和红色，待测羊草为或候选为中科3号品种羊草；

(c9)如果采用所述引物探针组1至引物探针组8对模板进行扩增得到的产物的荧光信号经分析依次显示为蓝色、蓝色、蓝色、红色、蓝色、蓝色、蓝色和蓝色，待测羊草为或候选为NL16品系羊草；

(c10)如果采用所述引物探针组1至引物探针组8对模板进行扩增得到的产物的荧光信号经分析依次显示为蓝色、蓝色、红色、红色、蓝色、蓝色、红色和蓝色，待测羊草为或候选为S4-2品系羊草。

所述方法丁包括如下步骤：以待测羊草的基因组DNA为模板，分别采用所述引物探针组1、所述引物探针组2、所述引物探针组4、所述引物探针组5、所述引物探针组6、所述引物探针组7和所述引物探针组8进行竞争性等位基因特异性PCR，将PCR扩增产物进行荧光信号扫描，Endpoint Genotyping软件对扫描数据进行基因分型分析，进行如下判断：

(d1)如果采用所述引物探针组1、所述引物探针组2、所述引物探针组4、所述引物探针组5、所述引物探针组6、所述引物探针组7和所述引物探针组8对模板进行扩增得到的产物的荧光信号经分析依次显示为蓝色、蓝色、蓝色、蓝色、蓝色、蓝色和粉色，待测羊草为或候选为吉生1号品种羊草；

(d2)如果采用所述引物探针组1、所述引物探针组2、所述引物探针组4、所述引物探针组5、所述引物探针组6、所述引物探针组7和所述引物探针组8对模板进行扩增得到的产物的荧光信号经分析依次显示为蓝色、蓝色、蓝色、蓝色、红色、蓝色和红色，待测羊草为或候选为吉生2号品种羊草；

(d3)如果采用所述引物探针组1、所述引物探针组2、所述引物探针组4、所述引物探针组5、所述引物探针组6、所述引物探针组7和所述引物探针组8对模板进行扩增得到的产物的荧光信号经分析依次显示为蓝色、蓝色、蓝色、蓝色、蓝色、蓝色和红色，待测羊草为或候选为吉生3号品种羊草；

(d4)如果采用所述引物探针组1、所述引物探针组2、所述引物探针组4、所述引物探针组5、所述引物探针组6、所述引物探针组7和所述引物探针组8对模板进行扩增得到的产物的荧光信号经分析依次显示为蓝色、红色、蓝色、蓝色、蓝色、蓝色和粉色，待测羊草为或候选为吉生4号品种羊草；

(d5)如果采用所述引物探针组1、所述引物探针组2、所述引物探针组4、所述引物探针组5、所述引物探针组6、所述引物探针组7和所述引物探针组8对模板进行扩增得到的产物的荧光信号经分析依次显示为红色、蓝色、红色、蓝色、蓝色、蓝色和蓝色，待测羊草为或候选为农牧1号品种羊草；

(d6)如果采用所述引物探针组1、所述引物探针组2、所述引物探针组4、所述引物探针组5、所述引物探针组6、所述引物探针组7和所述引物探针组8对模板进行扩增得到的产物的荧光信号经分析依次显示为蓝色、蓝色、蓝色、蓝色、蓝色、红色和绿色，待测羊草为或候选为中科1号品种羊草；

(d7)如果采用所述引物探针组1、所述引物探针组2、所述引物探针组4、所述引物探针组5、所述引物探针组6、所述引物探针组7和所述引物探针组8对模板进行扩增得到的产物的荧光信号经分析依次显示为蓝色、蓝色、蓝色、红色、红色、蓝色和粉色，待测羊草为或候选为中科2号品种羊草；

(d8)如果采用所述引物探针组1、所述引物探针组2、所述引物探针组4、所述引物探针组5、所述引物探针组6、所述引物探针组7和所述引物探针组8对模板进行扩增得到的产物的荧光信号经分析依次显示为蓝色、绿色、蓝色、蓝色、红色、蓝色和红色，待测羊草为或候选为中科3号品种羊草。

本发明还保护引物组合甲或引物组合乙。

所述引物组合甲由以上任一所述的引物组1、引物组2、引物组3、引物组4、引物组5、引物组6、引物组7和引物组8组成。

所述引物组合乙由以上任一所述的引物组1、引物组2、引物组4、引物组5、引物组6、引物组7和引物组8组成。

所述引物组合甲或引物组合乙的用途为如下(e1)-(e4)中的任一种：(e1)鉴别不同品种/品系羊草；(e2)制备鉴别不同品种/品系羊草的试剂盒；(e3)对羊草基因组DNA的SNP位点进行基因分型；(e4)制备用于对羊草基因组DNA的SNP位点进行基因分型的试剂盒。

本发明还保护引物探针组合甲或引物探针组合乙。

所述引物探针组合甲由以上任一所述的引物组1、引物组2、引物组3、引物组4、引物组5、引物组6、引物组7、引物组8和探针组组成。

所述引物探针组合乙由以上任一所述的引物组1、引物组2、引物组4、引物组5、引物组6、引物组7、引物组8和探针组组成。

所述引物探针组合甲或引物探针组合乙的用途为如下(e1)-(e4)中的任一种：(e1)鉴别不同品种/品系羊草；(e2)制备鉴别不同品种/品系羊草的试剂盒；(e3)对羊草基因组DNA的SNP位点进行基因分型；(e4)制备用于对羊草基因组DNA的SNP位点进行基因分型的试剂盒。

本发明还保护引物组合甲或引物组合乙或引物探针组合甲或引物探针组合乙的应用，为如下(e1)-(e4)中的任一种：(e1)鉴别不同品种/品系羊草；(e2)制备鉴别不同品种/品系羊草的试剂盒；(e3)对羊草基因组DNA的SNP位点进行基因分型；(e4)制备用于对羊草基因组DNA的SNP位点进行基因分型的试剂盒。

本发明还保护含有引物组合甲的试剂盒甲。

本发明还保护含有引物组合乙的试剂盒乙。

本发明还保护含有引物探针组合甲的试剂盒丙。

本发明还保护含有引物探针组合乙的试剂盒丁。

所述试剂盒甲或试剂盒乙或试剂盒丙或试剂盒丁的应用为如下(f1)和/或(f2)：(f1)鉴别不同品种/品系羊草；(f2)对羊草基因组DNA的SNP位点进行基因分型。

以上任一所述竞争性等位基因特异性PCR的反应程序具体可为：94℃预变性15min；94℃变性20s、61℃复性60s，共10个循环；94℃变性20s，55℃复性60s，共26个循环；37℃读取1min。

扩增结束后，若待测样品分型结果不明显，可补充PCR扩增反应，反应程序为：94℃变性20s、57℃复性60s，共3个循环；37℃读取1min。

以上任一所述竞争性等位基因特异性PCR的反应体系具体可为：模板DNA 2μL(50ng)，引物工作液0.14μL，KASP 2×Master Mix 5μL，用无菌超纯水补至10μL。

所述引物工作液的配置方法具体可为：上游引物各12μL，下游引物30μL，用无菌超纯水补至100μL。

所述上游引物和下游引物均以引物溶液形式加入至引物工作液中，各条引物在引物溶液中的初始浓度均为100μM。

所述KASP 2×Master Mix由所述荧光探针A、所述荧光探针B、所述淬灭探针A、所述淬灭探针B、高保真的Taq酶和dNTP等组成。

所述KASP 2×Master Mix具体可通过英国LGC公司，货号：KBS-1016-017商购得到。

以上任一所述竞争性等位基因特异性PCR具体可采用荧光定量PCR仪进行。

所述荧光定量PCR仪具体可为罗氏LightCycler 480(LC480)荧光定量PCR仪。

以上任一所述荧光信号扫描具体可采用罗氏LightCycler 480(LC480)荧光定量PCR仪进行。

以上任一所述荧光信号扫描参数具体可为：FAM激发波长为465nm，发射波长为510nm，HEX激发波长为533nm，发射波长为580nm。

以上任一所述待测羊草具体可为吉生1号羊草品种、吉生2号羊草品种、吉生3号羊草品种、吉生4号羊草品种、农牧1号羊草品种、中科1号羊草品种、中科2号羊草品种、中科3号羊草品种、NL16羊草品系和S4-2羊草品系。

本发明提供了用于羊草品种鉴定的SNP标记引物组合及鉴定方法，使用本发明的方法可以成功鉴别10个羊草品种/品系。本发明在羊草品种DNA指纹图谱绘制、新品种DUS辅助测试、育成新品种保护等方面具有重要理论与应用价值。

附图说明

图1为采用SNP1标记检测10个羊草品种/品系的基因分型图。

图2为采用SNP2标记检测10个羊草品种/品系的基因分型图。

图3为采用SNP3标记检测10个羊草品种/品系的基因分型图。

图4为采用SNP4标记检测10个羊草品种/品系的基因分型图。

图5为采用SNP5标记检测10个羊草品种/品系的基因分型图。

图6为采用SNP6标记检测10个羊草品种/品系的基因分型图。

图7为采用SNP7标记检测10个羊草品种/品系的基因分型图。

图8为采用SNP8标记检测10个羊草品种/品系的基因分型图。

图9为利用开发的SNP标记构建的10个羊草品种/品系的指纹图谱。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

KASP 2×Master Mix：英国LGC公司，货号：KBS-1016-017。

荧光定量PCR仪：罗氏LC480。

吉生1号羊草品种、吉生2号羊草品种、吉生3号羊草品种、吉生4号羊草品种、农牧1号羊草品种、中科1号羊草品种、中科2号羊草品种和中科3号羊草品种：参考文献：刘公社，李晓霞，齐冬梅，等.羊草种质资源的评价与利用[J].科学通报，2016(2)：271-281.；公众可以从中国科学院植物研究所获得。

NL16羊草品系和S4-2羊草品系：公众可以从中国科学院植物研究所获得。

实施例1、SNP标记引物组合的开发

一、特异性SNP位点

对羊草进行转录组测序和SNP分析，从中选取了8个用于鉴别羊草品种的SNP位点。

SNP1及其附近的核苷酸如序列表的序列1所示，其中第61位核苷酸为SNP位点，为T/A多态。

SNP2及其附近的核苷酸如序列表的序列2所示，其中第61位核苷酸为SNP位点，为G/C多态。

SNP3及其附近的核苷酸如序列表的序列3所示，其中第61位核苷酸为SNP位点，为C/T多态。

SNP4及其附近的核苷酸如序列表的序列4所示，其中第61位核苷酸为SNP位点，为A/G多态。

SNP5及其附近的核苷酸如序列表的序列5所示，其中第61位核苷酸为SNP位点，为C/A多态。

SNP6及其附近的核苷酸如序列表的序列6所示，其中第61位核苷酸为SNP位点，为G/C多态。

SNP7及其附近的核苷酸如序列表的序列7所示，其中第61位核苷酸为SNP位点，为T/C多态。

SNP8及其附近的核苷酸如序列表的序列8所示，其中第61位核苷酸为SNP位点，为C/A多态。

二、SNP标记引物组合

针对步骤一的8个SNP位点设计引物，引物信息如表1所示(均为单链DNA分子)。

表1引物信息

表1中，SNP1-F1、SNP2-F1、SNP3-F1、SNP4-F1、SNP5-F1、SNP6-F1、SNP7-F1和SNP8-F1中的下划线部分为标签序列A，SNP1-F2、SNP2-F2、SNP3-F2、SNP4-F2、SNP5-F2、SNP6-F2、SNP7-F2和SNP8-F2中的下划线部分为标签序列B。

实施例2、鉴定羊草品种

待测样本：吉生1号羊草品种、吉生2号羊草品种、吉生3号羊草品种、吉生4号羊草品种、农牧1号羊草品种、中科1号羊草品种、中科2号羊草品种、中科3号羊草品种、NL16羊草品系和S4-2羊草品系。

1、随机取待测品种/品系羊草叶片，提取基因组DNA。

2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，分别采用实施例1中的SNP1引物组、SNP2引物组、SNP3引物组、SNP4引物组、SNP5引物组、SNP6引物组、SNP7引物组和SNP8引物组进行PCR扩增，得到扩增产物。

PCR扩增反应体系(10μL)：模板DNA2μL(50ng)，引物工作液0.14μL，KASP 2×Master Mix 5μL，用无菌超纯水补至10μL。实验同时设置反应体系中不添加模板DNA的空白对照。

引物工作液：上游引物各12μL，下游引物30μL，用无菌超纯水补至100μL。

引物均以引物溶液形式加入至引物工作液中，各条引物在引物溶液中的初始浓度均为100μM。

KASP 2×Master Mix由荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A、淬灭探针B、高保真的Taq酶和dNTP等组成。荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A、淬灭探针B均为单链DNA分子。

荧光探针A的序列与标签序列A相同(5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′)，5′末端连接1个荧光基团FAM；

荧光探针B的序列与标签序列B相同(5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′)，5′末端连接1个荧光基团HEX；

淬灭探针A的序列与标签序列A的序列反向互补(5′-AGCATGAACTTGGTCACCTTC-3′)，3′末端连接淬灭基团BHQ；

淬灭探针B的序列与标签序列B的序列反向互补(5′-AATCCGTTGACTCCGACCTTC-3′)，3′末端连接淬灭基团BHQ。

PCR反应程序：94℃预变性15min；94℃变性20s、61℃复性60s，共10个循环；94℃变性20s，55℃复性60s，共26个循环；37℃读取1min。扩增结束后，若待测样品分型结果不明显，可补充PCR扩增反应，反应程序为：94℃变性20s、57℃复性60s，共3个循环；37℃读取1min。

3、使用荧光定量PCR仪(罗氏LC480)对步骤2得到的各引物组的PCR扩增产物进行扫描，FAM激发波长为465nm，发射波长为510nm，HEX激发波长为533nm，发射波长为580nm。

4、采用荧光定量PCR仪(罗氏LC480)自带的Endpoint Genotyping软件对步骤3得到的扫描数据进行基因分型分析(具体分析方法参考软件说明书)，结果如图1-图8所示。图1-图8依次为采用SNP1引物组、SNP2引物组、SNP3引物组、SNP4引物组、SNP5引物组、SNP6引物组、SNP7引物组和SNP8引物组对各品种/品系羊草进行鉴定的基因分型图。图1-图8中，横坐标为荧光值(465nm-510nm)，纵坐标为荧光值(533nm-580nm)。

根据分析结果按照如下确定待测羊草品种的具体基因型：聚合在接近X轴(显示蓝色)的样本的基因型为连接FAM荧光标签序列的等位基因型，聚合在接近Y轴(显示绿色)的样本的基因型为连接HEX荧光标签序列的等位基因型，聚合在中间(显示红色或粉色)的样本的基因型为两种等位基因的杂合型，聚合在左下角显示灰色的样本为空白对照。

基因分型结果统计如表2所示。根据基因分型结果统计得到的柱形图，如图9所示。图9中，1-10依次为中科1号羊草品种、吉生1号羊草品种、吉生2号羊草品种、中科2号羊草品种、中科3号羊草品种、吉生3号羊草品种、吉生4号羊草品种、NL16号羊草品系、S4-2号羊草品系和农牧1号羊草品种，不同高度的柱形图代表该SNP标记的不同等位基因型。

表2基因分型结果统计

根据以上实验结果，可以成功鉴别吉生1号羊草品种、吉生2号羊草品种、吉生3号羊草品种、吉生4号羊草品种、农牧1号羊草品种、中科1号羊草品种、中科2号羊草品种、中科3号羊草品种、NL16羊草品系和S4-2羊草品系。

<110> 中国科学院植物研究所

<120> 用于羊草品种鉴定的SNP标记引物组合及鉴定方法

<160> 32

<210> 1

<211> 121

<212> DNA

<213> 羊草

<220>

<221> misc_feature

<222> (61)..(61)

<223> n is t or a

<400> 1

aaagcgcctt gtggtcgtaa tatgctcaag atttttatca gggaatcaac atcacaaaac 60

nctccatgga tcgtacatat gaatcttgca aagaaatatg gcatacccac tgagcctcca 120

a 121

<210> 2

<211> 121

<212> DNA

<213> 羊草

<220>

<221> misc_feature

<222> (61)..(61)

<223> n is g or c

<400> 2

gctcgaccac gcgacgctcg acaacctgct cgtccaggcg ccgtccggga cgagcagctt 60

ntacgacgtg agcctggtgc tcaggttcct ggaggcgttc ctgcgccacg gggacgagcc 120

g 121

<210> 3

<211> 121

<212> DNA

<213> 羊草

<220>

<221> misc_feature

<222> (61)..(61)

<223> n is c or t

<400> 3

ctttgcttca ggaaattcat gggctacatg ataaaggtgt ttccgttgag aacatctctt 60

ntcatctttc gccgtgggct tctgcactat ttgactttct gcctccattt atcaggaaac 120

a 121

<210> 4

<211> 121

<212> DNA

<213> 羊草

<220>

<221> misc_feature

<222> (61)..(61)

<223> n is a or g

<400> 4

actggggaag catgataagc taattagcat cgatgacaga aacatttttc tctggaacat 60

ngatccatca aataaatcag ccaaggtgat atcacaggga tctgctgaca tgcttcccaa 120

t 121

<210> 5

<211> 121

<212> DNA

<213> 羊草

<220>

<221> misc_feature

<222> (61)..(61)

<223> n is c or a

<400> 5

gagctttgtg gggttcacaa tgctgctctt agtgcacagc ctgcattggt gcagaatgaa 60

nagaaactgc ttgagaagat caatattctg tgtctgatgg agataatctt cagccggcca 120

t 121

<210> 6

<211> 121

<212> DNA

<213> 羊草

<220>

<221> misc_feature

<222> (61)..(61)

<223> n is g or c

<400> 6

gcagccgcgg ttaaacttga ggttgtgcag gatcaaaaga ctgagaacaa ttaccgcgac 60

nagaagggcc acttgttgtt tgacctcaac gatgatccaa acatggcgga ggagtggtaa 120

g 121

<210> 7

<211> 121

<212> DNA

<213> 羊草

<220>

<221> misc_feature

<222> (61)..(61)

<223> n is t or c

<400> 7

gtggcatcca catccgcggg ctttgacagg agctctatat ccgccggtaa agtacccaca 60

natgaaaatg gagttaccat gtcatgtgat actcgaccaa cgcctccgtt acagcagcag 120

a 121

<210> 8

<211> 121

<212> DNA

<213> 羊草

<220>

<221> misc_feature

<222> (61)..(61)

<223> n is c or a

<400> 8

ggatgatgat ggtcgttccg tggcagtgct taggcaagat atgctcagtg ctgtagagag 60

ngaactggaa gcgctctctg cgcgagcgga tgaagttaag ctcgagtggt ataggaagac 120

a 121

<210> 9

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 9

gaaggtgacc aagttcatgc taagattcat atgtacgatc catggaga 48

<210> 10

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 10

gaaggtcgga gtcaacggat taagattcat atgtacgatc catggagt 48

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 11

cgccttgtgg tcgtaatatg ctcaa 25

<210> 12

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 12

gaaggtgacc aagttcatgc tgtccgggac gagcagcttg 40

<210> 13

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 13

gaaggtcgga gtcaacggat tgtccgggac gagcagcttc 40

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 14

tgagcaccag gctcacgtcg ta 22

<210> 15

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 15

gaaggtgacc aagttcatgc taagcccacg gcgaaagatg ag 42

<210> 16

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 16

gaaggtcgga gtcaacggat tgaagcccac ggcgaaagat gaa 43

<210> 17

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 17

taaaggtgtt tccgttgaga acatctctt 29

<210> 18

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 18

gaaggtgacc aagttcatgc taccttggct gatttatttg atggatct 48

<210> 19

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 19

gaaggtcgga gtcaacggat tccttggctg atttatttga tggatcc 47

<210> 20

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 20

cgatgacaga aacatttttc tctggaacat 30

<210> 21

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 21

gaaggtgacc aagttcatgc tgaatattga tcttctcaag cagtttctg 49

<210> 22

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 22

gaaggtcgga gtcaacggat tagaatattg atcttctcaa gcagtttctt 50

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 23

acagcctgca ttggtgcaga atgaa 25

<210> 24

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 24

gaaggtgacc aagttcatgc tgactgagaa caattaccgc gacg 44

<210> 25

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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<400> 25

gaaggtcgga gtcaacggat tgactgagaa caattaccgc gacc 44

<210> 26

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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tgaggtcaaa caacaagtgg ccctt 25

<210> 27

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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<400> 27

gaaggtgacc aagttcatgc tccgccggta aagtacccac at 42

<210> 28

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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gaaggtcgga gtcaacggat tccgccggta aagtacccac ac 42

<210> 29

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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gagtatcaca tgacatggta actccattt 29

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<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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<400> 30

gaaggtgacc aagttcatgc tatatgctca gtgctgtaga gagc 44

<210> 31

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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gaaggtcgga gtcaacggat tagatatgct cagtgctgta gagaga 46

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 32

gcgcagagag cgcttccagt t 21