本发明涉及一种抽样检测方法，尤其是涉及一种基于DNA分子标记的初烤烟叶品种纯度抽样检测方法。
背景技术：
烤烟品种特色优质品种红花大金元、K326、云系等深受卷烟工业企业的青睐，市场优势明显。由于受利益驱使、毗邻产区补贴政策、超产或减产等诸多因素的影响下，杂劣品种进入收购环节和烟叶跨产区流动时有发生，产区烟叶品种纯度波动真实存在。并且，随着宏观经济环境下行压力加大，控烟环境日趋严厉，工业企业烟叶原料库存高位运行和原料定额采购，烟叶市场需求拐点显现。已有部分工业企业提出对质量特点不明显、品种纯度不稳定、收购等级质量不高的产区下调需求计划。
目前，还缺少科学有效的收购和工商交接环节烤后烟叶品种纯度抽样检测方法，品种的判定主要依据外观形态特征和判断者的经验。但烤后烟叶的外观形态受遗传、环境、烘烤等因素的多重影响，并非是截然可辨的特征，特别是非正常气候和生产条件下的烟叶外观形态较为混杂，变化规律复杂，容易引起误判，判定准确率较低。
烤烟国标是目前分级、交售、收购、工商交接唯一可执行的强制标准。烤烟国标(GB2635-92)7.1.2和8.2.1中规定了抽样数量，但从成本和时效性上考虑对于DNA分子标记品种检测显然无法抽取如此大样品数量进行逐一检测。烤烟收购和工商交接工作中唯一可执行的标准为烤烟国标GB2635-92。烤烟国标中7.1.2和8.2.1中规定了抽样数量，但对于DNA分子标记检测这类成本较高的检测方法，样本抽样数量过大不具有现实可行性。
由此可见，现有的烤烟的抽样检测方法存在着抽样量大，检测效果差，效率低，成本高的缺陷，亟待进一步改进。
技术实现要素：
本发明的目的是提供基于DNA分子标记的初烤烟叶品种纯度检测方法，以解决现有技术的问题。
为实现上述目的，本发明提供一种基于DNA分子标记的初烤烟叶品种纯度抽样检测方法，其包括以下步骤：
步骤A：针对不同烤烟品种，进行亲本的SSR引物筛选，筛选出不同品种间有差异的SSR引物；
步骤B：根据产烟区和待抽检烟叶的量，确定抽检批次；
步骤C：从每批次的样品中随机抽取100片初烤烟叶，重复取样3次，总共取样数量为300片，重复样品用于补缺检测或复检；
步骤D：提取步骤C中的样品初烤烟叶的基因组DNA；
步骤E：对所述样品初烤烟叶的基因组DNA进行质量评价；
步骤F：利用被检测的样品初烤烟叶品种的SSR引物进行PCR检测；
步骤G：对PCR扩增产物进行检测；
步骤H：对检测的结果进行分析计算，确定品种纯度合格率。
本发明的一个实施例中，所述步骤B中，抽检批次应覆盖所有产烟区，抽检的批次按照2万担/批次进行抽取，产量低于2万担的产烟区，不少于1批次。
本发明的一个实施例中，所述步骤D中，所述基因组DNA提取的步骤如下：
步骤D1：对抽取的样品初烤烟叶烘干，并研磨粉碎至烟叶粉末；
步骤D2：取所述烟叶粉末70-100mg，并加入300-500μl裂解液，65℃水浴10-30min，加入100-200μl提取液，室温放置2-10min，12000r/min离心8-15min，取上清液加入96孔深孔板；
步骤D3：利用BioMek NXp自动化工作站进行DNA提取；
本发明的一个实施例中，所述步骤E中，通过紫外吸收法对所提取的DNA进行检测，当在260nm处有明显的吸收峰时，所述DNA质量合格。
本发明的一个实施例中，所述步骤F中，SSR标记PCR扩增反应体系为：
10×PCR buffer，1.25μl；
dNTP，0.2μl；
TaqDNA polymerase，0.2μl；
灭菌水，6.95μl；
正向引物，0.2μl；
反向引物，0.2μl；
模板DNA，1μl。
本发明的一个实施例中，所述步骤F中，PCR反应程序为：94℃预变性5min后，进入35个循环，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸7min，35个循环结束后72℃延伸10min，16℃保存。
本发明的一个实施例中，所述步骤G中，所述PCR扩增产物通过聚丙烯酰胺电泳进行检测。
本发明的一个实施例中，所述步骤H中，对检测的结果进行分析计算时，品种纯度合格率＝抽检合格批次/抽检总批次×100％。
本发明的一个实施例中，所述烤烟品种为红花大金元、K326、云系。
本发明的有益效果为：
本发明利用DNA分子标记进行初烤烟叶品种纯度鉴定，通过BioMek NXp(Beckman)自动化工作站与磁珠法植物DNA提取试剂盒相结合的批量提取初烤烟叶的DNA，结合PCR和电泳体系，将整个检测周期缩短到半个工作日，大大提高了检测的效率。本发明对被抽检初烤烟叶抽样时，抽样量少，检测准确率高，检测成本低，检测时间短。
具体实施方式
本发明的一种基于DNA分子标记的初烤烟叶品种纯度抽样检测方法，只需要检测较少数量的样本就可以推断一批样本总体的品种纯度，本发明的DNA分子标记的初烤烟叶抽样检测方法包括以下步骤：
步骤A：针对不同烤烟品种，进行亲本的SSR引物筛选，筛选出不同品种间有差异的SSR引物。其中，该烤烟品种为红花大金元、K326、云系。
步骤B：根据产烟区和待抽检烟叶的量，确定抽检批次，抽检批次应覆盖所有产烟区，抽检的批次按照2万担/批次进行抽取，产量低于2万担的产烟区，不少于1批次。
步骤C：从每批次的样品中抽取100片初烤烟叶，重复取样3次，总共取样数量为300片，重复样品用于补缺检测或复检。
步骤D：提取样品初烤烟叶的基因组DNA，该初烤烟叶的基因组DNA提取的步骤如下：
步骤D1：对抽取的初烤烟叶样品进行低温烘干，温度小于18℃，然后研磨烘干后的初烤烟叶粉碎至烟叶粉末。
步骤D2：取所述烟叶粉末70-100mg，并加入300-500μl裂解液，65℃水浴10-30min，加入100-200μl提取液，室温放置2-10min，12000r/min离心8-15min，取上清液加入96孔深孔板；
步骤D3：利用BioMek NXp自动化工作站进行DNA提取；
步骤E：对所述初烤烟叶的基因组DNA进行质量评价，通过紫外吸收法对提取的DNA进行检测，当在260nm处有明显的吸收峰时，表明该DNA质量合格。
步骤F：利用被检测的样品初烤烟叶品种的SSR引物，进行PCR检测；SSR标记PCR扩增反应体系为：10×PCR buffer(with 25mM Mg2+)1.25μl；dNTP(2mM)0.2μl；TaqDNA polymerase(5U/μl)0.2μl；灭菌水6.95μl；正向引物(10μM/L)0.2μl；反向引物(10μM/L)，0.2μl；模板DNA(50ng/μl)1μl。PCR反应结束后，在10μl PCR产物中加入2μl上样缓冲液(0.25％溴酚蓝+0.25％二甲苯青+40％蔗糖水溶液)混匀备用(电泳)。
步骤G：利用被检测的样品初烤烟叶品种的SSR引物，对PCR的扩增产物进行检测，PCR反应程序为：94℃预变性5min后，进入35个循环，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸7min，35个循环结束后72℃延伸10min，16℃保存。
本发明的PCR产物采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，其采用Bio-Rad PowerPAC3000和北京六一厂DYY-6C型电泳仪和北京六一仪器厂DYCZ-30/28B和DYCZ-28A型电泳槽进行。其中DYCZ-30/28B型电泳槽用来分离常规PCR产物片段，DYCZ-28A型电泳槽用于分离经DYCZ-30/28B电泳后不能明显进行观察读带的PCR产物片段。用废弃的琼脂糖凝胶放置于微波炉中融化，将烘干并擦拭干净的电泳槽玻璃板装好密封胶条后，用融化的琼脂糖凝胶封底，封2次最佳，待琼脂糖凝胶凝固后，小心地将玻璃板装入电泳槽中并拧紧电泳槽两侧的螺丝旋钮。根据PCR产物的分子量，按上述配方配制10％或8％聚丙稀酰胺凝胶混液，摇匀后将胶液小心灌入电泳槽玻璃板的缝隙中，检查是否有气泡，并插好梳子。待胶凝固约半小时后，向电泳槽中加入足量的0.5×TBE缓冲液，预电泳10min。预电泳结束后，吸取每份样品1.5-2.0μl上样，350V恒压电泳，电泳时间自行控制，一般待二甲苯青指示剂移至胶底部2/3时，终止电泳。
对PCR扩增产物电泳完毕后进行银染，银染的具体步骤如下：
步骤A：电泳完毕后，首先往染色托盘中倒入足量固定液，以淹没所有胶板为标准，小心剥取聚丙稀酰胺凝胶，打孔标记后放入盛有固定液的托盘，置于摇床上轻轻摇动固定6分钟。
步骤B：固定完毕后，将固定液倒入回收瓶，放入适量AgNO3染色液至浸没所有聚丙稀酰胺凝胶板，放置于摇床上轻轻摇动染色12分钟。
步骤C：染色完毕后，将AgNO3染色液倒入回收瓶，向染色托盘中快速放入漂洗液，用手轻摇染色托盘漂洗半分钟，重复两次，计时从漂洗液倒入那一刻开始。
步骤D：然后倒净漂洗液，快速倒入预先配好的显色液，置于摇床上轻轻摇动直至显现出清晰谱带。
步骤E：待显色完全后，用去离子水漂净残余的显色液后放入保存液或立即进行观察。
步骤H：对检测的结果进行分析计算，品种纯度合格率＝抽检合格批次/抽检总批次×100％。
本发明基于DNA分子标记的初烤烟叶品种纯度抽样检测方法，其数学模型为：
假设某批烟叶含有其他品种烟叶的片数的百分比为p，每片烟叶为该品种或者为其它混杂品种，那么该批烟叶的品种纯度为1-p。由于混杂其他品种烟叶的概率为p，所以任取一片取得其他品种烟叶片数X服从“0-1”分布即
P(X＝x)＝px(1-p)1-x，x＝0或1，现从总体某批烟叶中抽取样本容量为n的样本X1，X2，…Xn，则当n较大时，由中心极限定理可知，随机变量
近似服从正态分布Yn～N(0,1)。
若样本中检出混杂品种的片数为m，则样本平均值用此来估计总体的混杂率，设定置信概率为1-α，则有
由不等式得该式可改写成ap2+bp+c<0，其中xi＝0或1(i＝1，2，…，n)，因此于是有
设二次三项式ap2+bp+c的两个实根为
则混杂率p的置信概率为100(1-α)％的置信区间为
进一步的，本发明对初烤烟叶抽样检测的结果进行分析时采用序贯抽样检验方案，参照其它农产品以烟叶品种纯度达到95％合格为理论参数，即p＝5％，论证本抽样方案。
当第一样本数量为30时，此样本中有很大可能全为真实品种(由概率统计理论知，在同样的可靠性和精确度下，样本越小，合格的允许样本混杂其它品种概率越小，即混杂其它品种被控制越严)，没有混杂品种，此时可以求出样品中混杂率的置信上限可以推断出其总体的混杂率为(0，)区间内。设置信概率(1-α)＝90％，查得zα＝1.282，当p＝0.05，n＝30，m＝0时a＝n+zα＝30+1.2822＝31.643，-b＝1.2822＝1.643，c＝0，即若抽取n＝30片烟叶，经分子标记检测，若未检出其它品种叶片可以有90％的把握确定该批烟叶的混杂率在0-5.19％之间。
其余情况该批烟叶的混杂率的推断详见表1，计算方法与举例置信区间的推断方法相同。表1中不合格批次的判定是指如果达到相应的累计抽样数，其中混其他品种的片数达到表格中的阈值即判定该批次烟叶不合格。
例如从某批次烟叶中抽取30片烟叶进行分子标记检测，如果该批次检出其它品种的片数大于等于4片，则该批次烟叶判定为不合格批次，并且有80％的把握认为该批烟叶的品种混杂率的区间为(7.26％，23.22％)。
因为zα＝1.282，即P(7.26％＜p＜23.22％)＝80％。
本发明采用80％的置信概率作为品种纯度不合格烟叶批次的判定是合适的，由于正态分布的对称性，有10％的批次的混杂率小于7.26％，还有10％的批次混杂率大于23.22％，也就是说有不到10％的可能，这批烟叶仍为品种纯度合格烟叶。换而言之，如果30片样本中一旦出现4片其他品种的烟叶，就把它判定为不合格，那么错判的概率小于10％，该批次烟叶品种纯度真实不合格的概率大于90％。如果30片样本中出现5，6，7…片那么该批次烟叶品种纯度判定为不合格，如混杂其他品种的片数在1～3片之间，则再抽检30片进行检验，对应表1中的累计抽样数70中阀值进行判定，依次类推。
最大抽样数的决定，在实际检验过程中很可能会出现多次检验均未达到判定阈值的情况，即累计的混杂片数总是介于序贯抽样表所列的上下限之间而难以确定其混杂率，使检验不能终止。因此，需要计算最大抽样数nmax来终止抽样过程，以累计抽样片数最接近判定阈值的界限作为结论。根据Karandinos提出的nmax＝t2Pt(1-Pt)/d2可以计算出最大抽样数。其中nmax为最大抽样数；t＝1.96，即90％置信水平下的正态离差值；P＝0.05，即为混杂率；d＝0.05为允许误差值。因此，nmax＝t2Pt(1-Pt)/d2＝1.9620.05(1-0.05)/0.052＝72.99
表1序贯抽样参考表
“--”代表此项为空
本发明利用DNA分子标记进行初烤烟草品种纯度检测，并且基于BioMek NXp(Beckman)自动化工作站与磁珠法植物DNA提取试剂盒相结合的批量提取初烤烟叶DNA，结合PCR和电泳体系，将整个检测周期缩短到半个工作日，大大提高了检测的效率。本发明基于DNA分子标记的初烤烟叶品种纯度检测抽样方法，其抽样量少，检测准确率高，成本低，时间短。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，本领域技术人员利用上述揭示的技术内容做出些许简单修改、等同变化或修饰，均落在本发明的保护范围内。