用于痤疮的新TH17分化标志物及其用途的制作方法

本申请是申请日为2012年6月25日，名称为“用于痤疮的新th17分化标志物及其用途方法”的中国专利申请201280041848.8号的分案申请。

本发明涉及一种首次通过鉴定th17细胞参与炎症性过程来表征痤疮的新方法，并且本发明还涉及靶向thl7细胞在痤疮中的功能的治疗性应用。

更具体的，本发明提供了rorγt(也称为rar-相关孤儿受体c或视黄酸-相关孤儿受体(ror)γ]t或rorc变体2或rorγ2)或rorα(也称为rora或rar-相关孤儿受体a)的用途，以及其用于诊断痤疮和/或筛选thl7分化的抑制剂，特别是抑制rorγt或rorα中的用途以及所筛选的抑制剂在痤疮治疗中的用途。

痤疮是最常见的皮肤状况，影响着全球数百万人。患有严重痤疮的患者常常由于与该疾病相关的疤痕而面临严峻的心理和情绪问题。寻常痤疮(acnevulgaris)的发病机制复杂且不被人所完全理解。

炎症是痤疮发病机制的关键因素之一。对革兰氏阳性微生物痤疮丙酸杆菌(p.acnes)的免疫反应可能在炎症反应起始中发挥主要作用(deyounglm,youngjm,ballaronsj,spiresda,puhvelsm.intradermalinjectionofpropionibacteriumacnes:amodelofinflammationrelevanttoacne.jinvestdermatol.1984nov；83(5):394-8；jappeu,inghame,henwoodj,hollandkt.propionibacteriumacnesandinflammationinacne；p.acneshast-cellmitogenicactivity.brjdermatol.2002feb；146(2):202-9)。最近发表的研究报告也指出toll样受体2(tlr-2)参与炎症性痤疮(fathya,mohamedrw,ismaelna,el-akhrasma.expressionoftoll-likereceptor2onperipheralbloodmonocytesofpatientswithinflammatoryandnoninflammatoryacnevulgaris.egyptjimmunol.2009；16(1):127-34；nagyi,pivarcsia,korecka,szellm,urbane,kemenyl.distinctstrainsofpropionibacteriumacnesinduceselectivehumanbeta-defensin-2andinterleukin-8expressioninhumankeratinocytesthroughtoll-likereceptors.jinvestdermatol.2005may；124(5):931-8)。

最近的报告表明，作为皮肤先天免疫的一部分，皮肤在应对病原体增殖时表达多种抗菌肽(braffmh,bardana,nizetv,gallorl.cutaneousdefensemechanismsbyantimicrobialpeptides.jinvestdermatol.2005jul；125(1):9-13；schroderjm.epithelialantimicrobialpeptides:localinnatedefenseeffectormolecules].anndermatolvenereol.2004apr；131(4):411-6；selstedme,ouelletteaj.mammaliandefensinsintheantimicrobialimmuneresponse.natimmunol.2005jun；6(6):551-7)。这类抗微生物剂中的重要成员包括人β防御素家族成员和衍生自颗粒溶素的肽(dengetal,2005；harderetal,2004；mclnturffetal,2005)。人β防御素-1和2(hbd-1和hbd-2)表达于毛囊皮脂腺单元并且在痤疮病变中其表达上调(chronnelletal,2001)。最近的研究还发现，选择痤疮丙酸杆菌的菌株可以通过tlrs激活hbd-2，这进一步证实了这些肽在炎症性痤疮中的重要性(nagyi,pivarcsia,korecka,szellm,urbane,kemenyl.distinctstrainsofpropionibacteriumacnesinduceselectivehumanbeta-defensin-2andinterleukin-8expressioninhumankeratinocytesthroughtoll-likereceptors.jinvestdermatol.2005may；124(5):931-8)。

申请人基于实验证据首次提出了靶向th-17细胞分化这样一种新的炎症性过程来治疗和/或诊断痤疮。

因此，本发明涉及编码rorγt的dna或mrna以及相应蛋白作为痤疮标志物的用途；和编码rorα的dna或mrna以及相应蛋白作为痤疮标志物的用途。本发明还涉及至少一种本发明所提出的标志物和/或至少一种选自il-6、il-17a、il-17f、il-21、il-22、il-23a、il-26、ccl20的标志物作为痤疮标志物的用途。

本发明提供了一种用于诊断痤疮的方法，包括以下步骤：

a)检测取自个体的样品中的至少一种本发明所提出的标志物(rorγt或rorα)和/或至少一种选自il-17a、il-17f、il-22、ccl20的标志物的表达水平，

b)检测取自健康个体的样品中的至少一种本发明所提出的标志物和/或至少一种选自il-17a、il-17f、il-22、ccl20的标志物的表达水平，

c)比较至少一种标志物的表达水平的差异，并且对于个体中的表达水平显著高于健康个体中的表达水平的；

d)将步骤c)中至少一种标志物的过表达作为痤疮的指示物，由此诊断痤疮。

本发明还提供了用于诊断痤疮的方法，其还可以包括以下步骤：

a)检测取自个体的样品中的至少一种本发明所提出的标志物的表达水平，

b)检测取自健康个体的样品中的至少一种本发明所提出的标志物的表达水平，

c)比较至少一种标志物的表达水平的差异，并且对于个体中的表达水平显著高于健康个体中的表达水平的；

d)将步骤c)中至少一种标志物的过表达作为痤疮的指示物，由此诊断痤疮。

本发明提供了用于监测痤疮进展的方法，其包括以下步骤：

a)从个体取得生物样品，

b)分析所取得的样品中至少一种所提出的标志物和/或至少一种选自il-6、il-17a、il-17f、il-22、ccl20的标志物的表达水平，并且至少一种标记物的表达变化是痤疮进展的指示物。痤疮进展可以是从以粉刺为主到以更强炎性主导的状态，也可以是向具体的痤疮亚型发展，如结节囊肿性痤疮或聚合性痤疮(acneconglobata)。进展也可以以其它方向发生，从较严重形式的痤疮发展到较不严重形式的痤疮。

本发明还提供了用于监测旨在治疗痤疮的治疗的功效的方法，包括如下步骤：

a)对经鉴定具有一种或多种痤疮症状的个体施用所需的治疗，

b)从所述个体取得生物样品，

c)分析至少一种本发明所提出的标志物和/或至少一种选自il-17a、il-17f、il-22、ccl20的标志物的表达水平，其中至少一种标记物表达的变化是痤疮治疗的指示物。

本发明涉及用于治疗痤疮的th-17细胞分化抑制剂的体外筛选方法，包括测定所述候选物抑制或下调本发明所提出的标志物(rorγt或rorα)之一的表达或生物活性的能力。

更具体地，本发明涉及用于候选药物的thl7细胞分化抑制剂的体外筛选方法，包括如下步骤：

a)收集至少两种生物样品：一种模拟痤疮病变，一种模拟健康情况；

b)使至少一种样品或样品混合物与一种或多种待测候选药物相接触；

c)检测b)中获得的生物样品或混合物中至少一种所提出的标志物和/或至少一种选自il-17a、il-17f、il-22、ccl20的表达标志物的表达或生物功能；

d)选择能够抑制在b)中获得的所述样品或混合物中测定的至少一种所提出的标志物的表达或生物功能和/或至少一种选自il-17a、il-17f、il-22、ccl20的表达标志物的表达的候选药物，并与未混合候选药物的样品的水平相比较。

在另一个实施方式中，本发明提供了用于候选药物的thl7细胞抑制剂的体外筛选方法，包括如下步骤：

a)收集至少两种生物样品：一种模拟痤疮病变，一种模拟健康情况；

b)使至少一种样品或样品混合物与一种或多种待检测的候选药物相接触；

c)检测b)步骤中获得的生物样品或混合物中至少一种所提出的标志物的表达或生物功能；

d)选择能够抑制在b)步骤中获得的所述样品或混合物中测定的至少一种选自所提出的标志物的标志物的表达或生物功能的候选药物，并与未混合候选药物的样品水平相比较。

本发明还涉及通过如上所定义的筛选方法鉴定的抑制剂用于制备治疗痤疮和/或痤疮相关疾病的组合物中的用途。更具体地，本发明包括通过筛选方法鉴定的所提出的标志物的抑制剂用于制备治疗痤疮或痤疮相关疾病的组合物中的用途，例如n-(2,2,2-三氟乙基)-n-[4-[2,2,2-三氟-1-羟基-1-(三氟甲基)乙基]苯基]-苯磺酰胺(n-(2,2,2-trifluoroethyl)-n-[4-[2,2,2-trifluoro-1-hydroxy-1-(trifluoromethyl)ethyl]phenyl]-benzenesulfonamide)，2氧甾醇(氧化甾醇)，特别是24s-羟基胆固醇、24(s),25-环氧胆固醇和7-氧化甾醇，2-氰基-3,12-二氧代齐墩果-1,9(11)二烯-28-酸甲酯(methyl2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9(11)dien-28-oate)或甲基巴多索隆(bardoxolonemethyl)；-(8s,9r,10r,13r,14s,16r,17r)-17-[(e,2r)-2,6-二羟基-6-甲基-3-氧代庚-4-烯-2-基]-2,16-二羟基-4,4,9,13,14-五甲基-8,10,12,15,16,17-六氢-7h-环戊二烯并[a]菲-3,11-二酮(-(8s,9r,10r,13r,14s,16r,17r)-17-[(e,2r)-2,6-dihydroxy-6-methyl-3-oxohept-4-en-2-yl]-2,16-dihydroxy-4,4,9,13,14-pentamethyl-8,10,12,15,16,17-hexahydro-7h-cyclopenta[a]phenanthrene-3,11-dione)；5-(4-氯苯基)-6-乙基嘧啶-2,4-二胺；γ-d-谷氨酰基-l-色氨酸；8-羟基-3-甲基-3,4-二氢-2h-苯并[a]蒽-1,7,12-三酮(8-hydroxy-3-methyl-3,4-dihydro-2h-benzo[a]anthracene-1,7,12-trione)；5,7-二羟基-2-(4-羟基苯基)-4-氧代-4h-色烯-3-酚盐(5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4-oxo-4h-chromen-3-olate)；甲基-n-[4-(三氟甲基)苯基]-1,2-噁唑-4-甲酰胺或来氟米特(leflunomide)；n-[(e)-(3-甲基苯基)亚甲基氨基]-6-吗啉-4-基-2-(2-吡啶-2-基乙氧基)嘧啶-4-胺(n-[(e)-(3-methylphenyl)methylideneamino]-6-morpholin-4-yl-2-(2-pyridin-2-ylethoxy)pyrimidin-4-amine)。

发明详述

实际上，thl7细胞是最初来自于原初cd4+t细胞的分化的独特的th谱系，并且产生针对包括细菌和真菌在内的多种细胞外病原体的免疫。有趣的是，虽然痤疮丙酸杆菌是存在于健康人类皮肤上的共生细菌，但它已被认为是寻常痤疮的致病因子之一。但是，目前还不清楚痤疮丙酸杆菌是否确实是非炎症性和炎症性痤疮病变发展的真正诱因(shaheenb,gonzalezm.amicrobialaetiologyofacne-whatistheevidence？brjdermatol.2011apr18)。

thl7细胞还与各种炎症和自身免疫性疾病如银屑病、类风湿关节炎和多发性硬化症相关(pecka,mellinsed.precariousbalance:thl7cellsinhostdefense.infectimmun.2010jan；78(1):32-8)。

在分子水平上，thl7细胞的特征在于产生独特的效应细胞因子谱图，il-17a、il-17f、il-26、il-22、il-21和tnfα，并且其发育、存活和增殖依赖于il-23。这些细胞因子激活不同类型的细胞，如角质细胞，导致它们过度增殖并进一步产生促炎性细胞因子、趋化因子和抗微生物肽，这反过来在炎性皮肤中招募并激活其它免疫细胞，导致炎症反应扩大。此外，il-17a和il-17f形成il-17产物的自分泌调节，而il-17产物负责促进和维持thl7细胞分化(weietal.2007,jbiol.chem.,september20)。il17还负责ccl20的上调，ccl20是基质细胞中th17细胞的特征性受体的配体，可以吸引额外的thl7细胞到炎症组织中。

原初cd4t细胞分化成thl7细胞的信号转导途径需要tgfb-1与il-21、与il-1b和il-23或与il-1b、il-23和il-6组合，并导致类维生素a(retinoid)相关孤儿受体(rorc)和视黄酸相关孤儿受体α(rora)的表达，这是促进th17分化和实质上调il-17a和il-17f表达的2个转录因子(chungyetal.criticalregulationofearlythl7celldifferentiationbyinterleukin-1signaling.immunity2009；30:576-87,veldhoenm,hockingrj,atkinscj,locksleyrm,stockingerb.andimmunity2006feb；24(2):179-89)。

下文中，“th-17分化谱图分子”指的是表征thl7细胞分化的生物分子，即从原初t细胞到th-17细胞的分化所依赖的细胞因子和/或因子，换言之il-6、il-26、il-23和/或由th17细胞产生的细胞因子和/或因子(il-17a、il-17f、il-21、il-22、il-26、tnfα、ccl20)，和/或由th17细胞表达的受体(ccr6、il-23r)。

动物实验将mror-γt(人类rorγt的鼠直系同源物)列为th-17分化的主要调节物。鼠中rorγt的缺陷导致thl7活性的降低并且严重降低了il-17的表达(ivanovii,mckenziebs,zhoul,tadokoroce,lepelleya,lafaillejj,cuadj,littmandr.theorphannuclearreceptorrorγtdirectsthedifferentiationprogramofproinflammatoryil-17+thelpercells.cell.2006sep22；126(6):1121-33)。

本发明提供了rorγt或rorα，其为thl7细胞分化的重要物质，并且作为下列实例中用于表征痤疮的新型标志物。

在具体的实施方式中，本发明提供了编码rorγt的dna或mrna及其相应蛋白作为痤疮标志物的用途。

在具体的实施方式中，本发明提供了编码rorα的dna或mrna及其相应蛋白作为痤疮标志物的用途。

在另一个实施方式中，本发明提供了至少一种所提出的标志物和/或至少一种选自il-6、il-17a、il-17f、il-21、il-22、il-23a、il-26、tnfα或ccl20的标志物作为痤疮标志物的用途。

在另一个实施方式中，本发明提供了至少一种所提出的标志物和/或至少一种选自il-6、il-17a、il-17f、il-22、ccl20的标志物作为痤疮标志物的用途。

基于本发明的目的，术语“标志物”或“生物标志物”是指与特定病理状态存在或不存在相关的生物标志物。生物标志物是特定的蛋白、mrna或dna。

为了更加清楚，使用下列定义：术语“所提出的标志物”是指rorγt和/或rorα。“rorγt”是指rorc变体2的表达产物，即rorγmrna或蛋白或rorc基因本身。类似地，“rorα”是指rora基因的表达产物，即rorαmrna或蛋白或rora基因本身。

术语“表达水平”或“表达”是指由基因标志物编码的mrna或蛋白的水平。

表达水平的分析或检测可以通过本领域技术人员熟知的任何合适的方法进行，如蛋白质印迹、ihc、质谱(maldi-tof和lc/ms分析)、放射免疫测定(ria)、酶联免疫吸附或本领域技术人员熟知的任何其它方法或根据本领域技术人员熟知的常规方法对mrna进行分析。基于利用特定核苷酸探针的mrna杂交的技术是最常规的(northern印迹、rt-pcr(逆转录酶聚合酶链式反应)、定量rt-pcr(qrt-pcr)、rna酶保护)。

在一个实施方式中，本发明涉及诊断痤疮的方法，包括以下步骤：

a)检测取自个体的样品中的至少一种上述所提出的标志物，和/或至少一种选自il-6、il-17a、il-17f、il-22、ccl20的标志物的表达水平，

b)检测取自健康个体的样品中的至少一种上述标志物，和/或至少一种选自il-6、il-17a、il-17f、il-22、ccl20的标志物的表达水平，

c)比较至少一种标志物的表达水平的差异，并且对于个体的样品中的表达水平显著高于健康个体中的表达水平的；

d)将步骤c)中至少一种标志物的过表达作为痤疮的指示物，由此诊断痤疮。

诊断痤疮的方法，其还可以包括以下步骤：

a)检测取自个体的样品中的至少一种所提出的标志物的表达水平，

b)检测取自正常个体的样品中的至少一种所提出的标志物的表达水平，

c)比较至少一种标志物的表达水平的差异，并且对于个体样品中的表达水平显著高于健康个体中的表达水平的；

d)将步骤c)中至少一种标志物的过表达作为痤疮的指示物，由此诊断痤疮。

根据另一个方面，本发明涉及用于监测痤疮的进展或变化的方法，其包括以下步骤：

a)从个体取得生物样品，

b)分析所取得的样品的至少一种所提出的标志物和/或至少一种选自il-6、il-17a、il-17f、il-22、ccl20的标志物的表达水平，并且至少一种标记物的表达变化是痤疮进展的指示物。因此，本发明还涉及诊断痤疮进展或变化的方法。

根据另一个方面，本发明涉及监测旨在治疗痤疮的治疗的功效的方法，包括如下步骤：

a)对经鉴定具有一种或多种痤疮症状的个体施用所需的治疗，

b)从所述个体取得生物样品，

c)根据本领域技术人员熟知的任何合适的技术，分析取自b)的样品中的至少一种所提出的标志物和/或一种选自il6、il-17a、il-17f、il-22、ccl20的其它标志物的表达水平，其中至少一种标志物的表达变化是痤疮治疗的指示物。优选地，至少一种上述标志物的表达减少或接近已知的健康个体的表达水平。

表述“一种因子或标志物的过表达”是指表达水平增加了至少50％，优选至少100％，甚至更优选至少200％，或以相等的显著性差异表达，至少2倍，或至少为正常个体水平的两倍；这整体证明上述趋化因子、细胞因子和受体的过表达，从而代表了表征痤疮的标志物。

本发明中，生物样品对应于取自个体的任何类型的样品，可以是组织样品或液体样品如血液、淋巴或间质液。

根据一个具体的和优选的实施方式，所述样品是不同大小的(优选直径1至6mm)的活检，或通过剥离带(例如d-squames)的方式取得的皮肤样品，方法为以下：wongretal.,"analysisofrnarecoveryandgeneexpressionintheepidermisusingnon-invasivetapestripping"；jdermatolsci.2006nov；44(2):81-92；或bensonnr,etal.,"ananalysisofselectpathogenicmessagesinlesionalandnon-lesionalpsoriaticskinusingnon-invasivetapeharvesting".jinvestdermatol.2006oct；126(10):2234-41；或者其他wongretal.,"useofrt-pcranddnamicroarraystocharacterizernarecoveredbynon-invasivetapeharvestingofnormalandinflamedskin".jinvestdermatol.2004jul；123(1):159-67。根据剥离带的原理，所用产品包括柔性透光性聚合物支持物和粘合剂。所述产品可反复施用到病人的皮肤上，优选直到粘合性消失。获得的样品仅涉及表皮的最外层的内容。一种用于特别分析根据该取样方法所获得的蛋白含量的方法描述于专利申请wo2009/068825(galdermar&d)中，以监测特异于病理性皮肤状况的标志物并指导诊断。由于该方法快速、非侵入性且相对廉价的检测某些蛋白标志物的存在、不存在或变化，对其尤其优选。这种方法尤其表征为质谱检测、elisa或蛋白定量领域熟练技术人员所熟知的任何其它方法。在从柔性的粘性支持物上获得的皮肤样品中进行定量，目的是检测至少一种蛋白，该蛋白的存在、不存在或与标准值相比量或浓度的变化与具体病理性皮肤状况的存在、进展或不存在有关。

本发明的另一个实施方式是体外筛选thl7细胞分化候选抑制剂的方法，包括测定所述候选物抑制和/或下调本发明所提出的标志物(rorγt或rorα)中至少一种的表达或生物活性或包括反式激活性质的生物功能的能力。所鉴定的候选物将影响给定标志物的生物功能或由标志物调控的生物过程。例如，候选物对rorγt和/或rorα的抑制可能影响rorγt的生物功能，包括诱导thl7细胞的分化以及thl7细胞的功能。

基于筛选目的，生物样品由转染细胞组成，转染细胞含有在启动子控制下(完全或部分)操控的报告基因，启动子控制上述基因表达。或者，启动子可以是，至少部分的为合成组装的，并包含ror-响应元件。通过分析报告基因的表达，评估化合物调节所提出的标志物的功能的能力。

转染细胞可进一步改造成表达至少一种所提出的标志物。

报告基因可编码酶，其与相应的底物提供具有颜色的产物如cat(氯霉素乙酰转移酶)、gal(β-半乳糖苷酶)或gus(β-葡萄糖醛酸酶)。其可能是荧光素酶或gfp(绿色荧光蛋白)。

报道基因蛋白量或其活性通常通过比色、荧光或化学发光的方法进行评估。

根据本发明的另一个实施方式，生物样品是表达了目的基因的细胞，并且上述步骤c)提供了基因产物活性的测量。

在另一个实施方式中，本发明涉及利用所述筛选方法鉴定到的抑制剂/拮抗剂/反激动剂用于制备治疗痤疮和/或痤疮相关疾病的组合物中的用途。

特别是，γt或rorα的抑制剂/拮抗剂/反激动剂可以从以下列表中选择：

-n-(2,2,2-三氟乙基)-n-[4-[2,2,2-三氟-1-羟基-1-(三氟甲基)乙基]苯基]苯磺酰胺；该化合物是一种新的视黄酸受体相关孤儿受体-α/γ反激动剂。(molpharmacol.2010feb；77(2):228-36))

-2氧甾醇(氧化甾醇)，特别是24s-羟基胆固醇、24(s),25-环氧胆固醇和7-氧化甾醇[asecondclassofnuclearreceptorsforoxysterols:regulationofrorαandrorγactivityby24s-hydroxycholesterol(cerebrosterol)-wangyetal.biochimbiophysacta.2010aug；1801(8):917-23.epub2010mar6]；wangyetal.modulationofretinoicacidreceptor-relatedorphanreceptorαandγactivityby7-oxygenatedsterolligands.jbiolchem.2010feb12；285(7):5013-25))。

-2-氰基-3,12-二氧代齐墩果-1,9(11)二烯-28-酸甲酯或甲基巴多索隆(也被称为“rta402”和“cddo-甲基酯)。

-(8s,9r,10r,13r,14s,16r,17r)-17-[(e,2r)-2,6-二羟基-6-甲基-3-氧代庚-4-烯-2-基]-2,16-二羟基-4,4,9,13,14-五甲基-8,10,12,15,16,17-六氢-7h-环戊二烯并[a]菲-3,11-二酮或si-124(blaskovichma,sunj,cantoraetal.discoveryofjs-124(cucurbitacini),aselectivejanuskinase/signaltransducerandactivatoroftranscription2signalingpathwayinhibitorwithpotentantitumoractivityagainsthumanandmurinecancercellsinmicecancerres2003；63:1270-1279)。

-乙胺嘧啶：-5-(4-氯苯基)-6-乙基嘧啶-2,4-二胺或乙胺嘧啶(dariprim)(wo/2008/156644)

-γ-d-谷氨酰基-l-色氨酸或scv-07(sciclonepharmaceuticals)(nagabhushanamv,subbaraok,ramachandranmetalinhibitionofstat3drivengeneexpressioninmelanomacellsbyscv-07jclinoncol2008；26(may20,suppl):14619)。

8-羟基-3-甲基-3,4-二氢-2h-苯并[a]蒽-1,7,12-三酮或sta-21(songh,wangr,wangsetal.alow-molecular-weightcompounddiscoveredthroughvirtualdatabasescreeninginhibitsstat3functioninbreastcancercellspnas2005；102:4700-4705)。

-天然黄酮醇：如5,7-二羟基-2-(4-羟基苯基)-4-氧代-4h-色烯-3-酚盐或山奈酚(kaempferol)(brunord,njarvc.targetingcytochromep450enzymes:anewapproachinanticancerdrugdevelopment.bioorgmedchem.2007aug1；15(15):5047-60.epub2007may23)。

-甲基-n-[4-(三氟甲基)苯基]-1,2-噁唑-4-甲酰胺或来氟米特(o'donnellef,sailiks,kochdc,kopparapupr,farrerd,bissonwh,mathewlk,senguptas,kerkvlietni,tanguayrl,kollurisk.theanti-inflammatorydrugleflunomideisanagonistofthearylhydrocarbonreceptor.plosone.2010oct1；5(10)。

n-[(e)-(3-甲基苯基)亚甲基氨基]-6-吗啉-4-基-2-(2-吡啶-2-基乙氧基)嘧啶-4-胺或sta5326(apilimodsyntapharmaceuticals)wadaetal:selectiveabrogationofthlresponsebysta-5326,apotentil-12/il-23inhibitor.blood,2007,109(3),1156-1164.；wadaetal:il-12/il-23inhibitors:apromisingapproachtothetreatmentofinflammatorydisorders.drugsfut.2008,33(1),49-63。

-[(3s,5r,8r,9s,10s,12r,13s,14s)-3-[(2s,4s,5r,6r)-5-[(2s,4s,5r,6r)-5-[(2s,4s,5r,6r)-4,5-二羟基-6-甲基-环氧乙基-2-基]氧基-4-羟基-6-甲基-环氧乙基-2-基]氧基-4-羟基-6-甲基-环氧乙基-2-基]氧基-12,14-二羟基-10,13-二甲基-1,2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,15,16,17-四-十氢环戊烷并[a]菲-17-基]-5h-呋喃-2-酮(-[(3s,5r,8r,9s,10s,12r,13s,14s)-3-[(2s,4s,5r,6r)-5-[(2s,4s,5r,6r)-5-[(2s,4s,5r,6r)-4,5-dihydroxy-6-methyl-oxan-2-yl]oxy-4-hydroxy-6-methyl-oxan-2-yl]oxy-4-hydroxy-6-methyl-oxan-2-yl]oxy-12,14-dihydroxy-10,13-dimethyl-l,2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,15,16,17-tetradecahydrocyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-5h-furan-2-one)或地高辛和其衍生物。

在另一个方面，抑制剂可能是多肽、dna或反义rna、si-rna或pna(“肽核酸”，即多肽链被嘌呤和嘧啶碱基取代并具有用于与后者杂交的dna样结构)。

调节物可以是抗体，并且优选单克隆抗体。有利的是，给患者施用足够量的单克隆抗体，使测量血浆浓度为约0.01μg/ml至约100μg/ml，优选约1μg/ml至约5μg/ml。

本发明的目的是用于治疗痤疮。痤疮可以理解为，所有的痤疮形式，特别是简单痤疮(simpleacne)、面疱性痤疮(comedonicacne)、丘疹脓疱痤疮(papulopustularacne)、丘疫粉刺痤疮(papulocomedonicacne)、结节囊性痤疮(nodulocysticacne)、聚合性痤疮(acneconglobata)、颈背的瘢痕瘤性痤疮(cheloidacneofthenapeoftheneck)、反复发作的粟粒状痤疮(recurrentmiliaryacne)、坏死性痤疮(necroticacne)、新生儿痤疮(neonatalacne)、职业性痤疮(occupationalacne)、玫瑰痤疮(acnerosacea)、老年性痤疮(senileacne)、日光痤疮(solaracne)和药物相关的痤疮(medication-relatedacne)以及更多的痤疮有关病症(如皮脂分泌过多)。

以下实施例说明本发明但不限制本发明的范围。

表1：通过affymetrix技术测定的mrna表达。

分析thl7分化谱图分子il-17a、il-17f、il-26、il-6和所提出的标志物rora和rorc，以及il-5、il-4、il-13(通常被认为是th2细胞因子)。

表2：通过qrt-pcr(taqman低密度阵列技术)测定mrna的表达。分析thl7分化谱图分子il-6、il-17、il-22、il-23、ccl20、il-6和rorc，所提出的标志物之一，以及il-5、il-4和il-13(通常被认为是th2细胞因子)的表达。

表3：thl7分化谱图分子的蛋白表达(luminex分析)。分析il-6、il-17a、il-17f、il-21、il-22、il-23a、ccl20和tnfα，以及il-5、il-4和il-13(通常被认为是th2细胞因子)。

图1：痤疮病变：t淋巴细胞免疫组化检测(单独cd3)

图2：痤疮病变：t淋巴细胞中的il-17表达(cd3/il17共定位)。

实施例1：与患有痤疮的患者的非损伤皮肤比较，所述患者的损伤皮肤中的th17分子谱图的调节：分析il-6、il-17a、il-17f、il-21、il-22、il-23a、il-26、tnfα、ccl20和所提出的标志物rora和rorc的表达。

病人的选择和组织活检：

根据良好的临床实践，从12例痤疮患者的炎症性丘疹和非损伤皮肤取得痤疮患者的皮肤活检。(根据wilkinetal.,2002,j.am.acad.dermatol.vol46,pages584-587的分类进行痤疮亚型的临床描述)。

为了评估基因在表达水平上的变化，对相同受试者(n＝12)的损伤皮肤中的表达水平与非损伤皮肤中的表达水平相比较。

mrna提取、标记和杂交至探针阵列：

用rneasy提取试剂盒(quigeninc.,valencia,ca)从皮肤中分离mrna，并用agilent的2100生物分析仪对质量进行评估。利用t7-寡核苷酸引物和affymetrix的一个循环cdna合成试剂盒产生双链cdna(即体外转录过程)之后，通过基因芯片ivt标记试剂盒对mrna的表达进行评估。rna用乙醇沉淀来浓缩样品，然后用分光光度计定量。利用t7-oligo(dt)引物(一个循环cdna合成试剂盒，affymetrix)从每个样品中的约200ng的高质量总rna[rna指示数(rin)≥7]产生双链cdna。将通过体外转录(基因芯片ivt标记试剂盒，affymetrix)产生的生物素化的crna片段化并杂交到affymetrix人u133a2.0+微点阵上。点阵在基因芯片射流站450(genechipfluidicsstation450)上进行处理并在affymetrix基因芯片扫描仪(santaclara,ca)上进行扫描。

基于affymetrix基因芯片的mrna表达统计学分析：

将来自affymetrix基因芯片的表达数据用rma(强大的多阵列分析)方法进行归一化。原始强度值经背景校正、log2转化以及分位数归一化。接着将线性模型拟合至归一化的数据，以获得针对每个阵列上的每个探针组的表达测量。为了鉴定在不同痤疮亚型样品中受显著调节的基因，用jmp7.0.1(sasinstitute)和irmf3.5(nationalinstituteofstatisticalsciences，niss)软件进行带有benjamini-hochberg多重校正的单因素方差分析。

qrt-pcr检测mrna的表达：

通过qrt-pcr检测thl7谱图的表达。

下列表格中，通过痤疮患者的非损伤皮肤中和损伤皮肤中单独基因的平均ct(循环阈值)记录表达水平。ct值与给定基因的mrna的量成反比。

细胞因子的提取和分析：

从12例痤疮患者的炎症性丘疹和非损伤皮肤中提取蛋白。通过luminex分析(millipore&procarta细胞因子剂量试剂盒)量化蛋白提取物中的细胞因子。细胞因子的量相对蛋白总浓度归一化。对每种细胞因子计算成对p值。

利用affymetrix技术(表1)和qrt-pcr(表2)测量thl7谱图分子il-17a、il-17f、il-26、ccl20和所提出的标志物rora和rorc的mrna表达。

通过affymetrix(表1)或qrt-pcr(表2)技术测量的表征thl7细胞分化的特异性细胞因子il-17a、il-17f、il-22、il-26的mrna在损伤皮肤中显著上调。而且，在这些表中，il5、il4和il13的mrna表达未被检测到或未发生改变，这表明痤疮的炎症反应不是由th2细胞驱动的。

表3证明，与非损伤皮肤相比较，损伤皮肤中il-6、il-17a、il-17f、il-21、il-22和tnfα的蛋白表达水平上调。

因此，th-17细胞分化过程中显示的细胞因子的这些表达差异证明了抑制或靶向thl7细胞分化用于治疗或诊断痤疮的意义。

意外的是，转录因子rora和rorc的mrna水平在痤疮中略有下降，但其在人皮肤中的表达得到明确证实。因此，它们作为标志物用于诊断痤疮和/或筛选thl7细胞分化的抑制剂是有意义的。出于诊断目的，可以将其单独或与至少一种前述的thl7细胞分化谱图分子组合使用。

实施例2：免疫组化分析：

在正常皮肤中，我们几乎观察不到任何淋巴细胞浸润，然而在损伤区域的活检中发现大量的浸润。在这种情况下，利用免疫组化技术在这些损伤区域的浸润中进行il17检测。

为了检测t淋巴细胞，使用第一抗体(抗cd3)，再使用第二抗体(特异于il-17)。

这些抗体分别与结合有红色荧光基团(tritc)或绿色荧光基团(fitc)的二级抗体反应。

图1所示的是cd3表达的结果。阳性细胞(黑色)证实浸润主要由t淋巴细胞组成。

图2证明，cd3阳性t淋巴细胞的亚群共表达il-17。这种阳性il-17染色表明了痤疮病变中存在thl7细胞。

表2

表3