应用RPA技术对转基因玉米BT11品系特异性鉴定的制作方法

本发明涉及一种品系鉴定方法，特别涉及一种应用RPA技术对转基因玉米BT11品系特异性鉴定。

背景技术：

PCR技术是DNA扩增最常用的方法，但这一方法有其自身的弊端，如需要精密的仪器以及繁琐的试验流程、不能用于现场检测等。核酸等温扩增技术(isothermal nucleic acid amplification technology)是一种新型的扩增技术，只需在恒定温度条件下即可进行反应，且具有简便、快速、灵敏等优点，相对于PCR技术来说有很大的优势。目前等温扩增技术主要有四种，包括环介导的等温扩增(LAMP)、核酸序列依赖性扩增(NASDA)、链置换扩增(SDA)以及重组酶介导的等温扩增(RPA)。

RPA技术模拟了生物体内DNA复制的过程，重组酶蛋白在ATP参与下与单链DNA(引物)结合，形成DNA核蛋白微丝。该微丝牵扯周围的DNA分子，对模板DNA序列进行比对，搜索出与之匹配的序列。在单链结合蛋白的帮助下，双链模板DNA解链，引物和模板配对形成复制起始所需3’羟基末端，在DNA聚合酶的作用下开始复制延伸，并形成新的DNA。RPA的引物长度在35nt左右，在设计引物时应避免前后引物之间形成二级结构、GC含量尽量控制在40％-60％之间以及尽量避免引物出现重复序。RPA反应的探针也需具有特殊的结构和修饰方式，在探针的中后部选择两个T碱基，各标记一个荧光集团(FAM和BHQ1)，在两个集团之间有一个脱碱基位点(dSpacer)，该位点在反应过程中被核酸外切酶识别并切割，使两个荧光集团分离产生荧光信号，且特异性的探针可以实时监测荧光检测的结果，RPA荧光检测技术在20分钟内就可以完成，因此在短时间内就可以快速扩增出目的片段。

转基因玉米BT11是先正达种子有限公司研发的产品，具有抗虫和耐除草剂特性，是目前用于加工食品和饲料较多的转基因玉米品系之一。BT11转基因玉米已经在美国(1996)、欧盟(1998)、中国(2004)等国家和地区进行大面积种植并作为食品和饲料广泛应用。在已报道的对转基因玉米BT11检测方法中，主要是利用PCR仪在实验室中进行常规检测，也有应用于环介导的等温扩增(LAMP)技术对其进行检测，目前还没有利用RPA技术对其进行基因特异性鉴定。

技术实现要素：

针对上述领域的空白，本发明提供了准确、快速、简便检测转基因玉米BT11品系特异性的检测方法。

一种应用RPA技术对转基因玉米BT11品系特异性鉴定的引物和探针，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

一种鉴定转基因玉米BT11品系的试剂盒，包含上述的引物和探针。

一种应用RPA技术对转基因玉米BT11品系特异性鉴定的方法，提取待测样品的DNA作为模板，利用权利要求1所述的引物及探针进行RPA快速扩增及实时荧光检测，如果得到扩增曲线，则证明所检样品含有转基因玉米BT11成分；如果得不到扩增曲线，则证明所检样品不含有转基因玉米BT11成分。

所述RPA快速扩增的反应体系为50μl，包括10μmol/L的引物各2μl，10μmol/L的探针0.5μl，模板DNA 50ng，缓冲溶液Buffer 29.5μl，其余用去离子水补齐。

所述RPA快速扩增及实时荧光检测的程序为：RPA扩增检测仪或荧光定量PCR仪于39摄氏度反应20分钟；同时进行实时荧光检测。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明根据外援插入DNA序列与玉米基因组的连接区域设计大量RPA引物，从中筛选出一对可快速有效检测出转基因玉米BT11成分的引物及探针组合。以转基因玉米BT11为模板，利用该对引物和探针进行荧光检测，可以得到明显的扩增曲线，以其他转基因玉米品系MON810等5种玉米材料以及非转基因玉米的基因组DNA为模板均没有产生扩增曲线。将模板DNA用水稀释至2000，1000，500，100，50，10个拷贝，结果只有10拷贝时未能扩增，其它都有扩增曲线，具有较高的灵敏度。本发明首次提供了转基因玉米BT11品系特异性的RPA检测方法。

附图说明

图1为BT11引物筛选Basic电泳图，其中，1：100bp Maker；2：BT11-F1与BT11-R1；3：BT11-F2与BT11-R2；4：BT11-F3与BT11-R3；5：BT11-F4与BT11-R4；6：100bp Maker；7：BT11-F5与BT11-R5；8：BT11-F6与BT11-R6；9：BT11-F7与BT11-R7；10：BT11-F8与BT11-R8；11：100bp Maker。

图2为BT11引物筛选实时荧光检测图，其中，1：BT11-F1与BT11-R1；2：BT11-F2与BT11-R2；3：BT11-F3与BT11-R3；4：BT11-F4与BT11-R4；5：BT11-F5与BT11-R5；6：BT11-F6与BT11-R6；7：BT11-F7与BT11-R7；8：BT11-F8与BT11-R8。

图3为BT11特异性检测图，其中，1：转基因玉米BT11；2：转基因玉米MON810；3：转基因玉米MON863；4：转基因玉米MON89034；5：转基因玉米NK603；6：转基因玉米BT176；7：非转基因玉米；8：水。

图4为灵敏度检测图，从1到8模板拷贝数依次为2000；1000；500；100；50；10；0。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等的《分子克隆：实验室手册》(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)中所述条件，或按照仪器或试剂制造厂商所建议的条件。

实施例1

首先根据转基因玉米BT11转化体特异性区域设计引物及探针。引物长度为35nt左右，RPA实验需要从靶标序列两端设计多对引物进行优化、筛选，个别碱基的增减或替换都会对实验结果产生重要影响。本实验中设计了大量的引物，并从中筛选出来有一对灵敏度高且特异性好的引物用于RPA荧光检测。引物和探针序列见表1。

表1

注:FAM：发光集团；dSpacer：脱碱基位点；BHQ1：淬灭集团；block：封闭集团，本次使用的碳酸化。

1.实验材料

1.1植物材料

转基因玉米BT11标准物质，转基因玉米MON810标准物质，转基因玉米MON89034标准物质，转基因玉米MON863标准物质，转基因玉米NK603标准物质，转基因玉米BT176标准物质，非转基因玉米等材料。

1.2酶与试剂

分子生物学试剂，TwistAmp DNA amplification Exo Kits购自TwistDX公司，TwistAmp DNA amplification Basic Kits购自TwistDX公司，其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯。引物和探针由北京生工生物技术有限公司合成。

1.3实验仪器

DNA处理仪器：低温混合球磨仪ΜM400(Retsch)

荧光检测仪：RPA扩增检测仪(Twista)

其它仪器包括：恒温水浴锅、电子天平、离心机、纯水仪等。

2.实验方法和过程

2.1玉米基因组DNA的提取

以转基因玉米标准品粉末为材料，依照TianGen Plant Genomic DNA Kit试剂盒的操作手册，进行玉米DNA的提取。

1.取充分碾磨新鲜玉米粉末150mg，加入700μl 65摄氏度预热的缓冲液GP1，64℃水浴60min，期间颠倒离心管数次以混合样品。

2.加入1：1的酚/氯仿进行抽提，12000rpm离心5min。

3.取上清加入700μl氯仿充分混匀，12000rpm离心5min。

4.取上清加入700μl缓冲液GP2，充分混匀。

5.将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12000rpm离心30sec，弃废液

6.向吸附柱中加入500μl缓冲液GD，12000rpm离心30sec,弃废液

7.向吸附柱中加入600μl漂洗液PW，12000rpm离心30sec,弃废液

8.重复7

9.将吸附柱CB3放入收集管，12000rpm空转2min，弃废液，室温放置10分钟

10.将吸附柱CB3转入干净收集管，滴加50μl水，室温放置10min，12000rpm收集到离心管中。

2.2DNA浓度和纯度测定

使用NanoDrop 1000分光光度计(Thermo Scientific)测定DNA的纯度和浓度，并用去离子双蒸水调节DNA浓度至50ng/μl。

2.3引物的筛选

本实施例中用于RPA方法扩增的靶标序列为玉米基因组与外援插入DNA的5’端部分序列。针对这一转化体特异性序列，设计RPA探针并在探针上游与下游分别设计了8条正向引物、8条反向引物。筛选过程中，首先使用RPA-Basic试剂盒进行扩增并进行电泳，筛选能够扩增正确条带的引物再进行RPA-EXO实验。

2.4引物的扩增

RPA扩增体系为：总体系50μl，Rehydration Buffer 29.5μl，280μm Magnesium Actate 2.5μl，引物各2.4μl(10uM)，玉米DNA 1μl(50ng/μl)，剩余用水补足。

引物扩增程序：RPA扩增检测仪39摄氏度反应30分钟，酚：氯仿1:1抽提，电泳。

2.5特异性检测

将筛选出的较好引物对进行特异性检测，检测材料分别为转基因玉米BT11标准物质，转基因玉米MON810标准物质，转基因玉米MON89034标准物质，转基因玉米MON863标准物质，转基因玉米NK603标准物质，转基因玉米BT176标准物质，非转基因玉米。相同50μl体系，进行RPA-EXO实验。

2.6灵敏度检测

将BT11基因组DNA分别稀释如下的拷贝数：400，200，100，20，10，2。相同50μ反应体系各加入5μl的DNA进行RPA-EXO实验测试灵敏度。

3.实验结果

根据转化体特异性序列设计的正向引物和反向引物及探针，运用RPA-Basic试剂盒首先确定能够扩增正确片段的引物(图1)，其中7孔道引物对BT11-F5与BT11-R5扩增条带较好，后改名为BT11-RPA-F(序列如SEQ ID NO.1)与BT11-RPA-R(序列如SEQ ID NO.2)运用RPA-EXO试剂盒进行特异性实时荧光筛选(图2)，其中5号线起飞时间以及扩增效果较好，其引物对与Basic实验7孔道引物对一致。

从上述中筛选出的引物，以转基因玉米BT11为模板可以得到明显的扩增曲线，以其他转基因玉米品系MON810等5种玉米材料以及非转基因玉米的基因组DNA为模板均没有产生扩增曲线(图3)。模板DNA拷贝数分别为2000，1000，500，100，50，10个拷贝，结果只有10拷贝未扩增其它都有扩增曲线(图4)，说明本发明设计引物和方法鉴定转基因玉米BT11具有较高的灵敏度和准确性。

以上公开的仅为本发明的具体实施例，但是，本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 应用RPA技术对转基因玉米BT11品系特异性鉴定

<130> 1111

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

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<212> DNA

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<223> BT11-RPA-F

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ttttataggt taatgtcatg ataataatgg tttct 35

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<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> BT11-RPA-R

<400> 2

tcgatgataa atggccacac aacccccatt tttga 35

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> BT11-RPA-P

<400> 3

aaatctgtag gtgttagcct ctagtattga aaatggt 37