一种快速检测奶牛冻精中支原体的方法与流程

本发明涉及牲畜体内支原体感染检测方法技术领域，具体涉及一种快速检测奶牛冻精中支原体的方法。

背景技术：

在冷冻精液的半永久性保存(-196℃)条件下，往往也能延长细菌、病毒、支原体、虫卵等生物体的存活时间。许多病原微生物可以通过精液传播，而且精液传播传染病的能量是很大的，l头带病公牛的冷冻精液可能在数年之内把某些传染病散播到全球几个大陆。现有资料表明:通过冷冻精液传播的一些牛病主要有:口蹄疫、牛结核病副结核病、牛布氏杆菌病、牛毛滴虫病、牛生殖器官弧菌病,各型钩端螺旋体病,支原体病、牛传染性鼻气管炎、传染性脓疤龟头包皮炎、牛病毒性腹泻和副流感、纤维乳头状瘤病、蓝舌病、牛白血病等。

支原体是一类能在无活细胞培养基中繁殖的最小微生物，无细胞壁、繁殖形式多样、具有高度多形性。大部分支原体都是宿主特异性的黏膜常在菌，主要寄生在鼻腔，其次在乳腺。1976年首次报道牛支原体与牛呼吸系统疾病有关，1983年我国黎济申首次报道从患乳腺炎牛乳中牛分离到牛支原体。

目前，牛支原体的分离培养鉴定虽然能够确诊，但操作复杂，所需条件高，主要通过支原体培养和生理生化特性鉴定，这些方法耗费时间长，一般需要3天左右，不利于支原体感染疾病的快速诊断。

技术实现要素：

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种快速检测奶牛冻精中支原体的方法，使得检测时间大大缩短，极大的提高了检测效率。

(二)技术方案

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

一种快速检测奶牛冻精中支原体的方法，步骤如下：(1)将奶牛冻精在常温下解冻2-3min，解冻后取50ul置于1.5ml离心管中，在12000r/min转速下离心5min；(2)将离心后的上清液丢弃，加入0.5mldna提取裂解液，静置5min；(3)静置后继续加入100ul氯仿，混合均匀，12000r/min转速下离心3min，将上清液移到硅胶柱中，12000r/min转速下离心1min；(4)离心后，加入50ul蒸馏水洗脱dna；(5)取2ul洗脱后的dna加入到18ulpcr混合液中，进行pcr反应；(6)选用琼脂糖凝胶电泳检测方法，电泳20min，观察结果。

优选的，步骤(2)所述dna提取裂解液的配制方法为：取57.6g盐酸胍、50ml水饱和酚，加入蒸馏水配置成100ml的溶液。

优选的，步骤(5)所述pcr混合液的配制为：取2.5umdntp、160ul引物1、40ul引物2、40ultaqdna聚合酶、40ul缓冲液，加入640ul蒸馏水配置成0.92ml混合液。

优选的，所述引物1为10umtaatttagaagctttaaatgagcgc，引物2为40umcatatctaggtcaattaaggctttg。

优选的，所述缓冲液中含有1.5umkcl、2.0ummgcl2、3um甘油。

(三)有益效果

本发明提供了一种快速检测奶牛冻精中支原体的方法，通过利用pcr方法，建立基于奶牛支原体核酸检测的快速技术，能在3小时内获得结果，极大的提高了检测效率，为支原体感染疾病治疗和阻止支原体进一步扩散赢得了时间。

附图说明

图1是奶牛精液dna提取结果，图2是奶牛支原体检测结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例：

一种快速检测奶牛冻精中支原体的方法，该方法用到的溶液如下：

dna提取裂解液：取57.6g盐酸胍、50ml水饱和酚，加入蒸馏水配置成100ml溶液。

pcr混合液：取2.5umdntp、160ul引物1、40ul引物2、40ultaqdna聚合酶、40ul缓冲液，加入640ul蒸馏水配置成0.92ml混合液。其中，引物1为10umtaatttagaagctttaaatgagcgc，引物2为40umcatatctaggtcaattaaggctttg，缓冲液中含有1.5umkcl、2.0ummgcl2、3um甘油。

检测步骤如下：

(1)将奶牛冻精在常温下解冻3min，解冻后取50ul置于1.5ml离心管中，在12000r/min转速下离心5min；(2)将离心后的上清液丢弃，加入0.5mldna提取裂解液，静置5min；(3)静置后继续加入100ul氯仿，混合均匀，12000r/min转速下离心3min，将上清液移到硅胶柱中，12000r/min转速下离心1min；(4)离心后，加入50ul蒸馏水洗脱dna；(5)取2ul洗脱后的dna加入到18ulpcr混合液中，进行pcr反应；(6)选用琼脂糖凝胶电泳检测方法，电泳20min，观察结果。

观察结果：如图2所示，说明奶牛冻精中有支原体产物生成。

综上，本发明实施例具有如下有益效果：

本发明提供了一种快速检测奶牛冻精中支原体的方法，通过利用pcr方法，能在3小时内获得结果，极大的提高了检测效率，有利于及时治疗支原体感染疾病。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

技术特征：

技术总结
本发明提供了一种快速检测奶牛冻精中支原体的方法，涉及牲畜体内支原体感染检测方法技术领域，是将解冻后的奶牛冻精离心处理，向上清液中依次加入DNA提取裂解液和氯仿，提取得到DNA，然后进行PCR扩增，最后采用琼脂糖凝胶电泳法检测并观察结果；该检测方法通过利用PCR方法，建立基于奶牛支原体核酸检测的快速技术，能在3小时内获得结果，极大的提高了检测效率，为支原体感染疾病治疗和阻止支原体进一步扩散赢得了时间。

技术研发人员：巴桑旺堆;朱彦宾;李纯锦;罗布;平措占堆;德吉央宗;梁春芳;尼玛;旺久;贡嘎桑布;付丹丹;王闯;次仁卓玛
受保护的技术使用者：西藏自治区农牧科学院农业资源与环境研究所
技术研发日：2017.03.28
技术公布日：2017.08.04