本发明属于动物分子遗传学领域，特别是涉及一种利用基因表达量鉴定低脂肉鸡的方法。
背景技术：
经过长期的选育，肉鸡的生长速度和产肉量得以明显提高。然而肉鸡育种却面临着新的挑战：伴随着快速生长，肉鸡生理性不适症及相关疾病明显增加，如体脂蓄积过多、腹水综合症、猝死症、腿部疾病、机体免疫功能下降等，这些问题给肉鸡生产者造成了巨大的经济损失。肉鸡体脂(尤其是腹脂)蓄积过多已成为一个突出的问题。肉仔鸡体内沉积过多的脂肪有诸多不利：(1)明显降低饲料转化效率，因为沉积单位重量的脂肪比沉积单位重量的瘦肉多消耗三倍的能量；(2)降低了胴体瘦肉对脂肪组织的比例，因而降低了分割肉产量；(3)加工者和消费者将肉仔鸡体内沉积的这些脂肪的很大一部分(腹脂垫、肌胃周围脂肪、嗉囔脂肪及肠系膜脂肪等)丢弃，这不仅增加了加工者和消费者的负担，而且增加了废物及处理水中的脂肪含量，从而污染了环境。由此看来，肉仔鸡体内沉积过多的脂肪将会给生产者、加工者和消费者造成显而易见的经济损失。肉种鸡过肥会严重影响产蛋率、受精率和孵化率，并且会诱导脂肪肝综合症(flhs)的发生，从而加大了产蛋期的死淘率。因此，控制脂肪在鸡体内的过多蓄积，进一步提高肉鸡的饲料转化效率和胴体质量是亟待研究解决的重大问题。
鸡tcf21基因位于3号染色体上，具有两个外显子和一个内含子，共编码179个氨基酸。有研究发现，在鸡胚胎发育过程中的多种组织中均能检测到tcf21的表达；tcf21在鸡血管生成和创伤愈合过程中发挥重要作用(soulet等，2010)；tcf21在鸡心脏发育过程中扮演关键性角色。迄今为止，没有发现tcf21基因在鸡脂肪组织生长发育过程中的功能及调控机制方面的研究报道。
技术实现要素：
本发明针对如何鉴定低脂肉鸡的问题，提供了一种利用tcf21基因mrna表达量鉴定低脂肉鸡的方法，包括如下步骤：
(1)引物设计与合成：设计并合成用于扩增tcf21基因cds区的引物对及用于扩增tbp基因cds区的引物对；
(2)提取待测肉鸡腹部脂肪组织总rna并进行反转录获得cdna；
(3)荧光定量pcr：分别利用步骤(1)所述的引物对，以待测肉鸡腹部脂肪组织cdna为模板进行荧光定量pcr；
(4)鉴定是否为低脂肉鸡：对步骤(3)所述实时荧光定量pcr的ct值进行统计分析，当待测肉鸡腹部脂肪组织中tcf21基因mrna的相对表达量小于0.125时，鉴定待测肉鸡为低脂肉鸡，所述相对表达量是以tbp基因为内参计算获得的。
优选地：
步骤(1)所述扩增tcf21基因cds区的引物对是以鸡tcf21基因mrna序列为模板设计的，上游引物为tcf21-f，其序列如seqidno：1所示，下游引物为tcf21-r，其序列如seqidno：2所示。
步骤(1)所述扩增tbp基因cds区的引物对是以鸡tbp基因mrna序列为模板设计的，上游引物为tbp-f，其序列如seqidno：3所示，下游引物为tbp-r，其序列如seqidno：4所示。
步骤(2)所述总rna提取方法为trizol法。
步骤(2)所述反转录条件为：(1)总rna1μg，2.5μmoligodt引物0.5μl，再加入rnase-free水补至5μl，反应条件为：70℃5min，冰浴5min；(2)然后向上述体系中加入如下试剂：
反应条件：25℃5min，42℃60min，70℃15min，4℃保温，获得cdna。
步骤(3)所述荧光定量pcr反应体系为：
反应条件为：95℃预变性10min，95℃15s，60℃1min，共40个循环，每个样品设置3个重复。
步骤(4)所述统计分析利用jmp软件进行。
步骤(4)所述tcf21基因的mrna的相对表达量是采用2-δct方法计算获得的，其中δct＝ct(tcf21)—ct(tbp)，ct(tcf21)为tcf21基因荧光定量pcr反应中荧光信号到达设定的阈值时经历的循环数，ct(tbp)为tbp基因荧光定量pcr反应中荧光信号到达设定的阈值时经历的循环数。
有益效果
本发明方法可高效准确的鉴定低脂肉鸡，还可以通过该方法研究tcf21基因在脂肪组织生长发育中的生物学功能和调控机制，能够更全面的理解肉鸡腹脂沉积过多的发生机理，加速肉鸡的育种过程。
附图说明
图1是tcf21基因在1-7周龄高、低脂肉鸡腹部脂肪组织中mrna的表达情况，横坐标为肉鸡周龄，纵坐标为tcf21基因相对于tbp基因的mrna相对表达量。
图2是tcf21基因在1-7周龄高、低脂肉鸡腹部脂肪组织中蛋白质的表达情况，左图为tcf21蛋白westernblot凝胶显色结果，1w-7w分别代表为1周至7周；右图横坐标为肉鸡周龄，纵坐标为tcf21基因相对于β-actin基因的蛋白相对表达量。
具体实施方式
名词解释：
cds：sequencecodingforaminoacidsinprotein蛋白质编码区
ct值：c代表cycle，t代表threshold，cyclethreshold循环阈值，ct值的含义是每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。
一、本发明所用实验材料如下：
1.实验材料：肉鸡腹部脂肪组织，来自于东北农业大学选育的第十九世代1-7周龄高、低脂双向选择系肉鸡共70只(高、低脂系肉鸡各5只/周龄),所述第十九世代高、低脂肉鸡的详细信息记载在genetselevol.2017feb24；49(1):25.doi:10.1186/s12711-017-0299-0.tcf21isrelatedtotestisgrowthanddevelopmentinbroilerchickens.zhangh,naw,zhanghl,wangn,duzq,wangsz,wangzp,zhangz,lih.所述的第十九世代高、低脂双向选择系肉鸡，高脂肉鸡7周龄腹脂率平均水平为4.97％、低脂肉鸡7周龄腹脂率平均水平为0.729％，高脂肉鸡与低脂肉鸡其腹部脂肪含量有极显著差异，高脂肉鸡腹部脂肪含量为低脂肉鸡腹部脂肪含量的6.8倍。
腹脂率：腹部脂肪含量(重量)和活体重量的比值。
2.药品和酶：
reversetranscriptase，promega公司，货号a3802；trizolreagent，invitrogen公司，型号15596018；faststartuniversalsybrgreenmaster，roche公司，型号04913914001；dntp(ad101-02)、蛋白marker(dm201-02)，全式金公司；oligodt引物(3806)、rnaseinhibitor(2313a)，takara公司；ripa蛋白裂解液，碧云天公司，型号p0013b、b-actin抗体，碧云天公司，型号aa128、pmsf蛋白酶抑制剂，碧云天公司，型号st506；tcf21抗体，艾比玛特公司定制；amoigg(h+l)/hrp山羊抗鼠二抗(zb-2305)、arbigg(h+l)/hrp山羊抗兔二抗(zb-2301)，中杉金桥公司。
3.主要仪器：
abi7500实时定量荧光pcr仪、biometra梯度pcr仪、biopec匀浆器、sanyo制冰机、thermo-80℃冰箱、eppendorf高速冷冻离心机、uvp多功能成像系统、ultrospec1000紫外分光光度计、电泳槽、电泳仪、bio-radwesternblot设备，均通过商业化途径购买获得。
二、本发明所用各试剂的配制方法如下：
1.缓冲液与常用试剂的配制：
50×tae缓冲液：242gtris碱，57.1ml冰乙酸，100ml0.5medta(ph8.0)，加水至1l。
生理盐水：称取7.5gnacl，加100ml去离子水溶解，定容至1000ml，高温高压灭菌。
30％page：称取290g丙烯酰胺和10gbis，加水定容至1000ml。
1mtris-hcl(ph＝6.8)：121.1gtris碱溶于800ml去离子水中，充分搅拌溶解，加1ml浓盐酸，定容至1000ml，灭菌，冷却后将ph调成6.8。
1mtris-hcl(ph＝8.8)：181.7gtris碱溶于800ml去离子水中，充分搅拌溶解，加1ml浓盐酸，定容至1000ml，灭菌，冷却后将ph调成8.8。
5×蛋白电泳液：15.1gtris碱，72.1g甘氨酸，5gsds，加水至1l。
转膜液：2.9g甘氨酸，5.8gtris碱，0.37gsds，加800ml水混匀，再加入200ml乙醇。
实施例1.利用tcf21基因mrna表达量鉴定低脂肉鸡的方法。
(1)引物设计与合成
根据鸡tcf21mrna序列(genebank登录号：nm_001277711)设计引物扩增tcf21基因的cds区，上游引物为tcf21-f：5’-acgctgccaacgcaaggg-3’，下游引物为tcf21-r：5’-tgttcaccacttctttcaggtcactc-3’；根据鸡tbpmrna序列(genebank登录号：nm_205103)：设计引物扩增tbp的cds区，上游引物为tbp-f：5’-gcgttttgctgctgttattatgag-3’，下游引物为tbp-r：5’-tccttgctgccagtctggac-3’，所述引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。
(2)利用trizol法提取肉鸡腹部脂肪组织总rna
1)向50-100mg腹部脂肪组织(液氮中研磨后)加入装有1mltrizol的无rna酶的灭菌ep管中，振荡，4℃静置5min。
2)将ep管至于4℃高速离心机中，12000rpm离心10min，将上清移入一个新的ep管中。
3)加入200μl氯仿，剧烈振荡15s，室温放置10min。
4)将ep管至于4℃高速离心机中，12000rpm离心15min，将上清移入一个新的ep管中。
5)加入400μl异丙醇，摇匀，室温静置10min。
6)将ep管至于4℃高速离心机中，12000rpm离心10min，弃上清。
7)加入1ml75％乙醇，摇匀，将ep管至于4℃高速离心机中，7500rpm离心5min，弃上清。
8)将ep管倒置，空气干燥5-10min。
9)加入40μlrnase-free水溶解，电泳检测总rna的质量，并利用紫外分光光度计测定总rna的浓度和纯度，用于反转录实验，剩余样品保存在-80℃冰箱中备用。
将获得的总rna进行反转录：
1)在0.2ml的ep管中加入：总rna样品约为1μg，oligodt引物(2.5μm)0.5μl，再加入rnase-free水补至5μl，反应条件为：70℃5min，冰浴5min。
2)然后向上述体系中加入如下试剂：
反应条件：24℃5min，42℃60min，70℃15min，4℃保温，所得cdna进行实时定量荧光pcr。
(3)实时荧光定量pcr
分别利用引物tcf21-f、tcf21-r和tbp-f、tbp-r对获得的东北农业大学选育的肉鸡高、低脂双向选择系第十九世代1-7周龄共70只公鸡的腹部脂肪组织cdna进行实时定量荧光pcr扩增，以tbp基因为mrna定量检测的内参基因。
在0.2mlep管中配制以下试剂并混合均匀，反应条件为：95℃预变性10min，95℃15s，60℃1min，共40个循环，每个样品设置3个重复，在40个循环后进行熔解曲线的检测，检测是否有二聚体。
tcf21基因实时荧光定量pcr体系：
tbp基因实时荧光定量pcr体系：
(4)鉴定待测肉鸡是否为低脂肉鸡
鸡tcf21基因在肉鸡腹脂双向选择系中的表达情况分析：利用2-δct方法将原始ct值转换为tcf21基因的相对表达量，计算并比较tcf21基因在高、低脂系肉鸡腹部脂肪组织中的mrna表达水平。其中δct＝ct(tcf21)-ct(tbp)，ct(tcf21)为tcf21基因荧光定量pcr反应中荧光信号到达设定的阈值时经历的循环数，ct(tbp)为tbp基因荧光定量pcr反应中荧光信号到达设定的阈值时经历的循环数。利用jmp软件，采用two-samplet-test比较高、低脂系鸡只腹部脂肪组织中tcf21基因mrna的表达量，*p<0.05，**p<0.01。
结果显示，低脂肉鸡腹部脂肪组织中tcf21基因相对于内参基因tbp的相对表达量均小于0.125，且tcf21基因的表达量在两系间存在显著差异(p<0.01)，为低脂肉鸡显著低于高脂肉鸡，见图1所示。
为了进一步验证本发明所述鉴定方法的准确性，利用westernblot方法对1-7周龄高、低脂肉鸡腹部脂肪组织中tcf21的蛋白水平进行检测，以β-actin为蛋白定量检测的内参基因，所述westernblot方法如下：
1)将待测肉鸡腹部脂肪组织块称重，利用液氮、研钵粉碎组织块。
2)加入ripa裂解液和pmsf(具体用量参照说明书)，利用匀浆器进一步匀浆。
3)冰上放置30min，转入离心管，于4℃高速离心机中，12000rpm离心15min。
4)吸取上清液，测定蛋白质浓度后，将所有样品的蛋白浓度都调整为4μg/μl。
5)取相同质量的细胞裂解液，并加入等体积的电泳加样缓冲液，沸水煮10min。
6)上样，电泳(120v，90min)。
7)转膜(200ma，60min)。
8)5％脱脂乳封闭60min。
9)加入一抗，4℃过夜孵育。
10)pbst洗3次，每次10min。
11)加入二抗，室温摇床60min。
12)pbst洗3次，每次10min。
13)显色。
利用lane1d软件将蛋白条带转换为灰度值，计算tcf21蛋白的相对表达量。
利用jmp软件，采用two-samplet-test比较高、低脂系鸡只腹部脂肪组织中tcf21蛋白水平的表达量，*p<0.05，**p<0.01。
分析结果表明：1-7周龄低脂肉鸡腹部脂肪组织中tcf21的蛋白水平均低于高脂肉鸡，且其中2、3、7周龄低脂肉鸡腹部脂肪组织中tcf21的蛋白水平显著低于高脂肉鸡(p<0.05)，见图2所示。
综上所述，当待测肉鸡腹部脂肪组织中tcf21基因的mrna的相对表达量小于0.125时，可用于鉴定待测肉鸡为低脂肉鸡。
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<110>东北农业大学
<120>一种利用tcf21基因mrna表达量鉴定低脂肉鸡的方法
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