本发明涉及单克隆抗体的制备以及筛选,特别是涉及能够与乙肝病毒表面抗原结合的单克隆抗体。
背景技术：
：乙型肝炎病毒(hbv)是一种双链dna病毒，属于嗜肝dna病毒科，是直径约42nm的球形颗粒。具有外壳和核衣壳两部分，外壳厚7-8nm，具有s蛋白，m蛋白和l蛋白，s蛋白表面具有与病毒感染有关的乙肝表面抗原(hbsag)。乙型肝炎病毒是引起病毒性肝炎的最常见病原，其可以通过血液、母婴、密切接触和性接触传染，人体感染乙肝病毒后，易引起慢性乙型肝炎，进而导致肝硬化和/或肝癌。目前，全世界有约4亿慢性乙肝病毒(hbv)感染者，而中国大约有1亿携带者，高居世界第一。据统计，每年有100万～150万人死于急性或慢性hbv感染导致的肝功能衰竭、肝硬化和/或肝癌。因而预防hbv感染成为世界公共健康问题。利用免疫学反应原理来检测样本中是否存在被分析物质的这一技术被广泛应用在各个领域。可以用该原理来检测各种生物样本(唾液、血液、尿液、血清、汗液等)中的被分析物质，以达到来检测疾病和人类的健康状况(早孕、肿瘤、传染病、毒品等)的目的。这种检测技术的根本原理是建立在免疫分子之间具有特异性结合的性能，例如抗体与抗原、半抗原/抗体，生物素与抗生素等。另外，很多这样的检测都可以在固体介质上完成，例如常用的层析试剂条、玻璃或塑料多孔盘中，免疫层析装置等。通常，在免疫特异结合分子上可以在结合一些固体颗粒或者化学物质，这样可以通过肉眼或其它仪器设备来定性、半定量或定量的得出检测结果。这种固体颗粒可以是带颜色的胶体颗粒(乳胶或金颗粒)，这种化学物质可以是带有发色基团的物质，这些物质在其它合适的条件下可以发出特定波长来显示检测结果。由于hbv病毒变异较快，可导致hbsag氨基酸序列和结构变异。当hbsag结构变化后，检测突变前的抗原的抗体的免疫结合可能会出现障碍，因此，建立在抗原抗体免疫结合基础上的hbv检测容易出现假阴性结果。如果hbv未被及时检测出来，不仅乙肝携带者自身受影响，并且会导致乙肝病毒随血液、母婴、父婴、密切接触、性行为等传播。因此，应使用对野生型和突变型病毒具有较宽适应性的乙肝抗体作为原料。单克隆抗体，是指仅由一种类型的细胞制作出来的抗体。单克隆抗体由可以制造相应抗体的免疫细胞和癌细胞融合后的细胞产生，这种融合细胞既具有癌细胞不断分裂的能力，又具有免疫细胞可以产生抗体的能力。利用抗原抗体特异性结合的免疫学方法检测乙肝表面抗原(hbsag)，通常会使用双抗体夹心法进行检测。其中一个抗体固定在固相介质上作为包被抗体，另一个抗体上结合固相颗粒或者化学物质作为检测抗体。目前，已有关于能够同时与野生型或突变型hbsag相结合的一对单克隆抗体的报道。例如us2004/0219154a1能够同时与野生型的和6种突变型乙肝表面抗原结合。然而，目前仍有很多突变型hbsag未能被识别，因此，对具有同时结合野生型和突变型hbsag的单克隆抗体具有很大的需求。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是寻求能够结合乙肝表面抗原的单克隆抗体，特别是同时结合野生型和突变型hbsag的单克隆抗体。因此，本发明中，通过制备杂交瘤细胞株和单克隆抗体，筛选够与野生型或突变型乙肝表面抗原结合的单克隆抗体。具体的方法是采用hbsag作为抗原，采用通用方法免疫动物，然后把免疫好的动物的免疫细胞与骨髓瘤细胞进行融合制备杂交瘤细胞；杂交瘤细胞分泌出的单克隆抗体。首先，本发明提供一种能够生产结合乙肝表面抗原(hbsag)的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏于中国典型培养物中心(cctcc)，其保藏编号为cctccno:c2016198，分类命名为:杂交瘤细胞株15g6e1，保藏日期是:2016年12月28日，保藏地址是：湖北省武汉市武昌区武汉大学内。优选的，本发明还提供一种结合乙肝表面抗原(hbsag)的单克隆抗体,该单克隆抗体由保藏编号为cctccno:c2016198的杂交瘤细胞株分泌产生，该抗体不仅能够特异性的结合野生型hbsag，还能够与多种突变型抗原结合，该单克隆抗体属于igg1亚型，轻链是kappa链。优选的,本发明还提供一种通过保藏编号为cctccno:c2016198的杂交瘤细胞株产生单克隆抗体的方法，包括以下步骤:(1)筛选获得稳定杂交瘤细胞株:用外购抗原免疫动物，采血测定血清效价后，取免疫动物脾细胞与骨髓瘤细胞sp2/0融合，并用hat筛选得到稳定的杂交瘤细胞株；(2)用elisa法筛选阳性细胞株，克隆得稳定杂交瘤细胞株cctccno:c2016198；(3)将杂交瘤细胞株注射到液体石蜡预处理的balb/c小鼠腹腔，培育，区腹水，protaina亲和层析获得单克隆抗体。优选的，该单克隆抗体还包括该抗体的片段和衍生物。优选的，本发明还提供由保藏编号为cctccno:c2016198的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体在制备乙型病毒性肝炎或乙肝相关疾病的病情评估的试剂或试剂盒中的应用。另一方面，本发明还提供另一种能够生产结合乙肝表面抗原(hbsag)的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏于中国典型培养物中心(cctcc)，其保藏编号为cctccno:c2016210，分类命名为:杂交瘤细胞株5c7，保藏日期是:2016年12月28日，保藏地址是：湖北省武汉市武昌区武汉大学内。优选的，本发明还提供一种结合乙肝表面抗原(hbsag)的单克隆抗体,该单克隆抗体由保藏编号为cctccno:c2016210的杂交瘤细胞株分泌产生，该抗体不仅能够特异性的结合野生型hbsag，还能够与多种突变型抗原结合，该单克隆抗体属于igg1亚型，轻链是kappa链。优选的,一种通过保藏编号为cctccno:c2016210的杂交瘤细胞株产生单克隆抗体的方法，包括以下步骤:(1)筛选获得稳定杂交瘤细胞株:用外购抗原免疫动物，采血测定血清效价后，取免疫动物脾细胞与骨髓瘤细胞sp2/0融合，并用hat筛选得到稳定的杂交瘤细胞株；(2)用elisa法筛选阳性细胞株，克隆得稳定杂交瘤细胞株cctccno:c2016210；(3)将杂交瘤细胞株注射到液体石蜡预处理的f1小鼠腹腔，培育，区腹水，protaina亲和层析获得单克隆抗体。优选的，该单克隆抗体还包括该抗体的片段和衍生物。优选的，本发明还提供由保藏编号为cctccno:c2016210的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体在制备乙型病毒性肝炎或乙肝相关疾病的病情评估的试剂或试剂盒中的应用。此外，本发明还提供由保藏编号分别为cctccno:c2016198和cctccno:c2016210的杂交瘤细胞株在制备乙型病毒性肝炎或乙肝相关疾病的病情评估的试剂或试剂盒中的应用。本发明还提供由保藏编号分别为cctccno:c2016198和cctccno:c2016210的杂交瘤细胞株分别产生的单克隆抗体在制备乙型病毒性肝炎或乙肝相关疾病的病情评估的试剂或试剂盒中的应用。优选的，由保藏编号分别为cctccno:c2016198和cctccno:c2016210的杂交瘤细胞株分别产生的单克隆抗体能够结合野生型和突变型hbsag；其中，所述突变型hbsag在同野生型比较中，不仅仅指氨基酸序列的变化，同时还包括氨基酸变化引起的hbsag结构的改变。优选的，由保藏编号分别为cctccno:c2016198和cctccno:c2016210的杂交瘤细胞株分别产生的单克隆抗体能够结合突变型hbsag突变位点包括：突变在112、120、129、130、131、132、133、134位，g112n、p120s、q129l、g130k、t131n、s134f、m133s、y134n突变在116位，t116n突变在116和133位，t116n和m133t突变在116位，嵌入116t突变在118位，t118a突变在126位，t126a突变在129位，q129r突变在129位，q129h突变在130位，g130r突变在130和133，g130n和m133t突变在133位和134位，m133t和f134l突变在133位和134位，m133l和f134l突变在134位，f134l突变在134位，y134n突变在143位，s143l突变在144位，d144e突变在145位，g145a。有益效果本发明提供了能够与乙肝表面抗原结合的抗体，能够与野生型乙肝表面抗原或突变型的乙肝表面抗原结合，具有广泛的结合能力，可以有效降低假阴性检测结果，提高对乙肝肝炎病毒检测的准确性。附图说明图1为抗原效价测定示意图。具体实施方式实施例1：.制备杂交瘤细胞株(保藏编号分别为cctccno:c2016198和cctccno:c2016210)1.1免疫动物动物准备：用于制备杂交瘤细胞的免疫动物无特殊限制，可使用小鼠、大鼠、仓鼠、兔，balb/c小鼠作为免疫接种对象。本实施例选用6-8周龄雌性balb/c小鼠(购自上海动物中心)，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。1.2抗原准备hbsag抗原两种(外购自mpbiomedicalsasiapacificpteltd)血清型分别为adr和ay，adr为大肠杆菌表达的重组蛋白，ay为hbv感染者生物样本中纯化获得)1.3免疫方案特定抗原的免疫原性受到多种因素的影响，但是用佐剂可增强免疫原性。常用的免疫佐剂就是弗氏佐剂。初次免疫使用的为弗氏完全佐剂，加强免疫使用的是弗氏不完全佐剂。典型的免疫方案依赖于抗原的反复刺激，以增强特异性免疫应答并使其成熟。hbsag两种抗原(adr和ay)10-100μg用弗氏完全佐剂乳化。等体积的抗原和弗氏完全佐剂在一起乳化成浓稠的乳剂，给小鼠、大鼠或者仓鼠多点皮下注射(总量0.5-1.0ml)。10-14天后，经过初次免疫应答，产生弱抗体反应。第一次加强免疫(即第二次注射抗原)使用的是弗氏不完全佐剂。抗原和弗氏不完全佐剂的乳化物也是皮下多点注射。为了扩增抗原反应性b细胞的数量，需要进行多次加强免疫。第二次加强免疫后8-10天，收集动物血清，进行elisa效价检测。血清效价分别在adr和ay上均大于1：40000后，可进行细胞融合前的终免疫。终免疫3-5天，就可进行细胞融合。1.4细胞融合1.4.1免疫b细胞的制备将免疫好的动物处死，无菌操作下取出脾脏或者淋巴结。无血清培养基清洗，去除多余的组织，加入无血清dmem培养液，研磨，离心，获得抗原反应性分泌型免疫细胞，用无血清培养基洗涤重悬待用。1.4.2培养基和骨髓瘤细胞制备采用添加10％胎牛血清的高糖dmem培养基培养骨髓瘤细胞，饲养细胞的制备小鼠处死后，浸泡于75％的酒精中消毒5min，撕开小鼠腹部皮肤，保留腹膜，用无菌注射器注入5ml37℃预热的dmem无血清培养基(此过程不能刺破内脏)，轻柔小鼠腹腔，悬浮腹腔细胞，吸出腹腔液。离心后用15％胎牛血清dmem的培养液重悬。脾细胞制备处死加强免疫后的小鼠，无菌分离出脾脏，75％酒精洗涤，再用无血清dmem培养液淋洗，置于筛网上研碎，将脾细胞中冲入无菌离心管，离心后用无血清dmem培养液重悬，计数。1.4.3细胞融合和铺板在细胞融合前，将免疫淋巴细胞与骨髓瘤细胞按照一定比例混合。抗原反应性分泌型免疫细胞与骨髓瘤细胞混合的比例是5：1-10：1。混合细胞离心后轻轻去掉上清，并把细胞沉淀打散，置于37℃水浴中。在1分钟内边混合边逐滴加入1ml50％peg(分子量1000至4000).然后继续混合，在2分钟内加入2ml预热的dmem。4分钟内边混合边加入另外8ml完全培养基。离心后，弃上清，加入完全培养基轻轻混匀，铺入预先加好饲养细胞的96孔细胞培养板中。每个孔100微升。37℃5％co2培养过夜后加入50μl5×hat。融合后第5天开始，细胞培养板每周要换液3次。补入100-150微升含1×hat的新鲜完全培养基(10％fbs)。融合后7-10天，观察到大多数细胞培养孔都显示细胞生长旺盛(16倍物镜，10倍目镜下观察，细胞大小占满1/3视野为宜)，取细胞培养上清就行elisa筛选。1.5酶联免疫吸附剂测定(elisa)筛选adr和ay型的hbsag抗原分别使用0.01mpbs(ph7.4)稀释成0.5μg/ml的溶液。然后把稀释好的抗原溶液加入到96孔酶标板中，每孔100μl。4℃包被过夜。然后取出，使用pbst洗涤溶液(pbs溶液加入吐温200.05％)洗涤包被好的酶标板3次。然后加入封闭溶液(pbs溶液加入1％bsa)，每孔200μl。37℃封闭30分钟。取出后，弃封闭液，备用。取可进行筛选的细胞上清加入到封闭好的elisa板中，每孔100μl，37℃反应30分钟。取出后pbst洗涤溶液洗涤3次，然后加入hrp标记的羊抗鼠igg二抗，每孔100μl。37℃反应30分钟。取出后，pbst洗涤溶液洗涤5次。然后加入tmb显色，每孔100μl，室温遮光反应10分钟，然后加入终止液(2mh2so4)100μl，450nm读数。1.6亚克隆和细胞冻存把elisa筛选在两种亚型抗原(adr和ay)上阳性的初始孔中的细胞，通过有限稀释法进行亚克隆。亚克隆用的96孔细胞培养板，需要预先添加饲养细胞或者条件培养基以提供生长所需的生长因子。原始的阳性克隆需要经过多次的亚克隆，才能形成稳定分泌抗体的细胞系。因为一些细胞克隆，在亚克隆的持续培养过程中，可能会转为阴性及不分泌抗体。在亚克隆的过程中，随时使用elisa方法进行筛选检测，以剔除不稳定分泌抗体的细胞系。一旦单克隆的杂交瘤细胞系确立，那么就应该冻存并建库。把单克隆的细胞扩大培养，使细胞密度维持在1×105-1×106个细胞/ml。冻存前，杂交瘤细胞应处于对数生长期。离心收集细胞，用已过滤除菌并预冷到4℃的含10％dmso的培养基重悬细胞沉淀，并调整细胞浓度为5×106个细胞/ml。将装有1ml细胞悬液(5×106个细胞)的冻存管现在-70℃冻存数天，然后转移到液氮中长期储存。1.7把elisa筛选出的阳性细胞通过有限稀释法进行亚克隆，获得稳定的细胞系cctccno：c2016198，该细胞系分泌获得的抗体为杂交瘤细胞株15g6e1。此外，还获得稳定的细胞系cctccno：c2016210,该细胞系分泌获得抗体为杂交瘤细胞株5c7。实施例2.单克隆抗体的大量生产利用杂交瘤细胞大量生产单克隆抗体，主要有体内和体外培养两种方法。体外培养杂交瘤细胞成本较高，不使用实验动物。目前通常采用的是体内法制备单克隆抗体。及把杂交瘤细胞注射到预先致敏的balb/c小鼠腹腔内。体内制备单克隆抗体腹水的阶段如下：(1)液体石蜡预致敏小鼠：注射液体石蜡的体积通常为0.5ml。(2)杂交瘤细胞的注射：注射液体石蜡和杂交瘤细胞之间的间隔在7-20天是最佳的，注射杂交瘤细胞的数量为0.5×106-2×106最佳。通常在注射杂交瘤细胞后的7-10天小鼠腹水即可形成。腹水的收集：利用口径够大的针筒穿刺腹腔，通过重力进行腹水引流从而获得腹水。7天内每只小鼠最多行三次穿刺以收获腹水，并于最后一次收集后处死。收集的腹水1500g离心腹水10分钟，弃沉淀并移除腹水中的细胞和凝块。-20℃或-70℃冷冻保存。实施例3.单克隆抗体的纯化、鉴定和在检测试纸盒上的应用3.1单克隆抗体的纯化从腹水中纯化单克隆抗体方法跟纯化免疫球蛋白方法基本一样。利用盐沉淀方法、分子筛等均可。如果抗体是鼠igg还可使用亲和纯化方法如：proteina、proteing。本发明中的抗体15g6e1和5c7使用的是proteina纯化。腹水和上样缓冲液等体积混合后，过已经用上样缓冲液平衡好的proteina柱上样。上样完毕后，用0.01mpbs溶液洗脱杂蛋白，测定流出液的od280＜0.03时停止洗脱。再用洗脱液洗脱目的抗体，收集流出液。收集时，滴加盐酸溶液，调整抗体溶液ph至7-9。测定流出液od280≤0.1时停止收集。透析，离心，浓缩溶液至需要浓度即为所需单克隆抗体，-20℃冻存。3.2单克隆抗体的鉴定3.2.1单克隆抗体亚型鉴定使用小鼠亚型鉴定试剂盒(thermo，prod#37503)鉴定抗体15g6e1和5c7的亚型，结果如下表所示。抗体亚型15g6e1igg1κ5c7igg1κ单克隆抗体属于igg1亚型，轻链是kappa链。此外，抗原效价的测定如图1所示。3.2.2抗体效价鉴定使用elisa方法(如1.5)测定两个抗体15g6e1和5c7分别在hbsag两个抗原adr和ay上的效价为：3.3在野生型和突变型抗原上的结合情况(在检测试剂盒中的应用)应用在试剂盒检测上，主要应用于免疫层析法检测乙肝表面抗原hbsag，检测试剂盒包括样本垫、标记垫、检测垫和吸收垫，还可能包括支撑物，样本垫、标记垫、检测垫和吸收垫依次搭接黏贴在支撑物上，检测垫上顺着样本流动上游喷涂有检测线区，下游喷涂有对照线区，检测线区包被有能够与乙肝表面抗原结合的抗体，对照线区包被有羊抗鼠igg，标记垫上喷涂有标记有胶体金或有色乳胶颗粒的检测抗体。5c7(细胞系cctccno:c2016210生产)作为捕获抗体，15g6e1(细胞系cctccno:c2016198生产)作为标记抗体，对照抗体1、2、3和4均采购自fitzgerald，与野生型和突变型抗原上结合情况如下：表格中“+”表示检测结果为阳性，“-”表示检测结果为阴性。sequencelisting<110>艾博生物医药（杭州）有限公司<120>抗乙肝表面抗原的单抗隆抗体的制备和筛选<130><160>1<170>patentinversion3.5<210>1<211>226<212>prt<213>人工序列<400>1metgluasnilethrserglypheleuglyproleuleuvalleu15glnalaglyphepheleuleuthrargileleuthrileprogln30serleuaspsertrptrpthrserleuasnpheleuglyglythr45thrvalcysleuglyglnasnserglnserprothrserasnhis60serprothrsercysproprothrcysproglytyrargtrpmet75cysleuargargpheileilepheleupheileleuleuleucys90leuilepheleuleuvalleuleuasptyrglnglymetleupro105valcysproleuileproglyserserthrthrserthrglypro120cysargthrcysthrthrproalaglnglythrsermettyrpro135sercyscyscysthrlysproseraspglyasncysthrcysile150proileprosersertrpalapheglylyspheleutrpglutrp165alaseralaargphesertrpleuserleuleuvalpropheval180glntrpphevalglyleuserprothrvaltrpleuservalile195trpmetmettrptyrtrpglyproserleutyrserileleuser210propheleuproleuleuproilephephecysleutrpvaltyr225ile当前第1页12