本发明属于细胞治疗
技术领域：
，具体涉及一种能高效分泌bfgf的人脐带间充质干细胞的制备方法及其应用，尤其是一种复合人白介素-2(interleukin-2,il-2)信号肽的分泌型高效表达人碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)蛋白的临床级人脐带间充质干细胞的制备方法及其在神经损伤修复中的应用。
背景技术：
：神经损伤分为中枢神经系统损伤和外周神经系统损伤，其中中枢神经系统损伤会造成脊髓损伤等运动功能方面的障碍，而外周神经系统损伤会带来感觉障碍还有慢性疼痛，同样会给机体带来困扰，严重影响生活质量。目前，神经损伤方面的疾病并没有很好的治疗手段，神经损伤的修复和再生一直是至今尚未解决的难题之一，因此，损伤神经的合理修复、再生轴突快速生长、相应靶器官有效再支配一直是神经外科领域的研究热点，而单纯的应用生物蛋白因子的局限性，已经不能够满足当今人们对损伤后的恢复情况的要求，所以新的治疗方法仍然需要更进一步的探索。中枢系统疾病分为脑损伤和脊髓损伤，其中最常见的例如创伤性脊髓损伤(sci)可以导致运动、感觉和自主功能障碍，这些导致的伤害对个人而言，在社会和经济上都是毁灭性的。此外，许多患有脊髓损伤的患者都需要广泛的医疗针对于受伤所引起的复杂性和继发性伤害。脊髓损伤通常会导致神经功能的缺陷和残疾，不仅会引起感觉和运动功能的损失(截瘫或四肢瘫痪)，还有许多其他常见的继发性问题，例如膀胱的频发感染，肾和肠道问题，心脏和呼吸功能障碍，所有这些问题都对脊髓损伤患者的生理、心理和社会行为产生了很大的影响。因此，我们迫切需要治疗可以专门针对脊髓损伤疾病的策略。到目前为止，还没有有效的和值得信赖的针对于脊髓损伤患者的临床治疗，一般的治疗方法就是手术介入治疗和药物介入治疗。通常医生所做的外科手术是使得脊柱稳定和减轻压力并联合使用高剂量的甲泼尼龙(mp)治疗。但是，手术和甲泼尼龙的治疗一直备受争议，因为这两种治疗手段并没有带来真正有益的影响。外周神经完全损伤后，手术缝合往往对神经功能的恢复有限，外周神经损伤是常见的外伤，各种创伤所导致的外周神经损伤发生率约为1.3～2.8％，尽管在神经损伤后，神经在一定程度上能通过再生、重建达到功能的恢复。在外周神经损伤后，会发生神经轴突终端、神经传导功能障碍、神经断裂等，并伴随神经内水肿，损害的远端出现瓦勒氏变性等一系列的病理性改变。由此，其带给患者巨大的痛苦和经济负担。由于传统的治疗手段对于神经损伤的治疗具有缺陷性，现今还有许多其他的途径用来治疗神经损伤，例如细胞治疗手段、分子治疗手段和组合治疗手段，其中细胞治疗包括神经干细胞、间充质干细胞、嗅鞘细胞、施万细胞核激活的巨噬细胞等。干细胞(stemcell)是一种具有趋向性、自我更新和多向分化潜能的多功能细胞。长年以来，人们认为成年哺乳动物脑内的神经细胞不具有更新能力，一旦神经细胞受损或者死亡，就没有办法再生。这种观点对于神经系统的疾病例如脊髓损伤的治疗都受到了很大的限制。间充质干细胞(mscs)是一种实用的组织修复种子细胞，优点在于其能够抑制t细胞活化，减轻炎症反应；其次，具有旁分泌作用，例如分泌神经生长因子和神经营养因子；另外，间充质干细胞可以作为替代、填充作用，抑制伤口处瘢痕生成等，在神经损伤中，间充质干细胞也可以使得轴突再生及重建神经通路。尤其是脐带来源的间充质干细胞，与骨髓相比具有更多的优势，其取材方便，更容易获得，增殖分化能力优于骨髓mscs，而且免疫原性比骨髓mscs低，可用于异体移植[1]。碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor，bfgf)最初是gospodarowiz于1974年从牛脑和牛的脑垂体中提取出的。bfgf共有四种形式，以aug为起始密码的相对分子质量为18kd和以cug为起始密码的相对分子质量分别为22kd、22.5kd和24kd。通常人们把cug起始密码的三种形式统称为高分子量bfgf(highmolecularweight，hmw3)，其主要存在于细胞核内，刺激细胞生长；从aug起始密码的为低分子量bfgf(lowmolecularweight，lmw)，其主要分布于细胞浆中，刺激细胞迁移。相对分子质量为18kd的bfgf是其主要活性形式。作为神经肽物质，bfgf在胚胎发育、血管生成、伤口中的愈合、在生物体内的神经生长发育系统起着重要的作用，是近年来经常研究的一种新型的神经营养因子。而且，bfgf不仅在体外对培养的各种神经元有营养作用，也可以促进体内损伤的外周神经的再生，这点已被研究所证实。bfgf作为目前研究较多的一种的神经保护因子，已经有大量的研究证实bfgf对脊髓损伤的再生和修复具有重要作用，并且在脊髓损伤早期所起作用更显著。bfgf对神经再生的促进作用表现在四个方面：(1)保护神经元；(2)促进神经胶质细胞分裂增殖；(3)促进神经纤维的再生；(4)促进血管发生、改善微循环。例如，有研究证实了在脊髓损伤后神经元的c-fosmrna的表达增加，而bfgf能够显著抑制脊髓损伤后后c-fos基因的表达，提示bfgf对神经元具有保护作用并且抑制了脊髓损伤带来的继发性伤害[2]。haenzi等发现sci后，早期连续注射外源性bfgf的可能在保护脊髓损伤中起重要作用，推动恢复运动功能[3]。此外，研究已经证明，脊髓损伤之后，bfgf的注射可以明显减少损伤区域的钙沉积，减少镁离子的减少，可以明显减轻脊髓损伤，增强了脊髓的恢复功能。但是由于bfgf对热和酸均不稳定，全身应用时在体内的半衰期很短，几分钟之后就会被快速灭活，所以难以发挥其有效作用；而且脊髓损伤患者不适宜长期局部穿刺用药。由于外源性的bfgf在体内容易被降解，且需要反复多次注射给药，容易使患者感染从而影响疗效，因此转基因技术联合干细胞治疗可以使得bfgf发挥其长期、高效的作用，在治疗脊髓损伤的过程中具有更大的生物学功能。采取转基因技术将bfgf转染进入细胞可以使得人脐带间充质干细胞在神经损伤中有更好的疗效，但是目前的这种现有技术存在两点不足：1.bfgf由于缺少信号肽的存在，所以在转染之后在人脐带间充质干细胞的细胞上清中分泌量较少，使得转基因技术不能发挥其最大的治疗效果；2.目前在治疗神经损伤上采取的转基因技术多数为腺病毒转染的方式，这种方式在临床上的应用缺少安全性，不能用于临床。现有技术中使用病毒转染的方式使得bfgf转染进入干细胞，不能保证bfgf的高效分泌，且病毒转染的方式并不能保证其安全性，无法在临床上使用，具有局限性。参考文献1.esmaelia,moshrefim,shamsaraa,etal.xeno-freecultureconditionforhumanbonemarrowandumbilicalcordmatrix-derivedmesenchymalstem/stromalcellsusinghumanumbilicalcordbloodserum[j].internationaljournalofreproductivebiomedicine,2016,14(9):567-576.2.刘文革,宋建榕,林佳俊.bfgf对大鼠脊髓损伤后c-fosmrna表达的影响effectofbfgfonc-fosmrnaexpressioninratsafterspinalcordinjury[j].中国矫形外科杂志,2000,7(12):1178-1180.3.haenzib,moonld.thefunctionoffgfr1signallinginthespinalcord:therapeuticapproachesusingfgfr1ligandsafterspinalcordinjury.[j].neuralplasticity,2017,2017(3-4):2740768.技术实现要素：针对现有技术的不足，本发明提供一种能高效分泌bfgf的人脐带间充质干细胞的制备方法及其应用，该间充质干细胞能高效分泌bfgf，为有效临床修复、治疗神经损伤患者提供新的选择。为解决上述问题，本发明提供一种能高效分泌bfgf的人脐带间充质干细胞的制备方法，具体步骤如下：1)从脐带分离间充质干细胞；2)构建重组表达载体pcmv3-il2-bfgf；3)将步骤1)所得间充质干细胞和步骤2)所得重组表达载体pcmv3-il2-bfgf用电转染方式获得能高效表达bfgf的间充质干细胞。进一步地，所述步骤1)中间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。进一步地，所述步骤1)的分离间充质干细胞的方法如下：取离体的间充质干细胞，将其清洗、剔除血管后剪碎，培养；去除组织块，继续培养，待细胞长至80％-90％融合时传代，待用。更进一步地，所述间充质干细胞传代至第2～3代处于对数期生长，生长至70～80％汇合时，待用。进一步地，所述步骤2)中，重组表达载体pcmv3-il2-bfgf的构建过程如下：a)以质粒pcmv3-bfgf为模板，pcr扩增得到il2-bfgf质粒；b)质粒pcmv3-bfgf经限制性内切酶kpni和xbai双酶切，电泳回收pcmv3片段；c)将il2-bfgf质粒和pcmv3片段进行连接，连接产物经转化、筛选得到重组表达载体pcmv3-il2-bfgf。更进一步地，所述步骤a)中pcr扩增的引物对如下：引物1cggggtaccatgtacaggatgcaactcct引物2ctagtctagatcagctcttagcagacatggpcr体系：depc水、10×taqbuffer、mgcl2、10mdntpmix、引物1、引物2、tap酶、模板pcmv3-bfgf；pcr仪器扩增循环参数设置：预变性94℃×5min；变性94℃×1min，退火60℃×60s，延伸72℃×60s，循环40次；终延伸72℃×7min；4℃保存。更进一步地，步骤b)酶切条件如下：pcmv3-bfgf5μg；10u/μl的kpni5μl；10u/μl的xbai5μl；酶切缓冲液10μl；ddh2oupto100μl。更进一步地，步骤c)连接体系如下：il2-bfgf质粒：5ul；pcmv3片段：1ul；t4连接酶：1ul；ddh2o：3ul；16℃连接过夜。更进一步地，所述重组表达载体pcmv3-il2-bfgf的核苷酸序列如seqidno.1所示。进一步地，所述步骤3)中电转染方式的条件如下：步骤1)所得间充质干细胞0.6×107个，步骤2)所得重组表达载体pcmv3-il2-bfgf13μg，脉冲电压250ppv，驱动电压20pdv，脉冲时间10ms，循环次数20。进一步地，所述步骤3)中，电转染后所得产物进一步经药物筛选、培养获得能高效表达bfgf的间充质干细胞。更进一步地，所述培养的条件为：37℃，5％co2，培养24小时。更进一步地，所述药物筛选的药物为100μg/mlhygromycin。另一方面，本发明制备的能高效表达bfgf的间充质干细胞在制备干细胞治疗药物中的用途。进一步地，所述干细胞治疗包括神经损伤后的干细胞治疗。进一步地，所述神经损伤包括中枢神经系统损伤和外周神经系统损伤。更进一步地，所述中枢神经损伤包括脑损伤或脊髓损伤。更进一步地，所述外周神经系统损伤包括慢性疼痛等。一方面，本发明提供一种治疗神经损伤的药物，其主要活性成分包括采用本发明的方法制备的高效分泌bfgf的脐带间充质干细胞。另一方面，用于制备本发明所述的能高效表达bfgf的间充质干细胞的重组表达载体pcmv3-il2-bfgf，具有如seqidno.1所示的核苷酸序列。本发明制备的重组表达载体pcmv3-il2-bfgf能有效分泌bfgf蛋白，可使bfgf蛋白能够穿透细胞膜，分泌于细胞上清中。本发明具有如下有益效果：本发明提供一种能高效分泌bfgf的人脐带间充质干细胞的制备方法及其应用，本发明将在bfgf的n端加上il2的信号片段的重组表达载体通过电转染法转染人脐带间充质干细胞制备能高效分泌bfgf的人脐带间充质干细胞，能有效增强治疗效果。制备的人脐带间充质干细胞中的重组表达载体携带的il2信号片段使得bfgf能够成功地穿透细胞膜，分泌于细胞上清，为有效临床治疗中枢神经损伤患者提供新的选择。本发明采用的人脐带间充质干细胞取材方便，且能够大量扩增，能得到临床应用所需的细胞量级。相比骨髓间充质干细胞，人脐带间充质干细胞取材创伤性小，在临床应用前景更大，且采用电转染的方式，相对病毒转染方法，更便捷简单、安全高效。本发明为神经损伤，例如创伤性脊髓损伤的治疗提供很好的应用前景，也提供新的选择。本发明制备的高效分泌bfgf的人脐带间充质干细胞在体内具有向炎症或损伤部位迁移的特性，高效表达bfgf的间充质干细胞是很好的因子运输工具，能使损伤部位保持较高的因子浓度，克服单纯bfgf治疗用量大、代谢快的缺点。附图说明图1电转染后的脐带来源间充质干细胞的形态。图2流式细胞术检测本发明中电转染后的高分泌bfgf的脐带来源间充质干细胞表面分子标记图。图3elisa法检测细胞上清中bfgf的分泌水平图4脊髓损伤造模图5bms评分，移植后4周il2-bfgf-mscs组bms主评分提高，与cellcontrol组相比，**p<0.01，具有有统计学意义。图6脊髓切片观察结果，a)细胞对照组dapi/gfap/neurofilament；b)il2-bfgf-mscs组dapi/gfap/neurofilament。其中，gfap为胶质细胞的标志物，neurofilament为神经纤维的标志物。与细胞对照组相比，il2-bfgf-mscs组脊髓损伤部位的损伤部位明显减少,具有很好的修复效果。图7流式细胞术检测本发明中电转染后的高分泌bfgf的脐带来源间充质干细胞的细胞周期图。具体实施方式下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实验所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下通过实施例对本发明进行更进一步的详细说明。实施例11)干细胞制备过程：将脐带剪成2cm左右的小段，用dpbs洗至无血液存在，剔除脐带中的3根血管(动脉和静脉)。剔除血管后的脐带用眼科剪剪碎成大约1mm3的细小组织块，组织剪碎直接贴至t75培养瓶中倒置，再正置培养瓶，加入人间充质干细胞培养基(具体培养基为dmem-lg+10％qualtiedmscfbs+1％penicillin-streptomycin)(不要没过组织块)，培养条件为37℃无菌环境纯净空气条件，5％二氧化碳。2周左右会有细胞爬出，会形成集落cfu-f，轻轻拍打培养瓶，使组织块脱落，弃之，用ctstmdpbs轻轻洗细胞表面，换新鲜的人间充质干细胞培养基(具体培养基为dmem-lg+10％qualtiedmscfbs+1％penicillin-streptomycin)，放置培养箱继续培养，培养条件为37℃，5％co2培养箱中静置培养。待细胞长至80％-90％融合时传代。传代过程及条件如下：37℃预热人间充质干细胞培养基和tryple，弃掉旧培养液，加入室温放置的dpbs洗一遍，尽可能将残留的培养液洗净，吸去dpbs，加入tryple，37℃孵育消化，倒置显微镜下观察到细胞变圆、漂起，可加等量人间充质干细胞培养基，轻柔吹打细胞，收集细胞悬液至15ml/50ml离心管中，室温1200r/min离心5min，弃上清，加入人间充质干细胞培养基细胞培养液重悬细胞，轻柔吹打均匀，接种，置于37℃，5％co2培养箱中静置培养。所得人间充质干细胞经过严格的质量控制与安全性评价体系的检测。2)重组表达载体pcmv3-il2-bfgf的制备过程：a)将原有质粒pcmv3-bfgf用限制性内切酶kpni和xbai双酶切，37℃水浴4h，琼脂糖电泳检测双酶切产物结果，进行回收载体片段pcmv3(大小为6.1kb)b)以原有质粒pcmv3-bfgf为模板，pcr扩增引物1il-bfgf-5cggggtaccatgtacaggatgcaactcct引物2il-bfgf-3ctagtctagatcagctcttagcagacatggpcr体系：depc水、10×taqbuffer、mgcl2、10mdntpmix、引物1、引物2、tap酶、模板pcmv3-bfgf。pcr仪器扩增循环参数设置：预变性94℃×5min；变性94℃×1min，退火60℃×60s，延伸72℃×60s，循环40次；终延伸72℃×7min；4℃保存。扩增得到含有il2信号肽的bfgf段质粒，再利用kpni和xbai酶切位点将il2-bfgf部分连接于pcmv3载体上，连接反应体系如下：pcr产物：5ulpcmv3片段：1ult4连接酶：1ulddh2o：3ul16℃连接过夜用连接产物进行转化，转化过程如下：①取出冻存的感受态离心管放置于冰上融化；②将10μl的连接产物加入到感受态中，用移液枪混匀并在冰上放置30min；③在42℃热激90s，再迅速放回冰上冷却3min；④加入1ml的lb培养液，在37℃的摇床中孵育45min；⑤用涂布棒将菌液均匀涂布在配置好的含有抗生素的lb平板上；⑥在37℃培养箱正置半小时左右，之后倒置培养16h，直至长出肉眼可见菌落时挑取单克隆进行培养并且提取质粒鉴定。将质粒送去公司测序，筛选出正确连接的质粒。得到的重组表达载体pcmv3-il2-bfgf，表达框构架为：从5’到3’方向依次为cmv3启动子、人il2蛋白信号肽的编码序列、编码人bfgf蛋白的基因。重组表达载体pcmv3-il2-bfgf序列如seqidno.1:gacggatcgggagatctcccgatcccctatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttgcgctgcttcgcgagtacatttatattggctcatgtccaatatgaccgccatgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtccgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttacgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacaccaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaataaccccgccccgttgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcctcactctcttccgcatcgctgtctgcgagggccagctgttgggctcgcggttgaggacaaactcttcgcggtctttccagtactcttggatcggaaacccgtcggcctccgaacggtactccgccaccgagggacctgagcgagtccgcatcgaccggatcggaaaacctctcgagaaaggcgtctaaccagtcacagtcgcaaggtaggctgagcaccgtggcgggcggcagcgggtggcggtcggggttgtttctggcggaggtgctgctgatgatgtaattaaagtaggcggtcttgagacggcggatggtcgaggtgaggtgtgggtttagtgaaccgtcagatcctcactctcttccgcatcgctgtctgcgagggccagctgtcaggcttgagatccagctgttggggtgagtactccctctcaaaagcgggcattacttctgcgctaagattgtcagtttccaaaaacgaggaggatttgatattcacctggcccgatctggccatacacttgagtgacaatgacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccaggtccaagtttaaactttaatacgactcactataggggccgccaccaagcttggtaccatgtacaggatgcaactcctgtcttgcattgcactaagtcttgcacttgtcacaaacagtatggcagctgggagcatcaccaccctgcctgccttgcctgaggatggaggctctggagcctttccaccaggccacttcaaggaccccaagaggctgtactgcaagaatggtggcttcttcctgaggatccacccagatggcagagtggatggtgtcagggagaagagtgaccctcacatcaagctccagctccaagcagaagagagaggagttgtgtccatcaaaggagtgtgtgccaacaggtatctggccatgaaggaagatggcagactgctggcttccaagtgtgtcacagatgagtgcttcttctttgagaggttggaatctaataactacaacacttacaggtcaaggaagtacaccagttggtatgtggcactcaaaagaactgggcagtataaacttggctccaaaacaggacctggacagaaggctattctctttctgcccatgtctgctaagagctgactcgagtctagagcggccgccgaattcgggcccgtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaaagaaccagctggggctctagggggtatccccacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattaattctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggc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方法及其应用<130>2018<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>6642<212>dna<213>人工(1)<400>1gacggatcgggagatctcccgatcccctatggtgcactctcagtacaatctgctctgatg60ccgcatagttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcg120cgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgc180ttagggttaggcgttttgcgctgcttcgcgagtacatttatattggctcatgtccaatat240gaccgccatgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcat300tagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctg360gctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaa420cgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccact480tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtccgccccctattgacgtcaatgacggta540aatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttacgggactttcctacttggcagt600acatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacaccaatg660ggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatg720ggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaataaccccgccc780cgttgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtt840tagtgaaccgtcagatcctcactctcttccgcatcgctgtctgcgagggccagctgttgg900gctcgcggttgaggacaaactcttcgcggtctttccagtactcttggatcggaaacccgt960cggcctccgaacggtactccgccaccgagggacctgagcgagtccgcatcgaccggatcg1020gaaaacctctcgagaaaggcgtctaaccagtcacagtcgcaaggtaggctgagcaccgtg1080gcgggcggcagcgggtggcggtcggggttgtttctggcggaggtgctgctgatgatgtaa1140ttaaagtaggcggtcttgagacggcggatggtcgaggtgaggtgtgggtttagtgaaccg1200tcagatcctcactctcttccgcatcgctgtctgcgagggccagctgtcaggcttgagatc1260cagctgttggggtgagtactccctctcaaaagcgggcattacttctgcgctaagattgtc1320agtttccaaaaacgaggaggatttgatattcacctggcccgatctggccatacacttgag1380tgacaatgacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccaggtccaagttta1440aactttaatacgactcactataggggccgccaccaagcttggtaccatgtacaggatgca1500actcctgtcttgcattgcactaagtcttgcacttgtcacaaacagtatggcagctgggag1560catcaccaccctgcctgccttgcctgaggatggaggctctggagcctttccaccaggcca1620cttcaaggaccccaagaggctgtactgcaagaatggtggcttcttcctgaggatccaccc1680agatggcagagtggatggtgtcagggagaagagtgaccctcacatcaagctccagctcca1740agcagaagagagaggagttgtgtccatcaaaggagtgtgtgccaacaggtatctggccat1800gaaggaagatggcagactgctggcttccaagtgtgtcacagatgagtgcttcttctttga1860gaggttggaatctaataactacaacacttacaggtcaaggaagtacaccagttggtatgt1920ggcactcaaaagaactgggcagtataaacttggctccaaaacaggacctggacagaaggc1980tattctctttctgcccatgtctgctaagagctgactcgagtctagagcggccgccgaatt2040cgggcccgtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgt2100tgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttc2160ctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctgggggg2220tggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctgggga2280tgcggtgggctctatggcttctgaggcggaaagaaccagctggggctctagggggtatcc2340ccacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgac2400cgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgc2460cacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatt2520tagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgg2580gccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatag2640tggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgattt2700ataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatt2760taacgcgaattaattctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctcc2820ccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaag2880tccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaacc2940atagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattct3000ccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctctgcctct3060gagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagctc3120ccgggagcttgtatatccattttcggatctgatcagcacgtgatgaaaaagcctgaactc3180accgcgacgtctgtcgagaagtttctgatcgaaaagttcgacagcgtctccgacctgatg3240cagctctcggagggcgaagaatctcgtgctttcagcttcgatgtaggagggcgtggatat3300gtcctgcgggtaaatagctgcgccgatggtttctacaaagatcgttatgtttatcggcac3360tttgcatcggccgcgctcccgattccggaagtgcttgacattggggaattcagcgagagc3420ctgacctattgcatctcccgccgtgcacagggtgtcacgttgcaagacctgcctgaaacc3480gaactgcccgctgttctgcagccggtcgcggaggccatggatgcgatcgctgcggccgat3540cttagccagacgagcgggttcggcccattcggaccgcaaggaatcggtcaatacactaca3600tggcgtgatttcatatgcgcgattgctgatccccatgtgtatcactggcaaactgtgatg3660gacgacaccgtcagtgcgtccgtcgcgcaggctctcgatgagctgatgctttgggccgag3720gactgccccgaagtccggcacctcgtgcacgcggatttcggctccaacaatgtcctgacg3780gacaatggccgcataacagcggtcattgactggagcgaggcgatgttcggggattcccaa3840tacgaggtcgccaacatcttcttctggaggccgtggttggcttgtatggagcagcagacg3900cgctacttcgagcggaggcatccggagcttgcaggatcgccgcggctccgggcgtatatg3960ctccgcattggtcttgaccaactctatcagagcttggttgacggcaatttcgatgatgca4020gcttgggcgcagggtcgatgcgacgcaatcgtccgatccggagccgggactgtcgggcgt4080acacaaatcgcccgcagaagcgcggccgtctggaccgatggctgtgtagaagtactcgcc4140gatagtggaaaccgacgccccagcactcgtccgagggcaaaggaatagcacgtgctacga4200gatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggac4260gccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccaccccaac4320ttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaat4380aaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttat4440catgtctgtataccgtcgacctctagctagagcttggcgtaatcatggtcatagctgttt4500cctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaag4560tgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactg4620cc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