本发明涉及分子检测领域，一种快速、方便、准确、有效的检测砧用南瓜‘伟砧1号’杂交种的分子鉴定方法，属于分子生物学领域。
背景技术：
种子纯度，是保证品种优良性状得以展现的关键因素，也是种子质量控制中最棘手的问题。传统的田间生态学杂交种检验方法易受环境条件和栽培措施的影响，鉴定周期长，成本高，鉴定结果准确性差。
随着分子辅助育种工具的快速发展，dna分子标记已从很多方面优于传统的鉴定方法，可以弥补传统鉴定方法中存在的许多缺陷和难题，是对种子杂交种进行快速、准确鉴定的发展方向和必然选择。目前，ssr分子标记技术是现阶段用于鉴定杂交种的常用方法。
ssr(simplesequencerepeat，ssr)即简单重复序列是普遍存在于真核生物基因组中的一种重复序列。ssr标记属于微卫星标记，有很多优点，包括多态性高、共显性、重复性好、数量丰富、对基因组覆盖范围广以及操作简单易检测，因而成为构建遗传连锁图谱、遗传多样性检测、进行分子标记辅助育种、系谱分析、品种指纹图谱绘制、品种纯度检测以及目标性状分子标记筛选的理想工具，已被广泛应用于基因定位及克隆、品种鉴定、农作物育种和进化研究等领域。
砧用南瓜‘伟砧1号’是以‘sf1’为母本，‘s26’为父本育成的南瓜一代杂交种。具有与黄瓜亲和力强，高抗枯萎病，嫁接黄瓜增加瓜条亮度的特点，已经在设施黄瓜生产中大面积应用。为了保证优良杂交品种的推广和产生最大的经济效益，筛选出可以对南瓜‘伟砧1号’杂交种进行准确鉴定的ssr引物，以解决‘伟砧1号’在制种过程中导致制种纯度不高的问题，为种子生产经营企业提供了一个准确、稳定、快速、实用的‘伟砧1号’杂交种鉴定的方法。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种用于检测‘伟砧1号’南瓜杂交种的引物序列。本发明目的还在于提供一种利用上述引物进行‘伟砧1号’南瓜杂交种的分子鉴定方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
(1)提取南瓜幼苗的基因组dna；
(2)以基因组dna为模板，从已获得的ssr引物中进行pcr扩增筛选出父本‘s26’与母本‘sf1’之间的特异性条带差异明显的引物ng22；
(3)以砧用南瓜杂交种‘伟砧1号’的基因组dna为模板，使用ssr引物ng22进行pcr扩增，对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；
(4)对电泳检测结果进行分析：若子代同时出现父本和母本的特异性条带，即为真正的杂交种；若子代只出现父本或母本的特异性条带，即为假杂交种；
附图说明
图：ssr标记ng22在亲本及子代中的扩增结果，m为pbr322dna/mspⅰ，1-6为‘伟砧1号’，7-8为父本，9-10为母本。
具体实施方式
为了能更加清楚的说明本发明的方法，下面对本发明的试验方法作以详细的说明，在此需加以说明的是：本发明所用到的试剂均有市售。
(一)供试南瓜材料
所用材料包括砧用南瓜杂交种‘伟砧1号’及其父本‘s26’和母本‘sf1’。
(二)供试南瓜基因组dna的提取
(1)叶片采集：将供试南瓜材料播种于培养钵中，待三叶一心时期，取植株顶部较为幼嫩的叶片，在-80℃下保存备用。
(2)取一片南瓜叶于1.5ml离心管中，在冰盒上充分研磨，加入600μl预热的2×ctab缓冲液，10μl的β-巯基乙醇，轻轻混匀，65℃水浴1h(每隔10min轻轻摇晃一次)。
(3)加等体积的氯仿，轻轻混匀，12000rpm离心10min，取上清于另一新的离心管中。
(4)同上。
(5)加入的等体预冷的积异丙醇，轻轻混匀，-20℃保存30min，12000rpm离心10min，弃上清。
(6)70％乙醇洗涤沉淀2-3次，置于超净工作台风干。
(7)加入50μl的ddh2o溶解。
(8)dna质量的检测：1％的琼脂糖凝胶电泳检测。
(三)ssr分子标记引物的筛选
从已获得的56个ssr引物中进行pcr扩增筛选出父本与母本之间的特异性条带差异明显的引物，即ng22。
pcr反应体系与程序
(1)pcr反应体系
(2)pcr反应程序
pcr反应程序：
94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃总延伸10min。于4℃冰箱保存。
pcr产物检测
(3)12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对pcr扩增结果进行检测：
凝胶组分(15ml)：
150v电泳3h，关闭电源，对胶体水洗两次，10％乙醇固定10min，水洗两次，1％硝酸敏化5min，水洗两次，0.2％硝酸银染色30min，水洗两次，2％氢氧化钠显色至出现清晰目的条带，水洗两次，10％乙酸停显2min，水洗两次，拍照保存。
如图所示，1-5：砧用南瓜‘伟砧1号’扩增出107bp和113bp两条带；6，7：父本‘s26’
扩增出113bp的条带；8，9：母本‘sf1’扩增出107bp的条带。回收特异条带，送上
海生物工程公司测序。杂交种中113bp条带的序列如seqidno:3所示，107bp条带
的序列如seqidno:4所示，与父本、母本扩增产物的序列相符。