一组用于区分我国育成芝麻品种的SNP分子标记的制作方法

本发明属于生物育种技术领域，具体涉及一组可准确区分我国育成芝麻品种的snp标记。

背景技术：

芝麻（sesamumindicuml.，2n=26），属胡麻科胡麻属，是我国重要的特色优质油料作物。自上世纪60年代以来至今，我国共育成芝麻新品种151份，其中白芝麻品种135份，黑芝麻品种16份。受芝麻种质遗传基础狭窄、少量优异亲本使用率高等因素影响，目前我国芝麻主栽品种间的遗传差异越来越小，田间表型较为相似，采用田间形态性状指标区分和鉴定芝麻品种的准确度差；加之形态鉴定方法周期长，易受环境及主观因素影响，鉴定结果可靠性较低。因此，开发用于区分不同芝麻品种的分子标记十分必要。

利用ssr、snp等分子标记建立的植物dna指纹鉴定技术，可以用于区分同种植物个体在分子水平上的差异，结果准确、可靠，检测快速，在新品种选育与鉴定方面得到广泛应用。在众多分子标记中，单核苷酸多态位点（snp）标记具有数量多、分布广、多态性丰富、遗传稳定且二等位基因等特点，已被用于多种植物的高质量分子遗传图谱构建、基因定位和农作物种质的遗传特异性分析。但是针对国内众多芝麻品种，由于传统鉴定方法的局限性，现有技术中，尚缺乏一种或一组较好的有针对性的snp标记分子，从而便于相关芝麻品种的鉴定。

技术实现要素：

本发明的在于提供一组用于区分我国育成芝麻品种的snp标记，从而便于相关芝麻品种的鉴定、及相关作为品种的筛选和开发利用。

本发明所采取的技术方案详述如下。

一组用于区分我国育成芝麻品种的snp标记，序列表具体如seqidno.1~45所示，具体而言，如下表1所示：

表1，用于区分151个芝麻品种的15个多态性snp标记引物对信息表：

表中括号内碱基为特异snp位点（括号本身无含义，仅为便于区别相关碱基）。

利用所述用于区分我国育成芝麻品种的snp标记所构建的我国151个芝麻品种的指纹图谱，具体如下表2所示：

表2，我国151个芝麻育成品种的指纹图谱信息表：

指纹图谱中的a、t、c或g分别表示对应着特定多态性snp标记在该品种中的条带类型；

需要说明的是，利用指纹图谱进行鉴定时，由于皖芝4号、皖芝5号与皖芝3号间亲缘关系太近，导致其指纹信息过于一致无法区分，但其他品种均获得了特异性指纹图谱。

利用所述用于区分我国育成芝麻品种的snp标记的芝麻品种区分方法，具体包括如下操作步骤：

（1）种子预处理

挑选待鉴定芝麻种子，灭菌处理后，25℃~28℃、100~120rpm条件下振荡培养至种子露白；

所述灭菌处理具体程序为：先用70%酒精处理30s，再3%的次氯酸钠处理10~15min，最后无菌水冲洗3~5次；

将露白后芝麻种子播种于盛有无菌蛭石的容器中，所述容器例如容量为250ml的纸杯，每个纸杯中可播种10粒露白后芝麻种子；

（2）幼苗培养并dna提取

定期用ms基本营养液进行浇灌，人工气候培养箱培养。培养温度25-28℃、相对湿度为60-80%、每天15h/9h光暗交替；培育至2对真叶后，采集幼嫩叶片；

参照魏利斌等（2008）的改良ctab法提取待鉴品种的dna（魏利斌等，芝麻dna和rna同步提取方法，2008，分子植物育种）；

（3）pcr产物扩增

利用上述用于区分我国育成芝麻品种的snp标记组（15个snp标记引物对），以步骤（2）中所提取待测芝麻品种的基因组dna为模板进行pcr扩增；10μl的pcr反应体系设计如下：

步骤（2）中所提取模板dna，50ng/µl、1.0µl；

10×pcrbuffer(mg²⁺)，1.0µl；

taqase酶，5u/µl、0.2µl；

dntp，10mmol/l、0.2µl；

snp引物组中正向引物（f引物），10µm、0.5µl；

snp引物组中反向引物（r引物），10µm、0.5µl；

超纯水加至为10µl；

pcr反应程序为：

94℃预变性3分钟；之后94℃变性30秒，55℃复性30秒，72℃延伸30秒，循环30次；最后72℃延伸5分钟；4℃保存pcr扩增产物备用或直接进行后续电泳分析；

需要说明的是，pcr反应时，可根据每个snp引物对的tm值，对pcr反应过程中的复性温度进行调整，以确保特异性pcr扩增结果；

（4）对pcr扩增产物分析

对步骤（3）中的pcr扩增产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析；电泳分析时，凝胶质量浓度为8~10%，凝胶大小可设计为：180mm×120mm×2mm，电泳缓冲液为0.5×tbe，150v恒压交流电电泳1.5~2小时；

电泳结束后，进行银染并显色，漂洗后读取数据进行分析；具体而言：电泳结束后，在凝胶加入浓度为0.1%的硝酸银水溶液，置于水平摇床上渗透银染10min；再加入2%氢氧化钠和0.4%甲醛混合溶液，置于水平摇床中适度显色；最后清水漂洗凝胶并记录读取数据。

本发明创新点主要体现在以下几个方面：

（1）本发明开发出了适于鉴定我国芝麻品种的15个snp引物对，同时提供了利用多态性snp位点鉴定芝麻品种的pcr鉴定方法，该方法可以较为便捷和快速地初步确定待测芝麻品种的类型，对开展芝麻品种鉴定和评价具有重要意义，必将在芝麻分子辅助育种中得到较好地应用；

（2）本发明所获得了151个芝麻品种的dna指纹图谱，snp标记序列明确，检测结果稳定可靠，为芝麻新品种选育、良种繁育及种子销售提供了参考。

（3）本发明所提供的snp标记，位于芝麻栽培种的13条染色体组上，分布较为均匀，具有代表性和普遍性，检测结果稳定性好，应用价值高。

与现有芝麻品种鉴定方法相比，本发明优点可以概况为：

（1）本发明首次开发了用于区分芝麻品种的一组多态性snp标记；

（2）本发明开发了用于区分芝麻品种的15个snp引物对，为快速鉴定和评价芝麻品种特异性和亲缘关系提供了技术支撑。

（3）本发明所提供的snp分子标记，为建立芝麻分子辅助育种技术平台提供了理论和数据支持，为选育优异麻新品种提供了高效检测方法。

总之，针对我国现有151个育成芝麻品种，本申请有针对性地进行了snp标记筛选和开发工作，通过筛选所确定的15个多态性snp标记，最终成功构建了151份我国芝麻品种的snp指纹图谱，从而为评价我国芝麻品种遗传特征、特定芝麻品种鉴定等工作提供了理论依据和技术手段，具有较为重要的理论价值和应用意义。

附图说明

图1为多态性snp标记引物对sisnp13-f（ccgtggcttgtggtgact）、sisnp13-1r（gtccaacccctggaagtct）和sisnp13-2r（tataagtccaacccctggaagtcg）在22个芝麻品种中的扩增结果；图中m为dnamarker；具体泳道情况为：

泳道1、2：鄂芝1号；泳道3、4：鄂芝2号；泳道5、6：鄂芝3号；

泳道7、8：赣芝4号；泳道9、10：赣芝5号；泳道11、12：赣芝6号；

泳道13、14：吉芝5号；泳道15、16：吉芝6号；泳道17、18：吉芝7号；

泳道19、20：辽芝1号；泳道21、22：辽芝2号；泳道23、24：漯芝18号；

泳道25、26：漯芝19号；泳道27、28：漯芝20号；泳道29、30：漯芝21号；

泳道31、32：豫芝6号；泳道33、34：豫芝7号；泳道35、36：豫芝8号；

泳道37、38：中芝12号；泳道39、40：中芝13号；泳道41、42：中芝14号；

泳道43、44：中芝15号；

低带为正向引物sisnp13-f（ccgtggcttgtggtgact）和第一个反向引物sisnp13-1r（gtccaacccctggaagtct）的扩增结果，标记为a；高带为正向引物sisnp13-f（ccgtggcttgtggtgact）和第二个反向引物sisnp13-2r（tataagtccaacccctggaagtcg）的扩增结果，标记为c；

图2为15组snp引物对扩增晋芝6号芝麻品种所获得的snp指纹识别带型；图中m为分子量marker；具体泳道情况为：

泳道1、2为sisnp1引物对（分别为a、c标记）；

泳道3、4为sisnp2引物对（分别为g、c标记）；

泳道5、6为sisnp9引物对（分别为g、a标记）；

泳道7、8为sisnp11引物对（分别为t、a标记）；

泳道9、10为sisnp13引物对（分别为a、c标记）；

泳道11、12为sisnp30引物对（分别为a、t标记）；

泳道13、14为sisnp35引物对（分别为c、t标记）；

泳道15、16为sisnp37引物对（分别为c、t标记）；

泳道17、18为sisnp38引物对（分别为t、a标记）；

泳道19、20为sisnp39引物对（分别为a、t标记）；

泳道21、22为sisnp40引物对（分别为a、g标记）；

泳道23、24为sisnp43引物对（分别为g、a标记）；

泳道25、26为sisnp46引物对（分别为c、g标记）；

泳道27、28为sisnp48引物对（分别为c、a标记）；

泳道29、30为sisnp52引物对（分别为t、c标记）；

图中，如果一组引物组合没有dna扩增片段，说明晋芝6号基因组中不含该snp位点类型；一组引物组合扩增出dna片段，说明晋芝6号基因组中含有该snp位点类型；

将晋芝6号的上述15个多态性snp位点pcr扩增信息进行组合，为ccaaaatcatgaccc，即为其dna指纹图谱。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请的技术方案进一步解释如下。在具体介绍实施例前，就下述实施例中部分生物材料及相关实验背景情况简介如下。

生物材料：

下述实施例中所涉及151个芝麻品种均来自于均来自于河南省农业科学院芝麻研究中心种质资源库，为我国现有生产应用中的主要育成品种；

相关引物序列合成及测序工作由上海生工完成并提供；

实验试剂：

pcr扩增中所用试剂均购自于上海生工试剂公司；其他试剂均为常规分析纯试剂，不再单独说明；

实验仪器：

pcr反应在ptc-100(mjresearch公司产品)热循环仪上进行。

实施例1

本实施例主要介绍一下对于本申请中所述15个多态性snp位点标记的筛选过程。具体过程简介如下。

（1）多态性snp标记挑选及引物设计

利用已知的芝麻栽培种豫芝11号基因组（ncbi数据库,prjna315784），并依据芝麻基因组精细图（miaoh.&zhangh.thegenomeofsesamumindicuml.thesesamegenomeworkinggroup.xxivinternationalplantandanimalgenomeconference.sandiego,usa,2016,january,9-13.），参考其他相关资料，针对现有的151个国内芝麻品种，挑选了分布于13条染色体上的52个多态性snp标记；

利用primerpremier5.0软件设计了扩增上述snp标记的引物对；具体snp引物对信息如下表3所示。

需要解释的是，为区分被检测基因组dna的不同snp等位位点，在设计用于pcr扩增用的snp引物时，参考了如下两个设计原则：

（1）将snp引物对设计成3条，并需在特异引物的3’末端第3位的碱基引入错配以增加扩增产物的特异性；

引入错配的原则为：引物3’端-3位错配碱基与3’末端的snp错配碱基形成稳定性互补的错配结构；即强错配型(c／t或g／a)与弱错配型(c／a或g／t)搭配，中等错配型(a／a、c／c、g／g或t／t)与中等错配型搭配；

（2）在含有snp位点的2个正向或反向引物中，将其中1条引物序列的5’端随机增加5个碱基，其主要目的是为了不同位点的pcr产物在后续凝胶电泳图谱区分能够较为便捷地区分开来；

根据上述snp引物设计原则，结合每个snp位点，设计了上述2个正向引物和1个反向引物。

表3，待筛选的52个多态性snp标记：

需要说明的是，表中所列的pcr产物大小为以豫芝11号基因组为模板的pcr扩增结果，从pcr扩增产物大小看出，二者相差5个碱基（引物设计时相差5个碱基的原因），从而便于凝胶成像后能够辨认不同引物对的差异。

（2）制备不同芝麻品种的基因组dna样品

分别取我国育成的151份芝麻品种的适量健康成熟种子，灭菌处理后，25℃~28℃、100~120rpm条件下振荡培养至种子露白；

所述灭菌处理具体程序为：先用70%酒精处理30s，再3%的次氯酸钠处理10~15min，最后无菌水冲洗3~5次；

将露白后芝麻种子播种于盛有无菌蛭石的容器中，所述容器容量为250ml的纸杯，每个纸杯中可播种10粒。

定期用ms基本营养液进行浇灌，人工气候培养箱培养。培养温度25-28℃、相对湿度为60-80%、每天15h/9h光暗交替。培育2对真叶后，采集幼嫩叶片。参照魏利斌等（2008）中的改良ctab法提取各品种的dna（魏利斌等，芝麻dna和rna同步提取方法，2008，分子植物育种）。

（3）利用前述待筛选的52个多态性snp标记进行pcr扩增

以步骤（2）中所提取dna基因组为模板，以步骤（1）中所设计引物对进行pcr扩增，10µl的扩增体系设计如下：

步骤（2）中所提取模板dna，50ng/µl、1.0µl；

10×pcrbuffer(mg²⁺)，1.0µl；

taqase酶，5u/µl、0.2µl；

dntp，10mmol/l、0.2µl；

snp引物组中正向引物（f引物），10µm、0.5µl；

snp引物组中反向引物（r引物），10µm、0.5µl；

超纯水加至为10µl；

pcr反应程序为：

94℃预变性3分钟；之后94℃变性30秒，55℃复性30秒，72℃延伸30秒，循环30次；最后72℃延伸5分钟；4℃保存pcr扩增产物备用或直接进行后续电泳分析；

需要说明的是，pcr反应时，可根据每个snp引物对的tm值，对pcr反应过程中的复性温度进行调整，以确保特异性pcr扩增结果。

（4）对pcr扩增产物分析

对步骤（3）中的pcr扩增产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析；电泳分析时，凝胶质量浓度为8~10%，凝胶大小可设计为：180mm×120mm×2mm，电泳缓冲液为0.5×tbe，150v恒压交流电电泳1.5~2小时；

电泳结束后，进行银染并显色，漂洗后读取数据进行分析；具体而言：电泳结束后，在凝胶加入浓度为0.1%的硝酸银水溶液，置于水平摇床上渗透银染10min；再加入2%氢氧化钠和0.4%甲醛混合溶液，置于水平摇床中适度显色；最后清水漂洗凝胶并记录读取数据。

部分电泳图谱如图1所示。分析表明：多态性snp标记引物对sisnp13-f（ccgtggcttgtggtgact）、sisnp13-1r（gtccaacccctggaagtct）和sisnp13-2r（tataagtccaacccctggaagtcg）在不同品种中的扩增结果有一定差异，表现出品种间具有遗传多样性。其中：

低带型为引物对sisnp13-f（ccgtggcttgtggtgact）和sisnp13-1r（gtccaacccctggaagtct）扩增结果，大小为180bp；

高带型为引物对sisnp13-f（ccgtggcttgtggtgact）和sisnp13-2r（tataagtccaacccctggaagtcg）扩增结果，185bp；二者相差5个碱基；

为区分二者的差异，分别用sisnp13-1r和sisnp13-2r引物中的snp差异位点，即a和c表示。

依据上述原则，对各引物对在每个芝麻品种上的扩增结果进行标注，显示其各snp位点的特异性和多态性。

综合全部pcr结果，最终从52个snp标记中筛选确定了15个多态性snp标记（如前述表1所示，文本简要起见，不再重复列举）。利用这15个snp标记即可将151份芝麻品种区分开来。

进一步地，利用上述标记的pcr结果和snp位点标记方法，将每个品种的15个多态性snp位点组合，形成了各个品种的snp特征信息，即dna指纹图谱。对于我国育成的151个芝麻品种的dna指纹图谱，具体如前述内容的表2所示（文本简要起见，不再重复列举）。依据所构建的151个芝麻品种的dna指纹图谱，可为鉴定和评价芝麻品种的特异性提供充分依据。

需要说明的是，利用指纹图谱进行鉴定时，由于皖芝4号、皖芝5号与皖芝3号间亲缘关系太近，导致其指纹信息过于一致无法区分，但其他品种均获得了特异性指纹图谱。其他149个品种的指纹图谱均具有特异性。图谱中的每一个a、t、c或g字母分别表示不同品种中含有特定多态性snp标记的碱基差异，在pcr结果中均显示了该品种具有的特异性条带类型。分别用特定snp标记的2个引物对对某个品种基因组进行扩增。如果其中的一组引物组合扩增出dna片段，说明该品种基因组中只含有对应引物对的snp位点；如果2个引物对均扩增出dna片段，说明该品种含有2类snp，为杂合型。如果2个引物对均未扩增储dna片段，说明测定品种不属于151份我国育种品种材料范围。

实施例2

本实施以晋芝6号芝麻品种为例，对利用实施例1中所述15个snp多态性位点的鉴定过程及其指纹图谱构建过程进一步简要介绍如下。

取晋芝6号芝麻种子，参考实施例1的幼苗培养过程，并提取基因组dna，以此为模板，利用实施例1中筛选所得15个snp多态性引物对（如表1所示）进行pcr扩增。

最终晋芝6号电泳图谱如图2所示。

晋芝6号的dna指纹图谱构建过程如下：根据上述利用15个snp标记的pcr结果和snp位点标记方法，将晋芝6号的15个多态性snp位点pcr扩增信息进行组合，即ccaaaatcatgaccc；该snp特征信息就是晋芝6号的dna指纹图谱，对比表明，该指纹图谱与其余的150份芝麻品种的snp指纹图谱信息均有明显差异，可以用于区分和鉴定该芝麻品种。

sequencelisting

<110>河南省农业科学院芝麻研究中心

<120>一组用于区分我国育成芝麻品种的snp分子标记

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