一种利用污泥蛋白为酶解助剂促进木质纤维素酶解糖化的方法与流程

本发明属于木质纤维素酶解领域，涉及一种利用污泥蛋白为酶解助剂促进木质纤维素酶解糖化的方法。

背景技术：

木质纤维素是廉价且丰富的可再生资源。随着能源危机的不断严峻及人们对环境问题的日益重视，高效开发木质纤维素生物质资源已受到国内外学者的广泛重视。木质纤维素水解糖化是其资源利用过程中的关键环节。在众多水解方法中，酶解具有彻底、条件温和、副产物少、环保、糖损耗低等特点备受青睐。但由于木质纤维素的结构与组成复杂，纤维素酶寿命短、稳定性差、活性低等缺陷，致使木质纤维素酶解糖化效率低、成本高。为此世界各国学者开展了大量研究致力于解决上述问题。例如利用PEG4000(0.5％～2％w/v)强化玉米芯酶解，纤维素的转化率随着PEG4000比例的增加而增大，Li J.H.,Colloids and Surfaces B:Biointerfaces,2012,89,1；吴泽等通过设计一种卧式平推流酶解反应器，在低能耗、高传质的环境下实现酶解工艺的连续化，吴泽，纤维素科学与技术，2013，21，2；Zhang通过白腐菌联合碱预处理协同强化杨木的酶解糖化作用，效果显著，Zhang Liming,et al.,Industrial Crops and Products,2016,86。综上所述，这些方法均在一定程度上强化了木质纤维素的酶解效率，但是酶解糖化成本并没有降低，相反加入的酶解助剂又额外增加了投入成本，同时纤维素酶的活性也并没有显著提高。

对于污泥蛋白，来源于城市污泥，主要作为发泡剂使用，目前还没有用于酶解助剂的研究。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中存在的问题，提供一种利用污泥蛋白为酶解助剂促进木质纤维素酶解糖化的方法，采用污泥蛋白作为酶解助剂，成本低，强化木质纤维素酶解糖化效率。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

包括以下步骤：

1)将木质纤维素生物质粉碎过筛，得到木质纤维素生物质粉；将木质纤维素生物质粉浸泡于去离子水中，充分浸泡后分离出木质纤维素生物质粉；

2)取城市污泥调节pH值为9～12，再经超声处理后冷却至室温，分离出上清液并干燥得到污泥蛋白粉；

3)向步骤1)中分离得到的木质纤维素生物质粉中加入柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液混合均匀，得到混合溶液，再向混合溶液中加入纤维素酶和污泥蛋白粉，得到酶解液；其中，木质纤维素生物质粉和纤维素酶的比为1g：(5～20)FPU，污泥蛋白粉和混合溶液的质量体积比为(0.5～2.5)mg：1mL；酶解液在35～50℃进行酶解反应25～48h，完成利用污泥蛋白为酶解助剂促进木质纤维素的酶解糖化。

进一步地，步骤1)中木质纤维素生物质采用杂交杨木屑；过筛采用的40～80目筛网。

进一步地，步骤1)中浸泡时间为1～4h。

进一步地，步骤2)中用氧化钙或氢氧化钙调节pH值；制得的污泥蛋白粉密封于聚乙烯袋中，4℃贮藏备用。

进一步地，步骤2)中超声处理是在108W和20.024kHz的超声波作用下反应20～40min。

进一步地，步骤2)中分离是在3000r/min离心分离10～15min。

进一步地，步骤2)中上清液于25～40℃干燥5d得污泥蛋白粉。

进一步地，步骤3)中每0.5克木质纤维素生物质中加入5～10mL的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。

进一步地，步骤3)中柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的浓度为0.075mol/L，pH值为4.8。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

1、本发明方法采用污泥蛋白作为酶解助剂，污泥蛋白的加入降低了木质素对纤维素酶的非特异性吸收，节省了纤维素酶的用量；同时污泥蛋白还能降低酶的热失活，保证酶的活性；此外，在污泥蛋白表面活性的作用下，大大降低了酶与气液界面的接触，避免了纤维素酶的损耗。2、在强化木质纤维素酶解糖化的同时，也实现了污泥的资源化利用，使其变废为宝，减少了环境污染，有效的解决了污泥处理处置问题。3、通过污泥蛋白的加入，在达到强化木质纤维素酶解糖化效率的同时，还简化了生物质的预处理工序与成本。并且污泥蛋白加入后，可在更短的时间内(＜50h)达到较高的效率，而目前的研究均要在90h甚至100h以上才能达到相同高度的酶解率，本方法缩短了反应时间，有效降低了水解单糖因过度水解而造成的损失。本发明以污泥蛋白作为酶解助剂，强化木质纤维素酶解糖化作用，不仅实现了污泥的资源化利用，还提高了污泥蛋白的附加值，同时更降低了木质纤维素酶解糖化成本，这对解决能源危机将具有重要意义。

【附图说明】

图1是本发明实施例1酶解时间对还原糖得率的影响。

图2是本发明实施例2酶解时间对还原糖得率的影响。

图3是本发明实施例3酶解时间对还原糖得率的影响。

【具体实施方式】

下面结合附图对本发明做进一步详细说明。

本发明方法通过如下步骤进行的：

1)城市污泥取自城市污水处理厂，除去污泥中过大体积杂物；木质纤维素生物质选择杂交杨木屑，首先取一定量的杂交杨木屑，挑出异物，将选好的杂交杨木屑粉碎过筛(40～80目)，将过筛后的木屑粉浸泡于去离子水中，浸泡时间1～4h，抽滤分离出木屑粉。杂交杨木屑可用任何木质纤维素生物质代替。

2)将选好城市污泥用氧化钙或氢氧化钙调节pH为9～12，取300～500mL调节好pH的污泥置于1L反应器中，在超声波(108W，20.024kHz)作用下反应20～40min。然后将反应物冷却至室温，于3000r/min离心分离10～15min。取出上清液于25～40℃干燥5d得污泥蛋白粉，将制得的污泥蛋白粉密封于聚乙烯袋中4℃贮藏，备用。

3)将步骤1)中分离得到的木屑粉作为底物，取0.5g置于50mL烧瓶中，向其中加入5～10mL 0.075mol/L(pH 4.8)柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液充分混合，得到混合溶液，然后再分别向烧瓶中加入纤维素酶和污泥蛋白粉，充分混合，其中，纤维素酶的添加量为5～20FPU/g底物；污泥蛋白粉和混合溶液的质量体积比为(0.5～2.5)mg：1mL。酶解反应在恒温震荡培养箱(160r/min)中进行，温度35～50℃，反应时间25～48h。在一定的反应时间间隔后，取出样品进行还原糖与酶活性分析。

本发明提供了一种利用污泥蛋白为酶解助剂促进木质纤维素酶解糖化的方法，首先将城市污泥超声破解制备污泥蛋白粉，然后将制得的污泥蛋白粉与纤维素酶一起作用于经过预处理的生物质，具有新颖、独特、成本低等特点，克服现有技术酶活性低、效率低、成本高等缺陷。

下面通过实施例对本发明进行详细描述。

实施例1

(1)城市污泥、生物质的取样：

城市污泥取自城市污水处理厂，除去污泥中过大体积杂物；木质纤维素生物质选择杂交杨木屑，首先取一定量的杂交杨木屑，挑出异物，将选好的杂交杨木屑粉碎过筛(40目)，将过筛后的木屑粉浸泡于去离子水中，浸泡时间1h。

(2)污泥蛋白的制备：

将选好城市污泥用氧化钙调节pH为9，取300mL调节好pH的污泥置于1L反应器中，在超声波(108W，20.024kHz)作用下反应20min。然后将反应物冷却至室温，于3000r/min离心分离10min。取出上清液于25℃干燥5d得污泥蛋白粉，将制得的污泥蛋白粉密封于聚乙烯袋中4℃贮藏，备用。

(3)酶解反应：

取(2)中浸泡后的样品0.5g置于50mL烧瓶中，向其中加入5mL 0.075mol/L(pH 4.8)柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液充分混合,然后在分别向烧瓶中加入5FPU/g的纤维素酶和0.5mg/mL的蛋白粉，充分混合。酶解反应在恒温震荡培养箱(160r/min)中进行，温度35℃，反应时间48h。在一定的反应间隔后，取出样品进行还原糖与酶活性分析。

效果分析：

上述实施例中在污泥蛋白的作用下，纤维素酶活性由8750U提高到了12145U，酶活性得到了显著提高。

对于酶解糖化效率，见图1，由图可知，在酶解48h后，还原糖得率即已达到519.11mg/g，而Jin等在相关研究中，当Ca(OH)₂剂量为1.75％(w/v)，预处理温度160℃，酶载量120FPU/g，酶解时间96h，还原糖得率才达到500mg/g以上，Jin Shuguang,Bioresource Technology，2016，205。

实施例2

(1)城市污泥、生物质的取样：

城市污泥取自城市污水处理厂，除去污泥中过大体积杂物；木质纤维素生物质选择杂交杨木屑，首先取一定量的杂交杨木屑，挑出异物，将选好的杂交杨木屑粉碎过筛(50目)，将过筛后的木屑粉浸泡于去离子水中，浸泡时间2h。

(2)污泥蛋白的制备：

将选好城市污泥用氧化钙调节pH为10.5，取350mL调节好pH的污泥置于1L反应器中，在超声波(108W，20.024kHz)作用下反应25min。然后将反应物冷却至室温，于3000r/min离心分离11min。取出上清液于30℃干燥5d得污泥蛋白粉，将制得的污泥蛋白粉密封于聚乙烯袋中4℃贮藏，备用。

(3)酶解反应：

取(2)中浸泡后的样品0.5g置于50mL烧瓶中，向其中加入6mL 0.075mol/L(pH 4.8)柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液充分混合,然后在分别向烧瓶中加入7FPU/g的纤维素酶和1mg/mL的蛋白粉，充分混合。酶解反应在恒温震荡培养箱(160r/min)中进行，温度40℃，反应时间48h。在一定的反应间隔后，取出样品进行还原糖与酶活性分析。

效果分析：

上述实施例中在污泥蛋白的作用下，纤维素酶活性由8750U提高到了16584U，酶活性得到了显著提高。

对于酶解糖化效率，见图2，由图可知，在酶解48h后，还原糖得率达530.35mg/g。

实施例3

(1)城市污泥、生物质的取样：

城市污泥取自城市污水处理厂，除去污泥中过大体积杂物；木质纤维素生物质选择杂交杨木屑，首先取一定量的杂交杨木屑，挑出异物，将选好的杂交杨木屑粉碎过筛(60目)，将过筛后的木屑粉浸泡于去离子水中，浸泡时间2.5h。

(2)污泥蛋白的制备：

将选好城市污泥用氧化钙调节pH为11，取400mL调节好pH的污泥置于1L反应器中，在超声波(108W，20.024kHz)作用下反应30min。然后将反应物冷却至室温，于3000r/min离心分离12min。取出上清液于35℃干燥5d得污泥蛋白粉，将制得的污泥蛋白粉密封于聚乙烯袋中4℃贮藏，备用。

(3)酶解反应：

取(2)中浸泡后的样品0.5g置于50mL烧瓶中，向其中加入7mL 0.075mol/L(pH 4.8)柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液充分混合,然后在分别向烧瓶中加入10FPU/g的纤维素酶和1.5mg/mL的蛋白粉，充分混合。酶解反应在恒温震荡培养箱(160r/min)中进行，温度45℃，反应时间48h。在一定的反应间隔后，取出样品进行还原糖与酶活性分析。

效果分析：

上述实施例中在污泥蛋白的作用下，纤维素酶活性由8750U提高到了18489U，酶活性得到了显著提高。

对于酶解糖化效率，见图3，由图可知，在酶解48h后，还原糖得率达到525.76mg/g。

实施例4

城市污泥取自城市污水处理厂，除去污泥中过大体积杂物；木质纤维素生物质选择杂交杨木屑，首先取一定量的杂交杨木屑，挑出异物，将选好的杂交杨木屑粉碎过筛(70目)，将过筛后的木屑粉浸泡于去离子水中，浸泡时间3h。将选好城市污泥用氧化钙调节pH为11.5，取450mL调节好pH的污泥置于1L反应器中，在超声波(108W，20.024kHz)作用下反应35min。然后将反应物冷却至室温，于3000r/min离心分离13min。取出上清液于37℃干燥5d得污泥蛋白粉，将制得的污泥蛋白粉密封于聚乙烯袋中4℃贮藏，备用。取浸泡后的木屑0.5g置于50mL烧瓶中，向其中加入8mL 0.075mol/L(pH 4.8)柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液充分混合,然后在分别向烧瓶中加入15FPU/g的纤维素酶和2mg/mL的蛋白粉，充分混合。酶解反应在恒温震荡培养箱(160r/min)中进行，温度48℃，反应时间48h。

实施例5

城市污泥取自城市污水处理厂，除去污泥中过大体积杂物；木质纤维素生物质选择杂交杨木屑，首先取一定量的杂交杨木屑，挑出异物，将选好的杂交杨木屑粉碎过筛(80目)，将过筛后的木屑粉浸泡于去离子水中，浸泡时间4h。将选好城市污泥用氧化钙调节pH为12，取500mL调节好pH的污泥置于1L反应器中，在超声波(108W，20.024kHz)作用下反应40min。然后将反应物冷却至室温，于3000r/min离心分离15min。取出上清液于40℃干燥5d得污泥蛋白粉，将制得的污泥蛋白粉密封于聚乙烯袋中4℃贮藏，备用。取浸泡后的木屑0.5g置于50mL烧瓶中，向其中加入10mL 0.075mol/L(pH 4.8)柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液充分混合,然后在分别向烧瓶中加入20FPU/g的纤维素酶和2.5mg/mL的蛋白粉，充分混合。酶解反应在恒温震荡培养箱(160r/min)中进行，温度50℃，反应时间48h。

上述方法既增强了酶活性、节省了酶载量、降低了成本、又提高了生物质还原糖得率，同时也实现了污泥的资源化利用；此外，污泥蛋白的加入显著地缩短了反应时间，进一步降低了水解单糖因过度水解而造成的损失。

以上述及内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所作的任何等效变换，均应属于本发明的保护范围。