一种基于稀土纳米材料荧光放大的microRNA检测方法与流程

本发明涉及纳米荧光检测技术领域，更具体地说是一种基于水溶性稀土荧光标记材料的荧光放大，以实现对microrna的超灵敏检测方法。

背景技术：

microrna(mirna)是一种长度约为22个核苷酸的非编码的单链小分子rna，具有高度保守性，它们广泛存在于病毒、植物和高等哺乳动物的细胞中。研究表明，mirna在动植物的发育、细胞生长分化和凋亡、脂肪代谢等生命活动过程中发挥重要调控作用。人类疾病特别是肿瘤疾病常伴随多种mirna表达量的变化，mirna作为一种新兴的疾病标志物在肿瘤疾病的诊断、治疗、预后判断具有重要意义。现如今许多常规的核酸检测技术如：rna印迹法、微阵列芯片、实时定量pcr等被应用于mirna的检测。但是由于mirna本身具有生物体内含量低、家族序列同源性强、核酸链短的特征，使得这些方法往往存在检测灵敏度不高、重现性不好、检测特异性不强及辅助探针设计复杂等问题。针对于mirna本身的这些特征，许多新型的基于酶放大(rollingcircleamplification滚环放大，exponentialamplificationreaction指数放大反应等)或者基于杂交链式反应的放大技术，被提出并应用于mirna的检测。但是这些技术手段往往需要工具酶的参与以及复杂的信号放大设计，这就要求了特殊的反应条件和多步、耗时、复杂难懂的实验步骤，这些要求限制了其在复杂体系中mirna超灵敏检测方面的推广和应用。因此发展一种既能特异性识别，又能利用简便的信号放大技术实现低浓度mirna的检测方法具有重要意义。

技术实现要素：

针对上述现有技术中存在的不足，本发明的目的是提出一种基于稀土纳米材料荧光放大的mirna超灵敏检测的方法，所述方法是通过简单、方便的信号放大策略，利用了具有分子信标结构的捕获探针实现对目标物(待测mirna样品)的特异性识别，再结合稀土纳米材料荧光放大技术实现信号放大。所建立的方法具有很高的灵敏度，而且可用于复杂体系中mirna的直接检测。

本发明提供如下的技术方案：

一种基于稀土纳米材料荧光放大的mirna检测方法，所述方法包括以下步骤：

(1)提供捕获探针，所述捕获探针为分子信标结构，序列结构为：5’-自由链段1-茎部1-环部-茎部2-自由链段2-3’，所述环部为能特异性识别目标mirna的序列，所述茎部1和茎部2互补形成茎杆结构，所述自由链段1和自由链段2均不与环部、茎部1和茎部2互补；

(2)加入含有待测mirna的样品；

(3)加入生物素标记的检测探针，所述检测探针与捕获探针的茎部2和自由链段2互补；

(4)加入稀土纳米材料标记的亲和素；或者，先加入亲和素，之后再加入稀土纳米材料标记的生物素；

(5)加入增强液；

(6)采用时间分辨检测荧光信号。

根据本发明，所述步骤(1)中的捕获探针可以共价偶联的方式固定于固相载体上提供，也可以分散于液体中的自由形式提供。为后续仪器检测方便，优选捕获探针以共价偶联的方式固定于固相载体上。

将捕获探针共价偶联到固相载体上的方法，可采用本领域中已知的各种方法，包括但不限于，通过在捕获探针5’端连接上化学反应性基团，例如氨基、羧基、酰胺基等，经由这些基团将捕获探针共价偶联到固相载体上。在本发明的一个具体实施方式中，所述捕获探针为5’端氨基标记的分子信标结构，通过5’端氨基将其共价偶联到固相载体上。在本发明的一个具体实施方式中，采用ph9.6的碳酸缓冲溶液作为包被液，将5’端氨基标记的捕获探针固定于固相载体上。

如果采用将捕获探针共价偶联到固相载体的方式提供捕获探针，那么，在将捕获探针包被到固相载体上之后，优选进一步用封闭液封闭掉捕获探针上未反应的化学基团，降低后续检测中可能出现的假阳性。在本发明的一个具体实施方式中，所用的封闭液为乙醇胺溶液，例如为用0.05mol/l的碳酸盐缓冲液配制的0.1％乙醇胺溶液。

所述固相载体可以是检测领域中常用和已知的各种固相载体，包括但不限于微孔板、磁性微球、金箔、高分子微球等。在本发明的一个具体实施方式中，所述固相载体为微孔板，例如常用的96孔板。

根据本发明，在捕获探针的5’端设计自由链段1序列，可以使茎部和固相载体有一段距离，减小位阻效应，降低将捕获探针结合到固相载体上的结合难度。在本发明的一个具体实施方式中，所述自由链段1序列为aagctgacctct。

根据本发明，在捕获探针的3’端设计自由链段2序列，是为了在茎部2序列之外，再提供一段可与检测探针互补的序列，提高检测探针与捕获探针结合的特异性和稳定性；同时控制自由链段2序列的长度，防止检测探针在捕获探针茎环结构还未打开时，就结合到捕获探针上，导致检测假阳性的出现。在本发明的一个具体实施方式中，所述捕获探针中的自由链段2序列为ttttttt。

根据本发明，茎部1和茎部2序列中要控制适当的cg含量，以免过高的cg含量使茎环结构过于稳定，目标mirna无法将捕获探针的茎环打开，造成假阴性；也要避免过低的cg含量使茎环结构过于松散，造成假阳性。在本发明的一个具体实施方式中，所述捕获探针中的茎部1序列为tggaca，茎部2序列为tgtcca。

根据本发明，优选上述检测方法用于检测mirna-21，在这种情况下，所述捕捉探针中的环部序列为：tcaacatcagtctgataagcta，该序列能特异性识别mirna-21。

根据本发明，检测探针的序列要能与捕获探针上的茎部2序列和自由链段2序列互补，这样能提高检测探针与捕获探针结合的特异性和稳定性，降低检测的假阳性和假阴性。在本发明的一个具体实施方式中，所述检测探针的序列为：aaaaaaatggaca。

根据本发明，优选所述步骤(4)中的稀土纳米材料为xyf4纳米晶，所述x选自锂、钠、钾等中的一种或多种，所述y选自铕、钐、铽、镝中的一种或多种。在本发明的一个具体实施方式中，所述稀土纳米材料为naeuf4纳米晶。

稀土纳米材料标记生物素或亲和素的方法可以采用本领域已知的各种方法，包括但不限于脂质体包覆法，化学配位法。

所述脂质体包覆法为本领域技术人员已知的方法。在本发明的一个具体实施方式中，以naeuf4纳米晶脂质体包覆法标记生物素，包括如下步骤：

1)称取油溶性naeuf4纳米晶和生物素标记的磷脂质溶于氯仿溶液中，超声后进行旋转蒸发去除溶剂；

2)加入超纯水进行超声，经过半小时的反应，离心收集，最后溶于超纯水即可。

所述化学配位法也为本领域技术人员已知的方法。在本发明的一个具体实施方式中，以naeuf4纳米晶化学配位法标记生物素，包括如下步骤：

1)称取油溶性naeuf4纳米晶溶于盐酸乙醇溶液中，超声，离心收集纳米颗粒，再用无水乙醇洗涤，除去纳米晶表面的油酸，加入去离子水溶解，得水溶性纳米晶；

2)取步骤1)合成的水溶性纳米晶，加入生物素和氨水，超声，用去离子水离心洗涤，最后溶于去离子水中即可。

根据本发明，优选所述步骤(5)中的增强液含有tritonx-100、萘甲酸三氟丙酮、三正辛基氧膦和水。在本发明的一个具体实施方式中，所述增强液的组成为：每升增强液中含有1gtritonx-100，26.6mg萘甲酰三氟丙酮，193mg三正辛基氧膦，ph2.3。

根据本发明，上述步骤(6)中的时间分辨检测荧光信号中，所述信号放大的原理是，当含有稀土纳米材料标记的亲和素或生物素，与体系中已经存在的生物素或亲和素，形成亲和素-生物素、或者生物素-亲和素-生物素复合物后，加入增强液，使稀土纳米材料溶解成稀土离子，并与增强液中的配体形成螯合物，生成新的信号分子，产生分子内和分子间能量传递，使得荧光信号的强度增强近百万倍，从而被检测到。

根据本发明，由于mirna存在于病毒、植物和高等哺乳动物的细胞中，在动植物的发育、细胞生长分化和凋亡、脂肪代谢等生命活动过程中发挥重要调控作用。因此本发明检测mirna的方法，可用于各种用途的mirna检测，包括非诊断目的和诊断目的的mirna检测。

在本发明中，如无特殊说明，所述核酸序列均为5’端到3’端的顺序表示。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种基于稀土纳米材料荧光放大的mirna超灵敏检测方法和应用，所述检测方法具有如下优点：1)采用分子信标结构的捕获探针可以有效地进行特异性识别，对于目标mirna的单碱基错配也具有良好的识别能力；2)不需要各种工具酶以及多步、复杂难懂的放大步骤；采用稀土纳米材料作为标记物标记生物分子，无需提前做任何处理，在实验最后加入增强液便可使荧光增强近百万倍，极大地提高了检测灵敏度且操作十分简便；3)由于所述稀土纳米材料的性质稳定、比表面积大、可修饰性强、成本低廉且每个纳米颗粒含有数千个稀土离子，极大提高了稀土离子的标记比率，受外源稀土离子的影响小，且不受抗凝剂的影响，适用性更广。

附图说明

图1为本发明一个优选实施方式中所述的mirna的检测原理图。

图2为实施例1制备得到的naeuf4纳米晶的透射电镜图。

图3为实施例1制备得到的mirna-21的浓度与荧光强度的标准曲线。

图4为实施例2所述的识别mirna-21靶标的选择性的考察结果。

图5为实施例3所述的对于复杂体系样品中mirna-21回收率的考察结果。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。但本领域技术人员了解，本发明的保护范围不仅限于以下实施例。根据本发明公开的内容，本领域技术人员将认识到在不脱离本发明技术方案所给出的技术特征和范围的情况下，对以上所述实施例做出许多变化和修改都属于本发明的保护范围。

以下实施例中，检测所述的透射电镜图的仪器型号为jem-2010，厂家为jeol。

以下实施例中，检测所述荧光信号分子的仪器为荧光酶标仪，型号为synergy4，厂家为biotek。

以下实施例中，pbst洗涤缓冲液的组成为10mm的磷酸盐缓冲液、150mm的氯化钠和0.05％(v/v)的吐温20。

以下实施例中，pbs缓冲液的组成为：每升缓冲液中含有kcl0.2g，kh2po40.2g，nacl8g，na2hpo4·12h2o3.14g，ph7.4-7.6。

实施例1

对mirna-21检测灵敏度的考察

1.naeuf4纳米晶脂质体包覆法标记生物素的制备方法：

1)称取naeuf4纳米晶10mg和生物素标记的磷脂质20mg溶于5ml氯仿溶剂中，超声混匀后进行旋转蒸发去除溶剂；

2)取步骤1)干燥产物加入4ml超纯水进行超声，经过半小时的反应，离心收集，最后溶于0.5ml超纯水中即可。

图2给出了本实施例制备得到的naeuf4纳米晶的透射电镜图。

由图可知，所制得的纳米晶尺寸分布均一(粒径为13.5±1nm)，且结晶性良好。

2.配制增强液

称取1gtritonx-100，26.6mg萘甲酰三氟丙酮，193mg三正辛基氧膦，加入蒸馏水定容至1l，用稀hcl调节ph2.3，备用。

3.实验所需的探针序列

4.考察naeuf4纳米晶荧光放大体系测定mirna-21标准溶液的灵敏度，包括如下步骤：

1)包被：用0.05mol/l的碳酸盐缓冲液将捕获探针cp稀释至100nm，在96孔聚苯乙烯板中，每孔加入100μl，37℃孵育1h，弃去孔内液体，用pbst洗涤缓冲液洗3次。

2)封闭：用0.05mol/l的碳酸盐缓冲液配制0.1％的乙醇胺，每孔加入300μl，37℃孵育1h，去孔内液体，用pbst洗涤缓冲液洗3次。

3)加样：用pbs缓冲液配制含有20u核糖核酸酶抑制剂的10fm-100nmmirna-21标准溶液，使其浓度分别为：0fm，10fm，100fm，1pm，10pm，100pm，1nm，10nm，100nm的标准品，每孔加入100μl的标准溶液，37℃孵育1小时，弃去孔内液体，用pbst洗涤缓冲液洗3次。

4)加入检测探针dp：用pbs缓冲液配制10nm的dp溶液，每孔加入100μl，37℃孵育0.5h，弃去孔内液体，用pbst洗涤缓冲液洗3次。

5)加入亲和素：用pbs缓冲液配制5μg/ml的亲和素溶液，每孔加入100μl，37℃孵育0.5h，弃去孔内液体，用pbst洗涤缓冲液洗3次。

6)加入naeuf4纳米晶标记的生物素：用pbs缓冲液配制10μg/ml的naeuf4纳米晶标记的生物素，每孔加入100μl，37℃孵育0.5h，弃去孔内液体，用pbst洗涤缓冲液洗6次。

7)加增强液：每孔加入200μl增强液，采用时间分辨检测荧光信号，具体参数为：激发波长340nm，发射波长617nm，延迟时间100μs。

8)绘制标准曲线：以mirna-21标准溶液浓度为横坐标，以每一浓度标准溶液的对应的荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线。

图3给出了本实施例mirna-21的浓度与荧光强度的标准曲线。

由图可知，在10fm-100pm范围内，mirna-21的浓度与荧光强度成线性相关，以空白平均值加3倍sd计，最低检测限为1.38fm。

实施例2

对识别mirna-21靶标的选择性的考察

1.实验所需试剂和仪器与实施例1相同，实验所需naeuf4纳米晶标记的生物素与实施例1一致。

2.实验所需的探针序列(所述碱基右上角标注有*的，代表为错配碱基)

3.考察naeuf4纳米晶荧光放大体系测定mirna-21及错配序列的选择性，包括如下步骤：

1)包被：用0.05mol/l的碳酸盐缓冲液将捕获探针cp稀释至100nm，在96孔聚苯乙烯板中，每孔加入100μl，37℃孵育1h，弃去孔内液体，用pbst洗涤缓冲液洗3次。

2)封闭：用0.05mol/l的碳酸盐缓冲液配制0.1％的乙醇胺，每孔加入300μl，37℃孵育1h，去孔内液体，用pbst洗涤缓冲液洗3次。

3)加样：用pbs缓冲液配制含有20u核糖核酸酶抑制剂的1nm的pm、sm、tm、random标准溶液，每孔加入100μl的标准溶液，37℃孵育1h，弃去孔内液体，用pbst洗涤缓冲液洗3次。

4)加入检测探针dp：用pbs缓冲液配制10nm的dp溶液，每孔加入100μl，37℃孵育0.5h，弃去孔内液体，用pbst洗涤缓冲液洗3次。

5)加入亲和素：用pbs缓冲液配制5μg/ml的亲和素溶液，每孔加入100μl，37℃孵育0.5h，弃去孔内液体，用pbst洗涤缓冲液洗3次。

6)加入naeuf4纳米晶标记的生物素：用pbs缓冲液配制10μg/ml的naeuf4纳米晶标记的生物素，每孔加入100μl，37℃孵育0.5h，弃去孔内液体，用pbst洗涤缓冲液洗6次。

7)加增强液：每孔加入200μl增强液，采用时间分辨检测荧光信号，具体参数为：激发波长340nm，发射波长617nm，延迟时间100μs。

8)绘制荧光比率(f-f0)/f0柱状图，其是以每种靶标的名称为横坐标，以每种靶标所得的荧光比率为纵坐标，其中，f是靶标荧光测定值，f0是背景荧光值，荧光比率(f-f0)/f0用来反应不同靶标荧光值和背景值的变化，绘制柱状图。

图4给出了本实施例所述的识别mirna-21靶标的选择性的考察结果。

由图4可知，单碱基错配(sm)和三碱基错配(tm)与mirna-21(pm)的荧光比率相比，二者的荧光比率分别下降到48％和20％，而随机序列(random)的荧光比率接近于零，说明随机序列(random)无法有效地将捕获探针打开；上述结果也证明了本实施例所述的检测体系具有良好的选择性。

实施例3

本实施例所述的方法对于复杂体系样品中mirna-21回收率的考察

1.实验所需序列和仪器与实施例1相同，实验所需naeuf4纳米晶标记的生物素与实施例1一致。

2.复杂体系实验所使用的模型基质为10％胎牛血清。

3.实验所使用的标准工作曲线和实施例1实验方法一致。

4.考察naeuf4纳米晶荧光放大体系测定复杂体系样本中mirna-21的回收率，包括如下步骤：

1)包被：用0.05mol/l的碳酸盐缓冲液将捕获探针cp稀释至100nm，在96孔聚苯乙烯板中，每孔加入100μl，37℃孵育1h，弃去孔内液体，用pbst洗涤缓冲液洗3次。

2)封闭：用0.05mol/l的碳酸盐缓冲液配制0.1％的乙醇胺，每孔加入300μl，37℃孵育1h，去孔内液体，用pbst洗涤缓冲液洗3次。

3)加样：用10％胎牛血清缓冲液配制浓度由低到高，含有20u核糖核酸酶抑制剂的100fm，1pm，10pm的mirna-21模拟血清溶液，每孔加入100μl的模拟血清溶液，37℃孵育1小时，弃去孔内液体，用pbst洗涤缓冲液洗3次。

4)加入检测探针dp：用pbs缓冲液配制10nm的dp溶液，每孔加入100μl，37℃孵育0.5h，弃去孔内液体，用pbst洗涤缓冲液洗3次。

5)加入亲和素：用pbs缓冲液配制5μg/ml的亲和素溶液，每孔加入100μl，37℃孵育0.5h，弃去孔内液体，用pbst洗涤缓冲液洗3次。

6)加入naeuf4纳米晶标记的生物素：用pbs缓冲液配制10μg/ml的naeuf4纳米晶标记的生物素，每孔加入100μl，37℃孵育0.5h，弃去孔内液体，用pbst洗涤缓冲液洗6次。

7)加增强液：每孔加入200μl增强液，采用时间分辨检测荧光信号，具体参数为：激发波长340nm，发射波长617nm，延迟时间100μs。

8)测定回收率：以实施例1所得的工作曲线为标准曲线，计算血清实验所对应的回收率。

所述计算方法为：将已知浓度为c0的血清样品的测定荧光值带入标准曲线拟合公式求出测量浓度c，将浓度c代入公式c/c0×100％，即得到回收率。

图5给出了实施例3所述的对于复杂体系样品中mirna-21回收率的考察结果。

经计算可知，所述回收率在90.2-108％之间，变异系数小于10.1％，结果表明，本实施例检测体系可以有效地屏蔽复杂体系的背景干扰，检测方法具有良好的精密度和重现性。