本发明涉及一种ampc基因的实时pcr快速检测系统，属于实时pcr应用技术领域。
背景技术：
耐药菌的危害已遍及全球，耐药性问题成为世界性的新的研究热点。自从第一个抗生素——青霉素发现以来，人类研制、开发了多种抗菌药物，成功地控制和治疗了由细菌引起的感染性疾病。然而，随着抗生素的不断应用，细菌的耐药性问题越来越突出，越来越严重。2000年6月12日路透社报道世界卫生组织的观点：假若人们继续滥用抗生素，对一切药物产生抵抗的“超级细菌”将把人类带回到旧时代，一些小小的感染也会使人丧命。耐药菌产生之快、传播之迅速、耐药率之高引起世界性广泛关注。耐药菌的危害十分严重，它不仅使药物疗效减弱，药物剂量极大，疗程延长，复发率升高，治疗费用增加，有时还引起并发症，某些情况下甚至会使抗生素失去疗效导致病人死亡率升高。细菌耐药性的出现和耐药细菌的感染常使经验型治疗难以奏效，给临床抗感染治疗带来极大的挑战。因此，及时准确地检测细菌的耐药性，对细菌耐药性的变迁和某些重点的耐药细菌进行长期的监测和分析，可为临床抗感染治疗方案的拟定提供有益帮助。
在临床病原菌的各种耐药问题中，以青霉素和头孢菌素为代表的β-内酰胺类抗生素的耐药问题尤其突出，给临床治疗感染性疾病带来极大困难。β-内酰胺类抗生素是现有的抗生素中使用最广泛的一类，它系指化学结构中具有β-内酰胺环的一大类抗生素，主要包括青霉素类、头孢菌素类、头霉素类、碳青霉烯类、单环β-内酰胺类。β-内酰胺类抗生素通过抑制细菌胞壁的粘肽合成酶，阻碍细胞壁的合成而起到杀菌作用。针对β-内酰胺类抗生素，细菌在进化与繁殖过程中也产生了一套防卫机制，其中最重要的方式是产生β-内酰胺酶。β-内酰胺酶可以水解β-内酰胺环中的酰胺键，使之转化成为无活性的衍生物而失去杀菌作用，这是革兰阴性杆菌耐β-内酰胺类抗生素的主要机制。
β-内酰胺酶种类繁多、特性各异，目前已发现的β-内酰胺酶超过300种，其中头孢菌素酶(ampc酶)是临床较为常见的β-内酰胺酶，具有重要的检测意义。质粒ampc酶高水平持续表达，且可通过转化、接合等方式转移给其它菌种，造成耐药性的广泛传播。目前，在大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、奇异变形杆菌、沙门氏菌属中都已发现质粒介导的ampc酶。质粒ampc酶危害严重，这是因为一种质粒可同时携带多个耐药基因，使得产ampc酶的菌株表现出多重耐药性，而且耐药谱呈现扩大趋势。另一方面，质粒的可传递性，使耐药问题越来越严峻，容易引起医院感染的暴发流行。
要减缓和控制耐药菌株的产生，建立一种可靠的检测方法是关键，而如何快速、准确的检测质粒介导的ampc酶是目前临床实验室面临的一个普遍难题。目前用于实验研究和临床检测的常见方法主要有以下几种：头孢西丁纸片法、头孢西丁三维试验、等点聚焦电泳/抑制试验和基因检测方法。前三种方法是利用耐药表型筛选法或抑制剂筛选法对ampc酶进行检测，其缺点是耗时、特异性差、操作繁琐、检测结果易受环境因素影响，所以假阳性率高。基因检测方法可以有效弥补表型检测的缺点，目前使用比较多的是传统pcr方法和dna芯片方法。传统pcr方法根据质粒ampc基因的同源性设计群特异性引物，通过pcr对质粒ampc基因进行扩增。但该方法需要对pcr产物进行电泳分析，开管操作易产生气溶胶污染，导致假阳性结果出现。dna芯片方法通过pcr过程对扩增产物进行标记，若标记的产物与dna芯片上的探针发生杂交，即可证明有耐药基因的存在。dna芯片技术虽然在检测通量上有很大优势，但却需要pcr扩增、杂交、洗脱、检测荧光等一系列操作步骤，而且成本高，难以在临床实验室推广。由于上述种种原因，很多临床实验室很难准确及时的检出质粒介导的ampc酶。
技术实现要素：
针对上述问题，本发明提供了一种ampc基因的实时荧光定量pcr快速检测系统，具体涉及质粒ampc基因的检测。本发明可以有效弥补现有检测方法的不足。本发明提供了一种简便、准确的检测质粒ampc基因的快速检测系统。本发明的技术方案如下：
一种ampc基因的实时荧光定量pcr快速检测系统，其中，分子信标探针是一种含有“茎-环”结构，分子信标探针的核苷酸序列如seqno.1所示；
本发明的特异性引物为：
上游引物f：5’-atagtattggaatacgttatta-3’；
下游引物f：5’-tatgcactagaatatgagtc-3’。
本发明分子信标探针的茎部分是由于核酸分子的5′和3′末端的碱基配对而形成的，位于茎部分的5′端和3′端分别标记荧光基团和淬灭基团。环部分与构成茎的两条链相连，并与待检靶序列互补。未与靶序列杂交时，分子信标呈茎-环构象，荧光基团与淬灭基团彼此邻近，二者之间发生能量转移，使荧光基团发射出来的荧光被淬灭基团所吸收，所以观察不到荧光；当分子信标探针与靶序列杂交时，茎-环结构打开，荧光基团与淬灭基团分开，淬灭基团不再能有效地吸收由荧光基团发出的光。因此，分子信标探针与其靶核酸序列的结合即伴随着荧光发射的增加，并据此构成检测的基础。分子信标实时荧光pcr技术提高了探针与待检靶序列的杂交效率，具有特异性强、敏感性高、便捷等特点。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
利用实时pcr技术的多种优势，并将特异的分子信标探针引入到其中，探索建立一种简便、准确的检测质粒ampc基因的快速检测系统。与现有的基因检测方法相比，本方法可以对pcr反应的扩增动力学过程进行实时监控，整个过程为全封闭反应和检测，在2h内可由仪器自动完成，大大减少了模板污染和假阳性的可能；结果直观客观，避免人为判断，简便快速；通过使用96孔或384孔实时pcr仪可实现高通量检测。如果应用于临床可以大大减少误用的抗生素处方率，帮助医生选用针对性更强的抗生素，缩短疗程，减轻细菌耐药性产生和扩散的选择压力，延缓耐药菌株的出现。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
ampc基因如seqno.2所示。
实施例1本发明ampc基因的实时荧光定量pcr快速检测系统
本发明实时荧光定量pcr快速检测系统中的分子信标探针是一种含有“茎-环”结构，分子信标探针的核苷酸序列如seqno.1所示；
本发明的特异性引物为：
上游引物f：5’-atagtattggaatacgttatta-3’；
下游引物f：5’-tatgcactagaatatgagtc-3’。
试验例1
以大肠埃希菌(市售)为试验菌株，利用普通pcr和本发明检测系统进行检测，结果显示，普通pcr中的阳性率为3.5％，而本发明的阳性率为0。