本发明涉及的是嗜水气单胞菌的技术领域，具体的说是一种对虾养殖中嗜水气单胞菌的Lamp检测方法。
背景技术：
在对虾的流行病学研究基础上，确立出白斑综合症病毒(WSSV)、弧菌和嗜水气单胞菌是山东省虾蟹养殖的重要病原，如何快速的检测出对虾中的嗜水气单胞菌是至关重要的。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对现有技术的缺陷和不足，提供了一种嗜水气单胞菌的Lamp检测方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种对虾养殖中嗜水气单胞菌的Lamp检测方法，其步骤是：
1、嗜水气单包菌菌种的培养；
2、嗜水气单胞菌染色体DNA的提取；
3、引物的设计；
4、提模板；
5、LAMP反应体系的建立。
进一步，所述嗜水气单包菌菌种的培养方法是：(1)、取保藏的嗜水气单胞菌在营养肉汁琼脂平板培养基中进行平板划线分离单菌落，放入恒温箱28～30℃倒置培养24h；(2)挑取单菌落接种至3ml的液体培养基(试管)中，放入28～30℃100r/min摇床培养12h；(3)将试管中培养的菌转接入120ml的液体培养基中相同条件下培养12h，4℃下保存备用。
进一步，所述嗜水气单胞菌染色体DNA的提取方法是：移液枪取一嗜水气单胞菌菌落,接种于营养肉汤,于28℃培养18～24h。
进一步，所述提模板的方法是：取1ml嗜水气单胞菌染色体DNA培养液于离心管中，12000r/min离心5min，去掉上清液然后加入100ul无菌水混合，100℃水浴加热10min，冰浴2min，12000r/min离心5min，保留上清液备用。
进一步，所述LAMP反应体系的建立包括温度实验、时间实验、对照实验、敏感性实验、特异性实验。
本发明的有益效果为：检测速度块，检测准确，有效诊断对虾中的致病细菌，提前做好针对性的准备，防止对虾感染，从而预防对虾病害的发生。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一种对虾养殖中嗜水气单胞菌的Lamp检测方法，其步骤如下：
1、嗜水气单包菌菌种的培养：
(1)取保藏的从养殖对虾体内分离的嗜水气单胞菌，在营养肉汁琼脂平板培养基中进行平板划线分离单菌落，放入恒温箱28～30℃倒置培养24h。
(2)挑取单菌落接种至3ml的液体培养基(试管)中，放入28～30℃100r/min摇床培养12h。
(3)将试管中培养的菌转接入120ml的液体培养基中相同条件下培养12h，4℃下保存备用。
2、嗜水气单胞菌染色体DNA的提取：
移液枪取一嗜水气单胞菌菌落,接种于营养肉汤,于28℃培养18～24h。
3、引物的设计：
基于A.hy drophila的Aer基因序列及其相似性比对,设计了4条特异性引物,即F3、B3、FIP和BIP,其序列依次为:
F3:5′-CGGTAAAGCCCTGGACTCT-3′；
B3:5′-CCGCCTTTGTGTCATATCGA-3′；
FIP:5′-GATCAGGATGCCGACACCGAC-GCCCAGTCAGACGTCACT-3′；
BIP:5′-ATGTCTTTGCTCATCGGGACGC-AACGATGCCCTGTAGCCTT-3′。
4、提模板：
取1ml1.2.2培养液于离心管中，12000r/min离心5min。去掉上清液然后加入100ul无菌水混合，100℃水浴加热10min，冰浴2min，12000r/min离心5min，保留上清液备用。
5、LAMP反应体系的建立
(1)、温度实验
取5个PCR管，分别标号1～5。在这五个管中，分别加入表2所示试剂。接着在T100TMThermal Cycler上分别设置温度为61℃、62℃、63℃、64℃、65℃，时间均为90min扩增。扩增完后在电泳仪上电泳，最后在凝胶成像分析仪上得到结果。
表2 LAMP反应体系
(2)、时间实验
取5个PCR管，分别标号1～5。在这五个管中，分别加入表2所示试剂。接着在T100TMThermal Cycler上设置温度均为63℃，时间分别为0min、30min、60min、90min、120min扩增。扩增完后在电泳仪上电泳，最后在凝胶成像分析仪上得到结果。
(3)、对照实验
取2个PCR管，分别标号1和2。管2中加入2ul模板，然后管1和管2分别加入如下表3所示试剂。
表3 LAMP反应体系
接着在T100TM Thermal Cycler上设置温度为63℃，时间为90min扩增。扩增完后在电泳仪上电泳，最后在凝胶成像分析仪上得到结果。
(4)、敏感性实验
将嗜水气单包菌模板分别稀释至10-1～10-8[10]，取8个PCR管，分别标注1～8，在这八个管中依次加入稀释的模板，然后分别加入如下表3所示试剂。然后在T100TM Thermal Cycler上设置温度为63℃，时间为90min扩增。扩增完后在2％的琼脂糖凝胶电泳仪上电泳。最后在凝胶成像分析仪上得到结果。
(5)、特异性实验
取5个PCR管，分别标号1～5。管1中加入2ul嗜水气单包菌标准株的DNA模板，管2中加入2ul温和气单包菌的DNA模板，管3中加入2ul大肠杆菌的DNA模板，管4中加入2ul多杀性巴氏杆菌的DNA模板，管5中加入2ul猪链球菌的DNA模板，然后分别加入表3所示试剂。然后在T100TM Thermal Cycler上设置温度为63℃，时间为90min扩增。扩增完后在电泳仪上电泳。最后在凝胶成像分析仪上得到结果。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。