结核分枝杆菌复合群和鸟-胞外分枝杆菌复合群的杂交膜条和检测试剂盒的制作方法

本发明属于医学检测领域，具体的是涉及结核分枝杆菌复合群和鸟-胞外分枝杆菌复合群的杂交膜条和检测试剂盒。

背景技术：

结核病是危害国民健康的重大传染病，我国是主要的结核病发病大国之一。由于结核分枝杆菌的特殊性，对其检测和治疗，一致是制约人类攻克结核病的瓶颈。传统的结核诊断方法是基于培养技术，由于结核分枝杆菌独特的生长特性，一般培养需要3-4周才能得到结果，即使是最先进的液体培养技术，也需要10天左右才能得到检查的结果，这给结核病的筛查、确证带来严峻挑战。随着分子检测技术的出现，因其卓越的灵敏度和特异性表现，为结核病的筛查和诊断，提供了有利的工具。近年来，越来越多的报道显示，我国的结核发病率虽然得到了一定控制，但结核病的诊疗负担一直非常严重，尤其是非典型结核分枝杆菌的检出率呈逐年递增的态势，而其中，鸟-胞外分枝杆菌是主要的非结核分枝杆菌符合群，特别是hiv合并感染者，鸟分枝杆菌阳性检出率高居非典型分枝杆菌的首位。

结核分枝杆菌因其高传染风险和严重的感染危害，要求我们开发出一种简便有效并且可以避免操作风险的检测系统；而非典型结核分枝杆菌，特别是鸟-胞外分枝杆菌符合群，由于其检出率的逐年上升，加上对一线结核药物的耐受性，从而导致与结核截然不同的治疗方案。但其感染所引起的症状与结核分枝杆菌相似，因此，要求我们开发出一种可以检测并区分结核分枝杆菌和非结合分枝杆菌的检测试剂。

基于以上重要的现实问题，我们开发一种利用单链杂交技术为基础的、全自动化的、可检测结核和鸟-胞外分枝杆菌的系统。为临床检验提供一个简便、安全、有效、廉价的tb-mac检测试剂。

技术实现要素：

本发明的目的之一是提供一种快速检测结核分枝杆菌和鸟-胞外分枝杆菌的试剂盒，该试剂盒具有很好的特异性以及敏感性，可用于快速检测结核分枝杆菌和鸟-胞外分枝杆菌。

实现上述目的的技术方案如下。

一种快速检测结核分枝杆菌和鸟-胞外分枝杆菌的试剂盒，包括有：

(1)杂交膜条，所述杂交膜条的硝酸纤维素膜上固定有以下至少一种探针：针对结核分枝杆菌和鸟-胞外分枝杆菌的分别与seqidno.1、seqidno.2完全互补的寡核苷酸序列；

(2)扩增引物：包括与(1)相应地针对结核分枝杆菌和鸟-胞外分枝杆菌的扩增引物分别为seqidno.3和seqidno.4，seqidno.5和seqidno.6中至少一对扩增引物，针对结核分枝杆菌和鸟-胞外分枝杆菌的扩增引物的正向引物的5’端分别连接有seqidno.1、seqidno.2的标签序列，所述扩增引物的反向引物连接有第一显色标记物。

在其中一个实施例中，还包括有微球，所述微球上连接有能与第一显色标记物对应结合的第二显色标记物，优选地，所述第一显色标记物为生物素，第二第二显色标记物为链酶亲和素。

在其中一个实施例中，所述杂交膜条的硝酸纤维素膜上固定有两种探针：针对结核分枝杆菌和鸟-胞外分枝杆菌的分别与seqidno.1、seqidno.2完全互补的寡核苷酸序列。

本发明的另一个目的是提供一种用于检测结核分枝杆菌和鸟-胞外分枝杆菌的杂交膜条。

具体技术方案如下。

一种用于检测结核分枝杆菌和鸟-胞外分枝杆菌的杂交膜条，包括有pvc板，pvc板上粘贴有硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜上固定有以下至少一种探针：针对有结核分枝杆菌和鸟-胞外分枝杆菌的分别与seqidno.1、seqidno.2完全互补的寡核苷酸序列。

在其中一个实施例中，所述膜条上固定有两种探针：针对结核分枝杆菌和鸟-胞外分枝杆菌的分别与seqidno.1、seqidno.2完全互补的寡核苷酸序列。

本发明具有以下优点：

1)本发明所述试剂盒通过特殊的检测片段选取，可以实现单种微生物的检测，更能实现在同一管pcr反应中，同时检测2种类群病原微生物的存在，为筛查提供了一个简单,快速的选择。

2)经过发明人的经验积累和大量实验所筛选到的扩增引物，以及探针，结合优化的杂交膜条，得到的检测结核分枝杆菌复合群和鸟-胞外分枝杆菌复合群的试剂盒具有非常好的特异性和灵敏度，同时又能快速检测2种病原体复合群。

3)特殊的膜杂交技术，不需要使用杂交仪，在室温情况下，在pcr管中即可完成杂交，比目前普遍使用的杂交方案，此外，还可以可以用肉眼判读，大大降低的使用成本，大大的节省了时间和设备成本。

附图说明

图1为两种病原微生物pcr扩增片段电泳图；

图2为杂交膜条的检测结果示意图；

图3为tb对临床样本的检测结果示意图；

图4为tb特异性实验结果示意图；

图5为mac特异性实验结果示意图；

图6为灵敏度实验结果示意图；

图7为常见干扰物质的抗干扰实验结果示意图，其中a:mac抗干扰实验结果；b：tb抗干扰实验结果。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

一种多重pcr技术同时扩增结核分枝杆菌和鸟-胞外分枝杆菌的保守序列：通过序列分析，本试剂盒分别选取两种病原微生物的特异性保守区域作为目标扩增区域，并设计特异性的引物作为扩增引物，其对应扩增区域及引物见下表：

本发明所述试剂盒是采用pcr核酸扩增结合膜层析显色的方法同时进行两种病原微生物dna(tb/mac)的定性检测。采通过一对分别含有核苷酸标签(tag)和生物素标记(biotin)的正反向引物进行pcr扩增。c-pas膜条上固定有与正向引物核苷酸标签序列完全互补的寡核苷酸序列，pcr扩增产物可在常温下通过溶液层析作用与膜条上互补序列杂交进而固定在膜条相应的位置上，再通过生物素-链酶亲和素亲和作用进行显色，呈现出肉眼可辨析的蓝色指示条带。具体如下。

扩增片段选取和引物设计：利用ncbi数据库，查找待测两种病原微生物的基因组序列，并通过序列的比对分析，blast分析找到两种病原微生物的特异性的保守序列，作为待检测核酸序列(见上文数据)。利用primer3等在线引物设计进行引物设计。并在设计好的正向引物的5端上加上特异性的核苷酸标签(tb：gcagattcattggtcagagaaca；mac：tgttctctgaccaatgaatctgc)；在设计好的反向引物使用biotin标记(第一显色标记物)。

1)核酸提取：使用宝创生物技术公司生产的核酸提取试剂盒(备案号：粤穗械备20150224号)，根据说明书要求操作，进行样本提取。其具体操作步骤如下：a)临床收集到的样本(如痰液样本)，通过核酸提取试剂盒，提取样本的微生物基因组dna。b)提取的基因组dna作为模板，利用本试剂盒试剂进行pcr扩增，扩增的程序如下所示；

pcr扩增的程序如下表，适用于abi等pcr仪器。

pcr扩增：提取的核酸进行pcr扩增，反应体系为：2xpcr缓冲液10ul,tb-mac引物5ul,模版dna5ul.混合均匀。同管扩增，pcr反应条件为：

第一步：95摄氏度，2分钟

第二步：94摄氏度，5秒

第三步：60摄氏度，10秒

第二步到第三步，重复30个循环

第四步：4摄氏度，无限循环。

凝胶电泳：配置1.5％的琼脂糖凝胶(称取1.5g琼脂糖份，加入100ml的tae缓冲液，在微波炉中加热，直致所有琼脂糖全部溶解，将产物在50-60摄氏度的水浴锅中平衡20分钟，并按照0.01％的比率加入eb)，将pcr产物与上样缓冲液混合均匀，上样10ul,在120v的条件下进行电泳，30分钟。凝胶电泳在紫外光下进行拍照。

实验结果：扩增结果参见图1。从拍照的结果可以看出，采用两种参考品扩增，pcr反应正常进行，扩增条带明显，没有非特异性扩增产生。

2)杂交膜条制备：将硝酸纤维素膜(4cmx20cm)贴附于pvc板上(6cmx20cm)，并将吸水纸(2.1cmx20cm)贴在pvc板上，与硝酸纤维素膜有0.1cm重叠。将2条与核苷酸标签方向互补的单链核苷酸，以20ng/ul的浓度噴洒在硝酸纤维素膜上(每一厘米膜上喷洒200ng核苷酸探针)，每个探针间喷洒红色位置线(红色打印油墨)以区分。所述硝酸纤维素膜上固定的探针的位置排列依次为：针对结核分枝杆菌复合群、鸟-胞外分枝杆菌复合群的探针，相邻的探针的固定距离为1mm。本实施例中硝酸纤维素膜固定的探针的位置为：参见图3，内对照：距离位置线1上0.5mm,mac：位置线2下0.5mm，tb:位置线3上0.5mm)。将制好的大板在37摄氏度干燥过夜，并切成(2mmx6cm)的长条备用。

3)杂交显色液的配置：杂交显色液所含物质的终浓度为：100mmhepes－hcl缓冲液，ph8.0；1m的氯化钠；0.4mmedta溶液，ph8.0；1％的latex微球。溶解hepes到去离子水，用浓hcl调整ph到8,然后加入适量nacl和edta溶液，最后加水补足体积，定容到hepes终浓度，最后每99ml溶液中加入1ml的latex微球。(杂交时间为5-10分钟，当latex微球在杂交线上富集时，就会显示出其本身蓝色。latex微球购买厂家为：日本的jsrlifesciencescorporation)，微球上连接有链酶亲和素。

结果判读：如附图2所示，位置线3上方出现蓝色条带代表tb阳性；位置线2下方靠近位置线2的位置出现蓝色条带代表mac阳性。检测对象为阴性时，只在位置线1上方出现蓝色条带。

实施例2

实验样本：分两批向临床实验单位取总共12个阴道拭子样本，第一批取5个tb阳性样本，1个tb阴性样本，；第二批同样取5个ng阳性样本，1个ng阴性样本.

核酸提取：痰液样本用1000ul的痰液液化剂充分溶解洗涤，将样本置于5000rpm转速的离心机中，离心15分钟，去除上清，所得沉淀，用核酸提取试剂盒(粤穗械备20150224号)的样本裂解液处理，然后根据试剂说明书进行核酸提取。最后用50微升蒸馏水，洗脱核酸，备用

pcr扩增：提取的核酸进行pcr扩增，反应体系为：2xpcr缓冲液10ul,tb-mac引物5ul,样本dna5ul.混合均匀。pcr反应条件为：

第一步：95摄氏度，2分钟

第二步：94摄氏度，5秒

第三步：60摄氏度，10秒

第二步到第三步，重复30个循环。

第四步：4摄氏度，无限循环

杂交反应：将稀释的显色液与pcr产物1：1混合，去除膜条，插入相应的pcr管中，静置5-15分钟后，取出膜条，读取结果，并拍照。

实验结果：从实验结果来看，tb对临床样本的检测特异性达到了100％，可见本试剂的检测特异性是非常高(参见图3)。

实施例3：tb特异性实验

实验样本：分两批向临床实验单位取总共8个阴道拭子样本，第一批取3个tb阳性样本，1个tb阴性样本；第二批同样取3个tb阳性样本，1个tb阴性样本.

核酸提取：痰液样本用1000ul的痰液液化剂充分溶解洗涤，将样本置于5000rpm转速的离心机中，离心15分钟，去除上清，所得沉淀，用核酸提取试剂盒(粤穗械备20150224号)的样本裂解液处理，然后根据试剂说明书进行核酸提取。最后用50微升蒸馏水，洗脱核酸，备用。

pcr扩增：提取的核酸进行pcr扩增，反应体系为：2xpcr缓冲液10ul,tb-mac引物5ul,样本dna5ul.混合均匀。pcr反应条件为：

第一步：95摄氏度，2分钟

第二步：94摄氏度，5秒

第三步：60摄氏度，10秒

第二步到第三步，重复30个循环。

第四步：4摄氏度，无限循环

杂交反应：将稀释的显色液与pcr产物1：1混合，去除膜条，插入相应的pcr管中，静置5-15分钟后，取出膜条，读取结果，并拍照。

实验结果：从实验结果来看，tb对临床样本的检测特异性达到了100％，可见本试剂的检测特异性是非常高的(参见图4)。

实施例4：mac特异性实验

实验样本：分两批向临床实验单位取总共12个阴道拭子样本，第一批取5个mac阳性样本，1个mac阴性样本；第二批同样取5个mac阳性样本，1个mac阴性样本.

核酸提取：痰液样本用1000ul的痰液液化剂充分溶解洗涤，将样本置于5000rpm转速的离心机中，离心15分钟，去除上清，所得沉淀，用核酸提取试剂盒(粤穗械备20150224号)的样本裂解液处理，然后根据试剂说明书进行核酸提取。最后用50微升蒸馏水，洗脱核酸，备用。

pcr扩增：提取的核酸进行pcr扩增，反应体系为：2xpcr缓冲液10ul,tb-mac引物5ul,样本dna5ul.混合均匀。pcr反应条件为：

第一步：95摄氏度，2分钟

第二步：94摄氏度，5秒

第三步：60摄氏度，10秒

第二步到第三步，重复30个循环。

第四步：4摄氏度，无限循环

杂交反应：将稀释的显色液与pcr产物1：1混合，去除膜条，插入相应的pcr管中，静置5-15分钟后，取出膜条，读取结果，并拍照。

实验结果：从实验结果来看，mac对临床样本的检测特异性达到了100％，可见本试剂的检测特异性是非常高的(参见图5)。

实施例5灵敏度实验

参考品配置：向国家参考物质中心购买tb和mac参考品，并使用广州市宝创生物技术有限公司生产的核酸提取试剂盒(粤穗械备20150224号)，按照说明书步骤，进行核酸提取。提取的核酸，使用紫外分光光度仪(nanodrop-2000)进行核酸浓度的测量，在根据测量的浓度，把核酸稀释到160ng/ul的浓度，此时的核酸拷贝数为1.0x10⁵,在用蒸馏水稀释到10⁴，10³，10²copies/ml。tb和mac的标准菌株购自中国微生物菌种保存中心。使用同样的方法进行核酸提取和参考品的浓度测定。最终我们配置了5个mac(命名为a：10⁵copies/ml；b:10⁴copies/ml；c:10³copies/ml；d:10²copies/ml；e:0copies/ml)和4个tb(命名为k：10⁴copies/ml；l:10³copies/ml；m:10²copies/ml；n:0copies/ml)的参考品

pcr扩增：提取的核酸进行pcr扩增，反应体系为：2xpcr缓冲液10ul,tb-mac引物5ul,样本dna5ul.混合均匀。pcr反应条件为：

第一步：95摄氏度，2分钟

第二步：94摄氏度，5秒

第三步：60摄氏度，10秒

第二步到第三步，重复30个循环

第四步：4摄氏度，无限循环。

杂交反应：将稀释的显色液与pcr产物1：1混合，去除膜条，插入相应的pcr管中，静置5-15分钟后，取出膜条，读取结果，并拍照。

实验结果：以上所考察的参考品，均可以溯源至权威出处。从实验结果来看，tb-amc的最低检出限均可以达到10³copies/ml，可见本试剂的检测灵敏度是非常高的。参见图6。

实施例7常见干扰物质的抗干扰实验

采用的干扰物质：

1)口腔清洁液10％加入痰样本

2)醋酸溶液10％加入痰样本

3)含有出血的痰样本

4)使用过抗真菌药物的痰样本

5)试用过抗生素的痰样本

6)1％的sds加入dna样本

7)1％的乙醇加入dna样本

8)10％的nacl加入dna样本

以上1-5号样本为临床确认的阳性样本，使用核酸提取试剂进行dna提取后，备用。6-8号样本为无干扰物质的临床阳性样本，提取dna后，在添加对应的物质，制备干扰样本，备用。

pcr扩增：参照上述实验。

杂交反应：将稀释的显色液与pcr产物1：1混合，去除膜条，插入相应的pcr管中，静置5-15分钟后，取出膜条，读取结果，并拍照。

实验结果：参见图7，从拍照的结果可以看出，以上所考察的干扰情况，均不影响pcr的扩增和膜条的杂交反应，检测结果与临床判定结果一致。说明本申报试剂具有极强的抗干扰能力。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

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