一种防治苹果树真菌性病害的生防菌剂的制备方法与流程

本发明涉及生物菌剂技术领域，具体涉及一种防治苹果树真菌性病害的生防菌剂的制备方法。

背景技术：

在苹果树的生长过程中，常见苹果树真菌性病害主要有苹果炭疽叶枯病、苹果斑点落叶病、苹果腐烂病、苹果疫腐病等。其中，苹果炭疽叶枯病(glomerellaleafspot)是近些年来流行的一种新病害，病虫害防控研究室的曹克强教授及其课题组发现，在我国2009年以来每到7月份陆续有果农反应疑似苹果炭疽叶枯病的发生并且危害严重。该病主要发现在嘎拉、金冠、秦冠和乔纳金等品种上。青岛农业大学李保华教授课题组对病菌进行分离、培养和鉴定，确定该病是由炭疽菌引起的，称为炭疽叶枯病菌(glomerellacingulata)。该病属于苹果树叶部真菌性病害，病害初期叶片出现边缘暗褐色的近圆形病斑，遇高温高湿环境时最终可导致叶片变黑、呈焦枯状，随后脱落。果实也会感染此病，果实上形成近圆形坏死斑。

目前对该病的防治主要是以化学农药在初侵染前喷药保护为主，生物防控方法只有检索到朱学明研究的内生放线菌a-1可诱导苹果树对炭疽叶枯病的抗性，防效达70.42％。由于该病在我国最近几年才开始流行，所以对该病的防治技术还不成熟，目前是以防为主，治疗效果不好。

例如文章“几种药剂对苹果炭疽叶枯病的防控效果”，宋梁栋，王雪莲，豆粉婷，何艳维，陕西农业科学2016，62(11):46－48，公开了试验选用了5种药剂，在嘎拉苹果园进行苹果炭疽叶枯病的防控，结果表明：25％阿米西达(嘧菌酯)悬浮剂1000倍液会对苹果树产生药害，不宜在嘎拉苹果园使用；78％波尔·锰锌(科博)可湿性粉剂400倍液与80％代森锰锌(大生)可湿性粉剂500倍液，不仅对苹果炭疽叶枯病防效理想，并对其它几种落叶病也有很好的兼防作用，可以大面积推广应用。

例如文章“不同杀菌剂对苹果炭疽叶枯病的防治效果”，王冰，王彩霞，史祥鹏，等，植物保护，2014(6):176-180，公开了为了筛选出防治苹果炭疽叶枯病的有效杀菌剂，采用室外先接种后施药和先施药后接种的方法，测试了6种药剂的内吸治疗效果和8种药剂的保护效果。在病菌侵染后的72h内使用吡唑醚菌酯，或在病菌侵染后的24h内使用咪鲜胺对病斑的显症有一定的治疗效果。波尔多液在喷施后18d，对炭疽叶枯病菌侵染的抑制效果仍达50％，肟菌·戊唑醇、烯酰·吡唑酯和唑醚·代森联3种药剂在施药后的第11天，其保护效果与对照仍有显著差异，持效期达11d，代森锰锌、甲基硫菌灵、氢氧化铜和咪鲜胺4种保护剂的持效期只能维持6d。因此炭疽叶枯病的防治应以波尔多液为主，在施药后的第18天，只有波尔多液还有一定的保护效果，其他7种药剂都已完全失去保护效果。

化学药剂的喷洒势必会对果蔬的食品安全问题带来隐患，由于苹果是直接食用的食品，因此无法避免化学药剂残留在果体上以及化学药剂会随着植物的生长渗入到果体内，对食品安全造成严重的威胁。

另一个危害苹果树十分严重的叶部病害是苹果斑点落叶病，是一种由链格孢菌苹果专化型(alternariaalternataf.sp.mali)引起的真菌性病害，该病于50年代初在日本发现，随后70年代蔓延到中国，到了90年代在美国和欧洲也均有发现。苹果斑点落叶病的危害逐年上升，近年来在我国北京、山东、辽宁、河北等苹果产区发病十分严重。该病主要侵染苹果树新生叶片造成早期落叶，苹果斑点落叶病发病初期会出现直径为2-3mm褐色圆形病斑，之后病斑逐渐扩大成直径为5-6mm的红褐色病斑，边缘呈现紫褐色，中央常常会有同心轮纹出现，一般叶片上出现3-5个病斑就会引起病叶脱落。该病主要危害的苹果品种有红星、元帅、青香、富士等，近年来，对金冠、国光等苹果品种的危害有所上升。苹果斑点落叶病是真菌性病害，它可以在发病的落叶或者树上越冬，第二年春雨过后分生孢子会随着气流或者风雨继续传播，然后从气孔侵染叶片。

目前对苹果斑点落叶病进行防治，通常需要结合化学药剂防治，常用药剂主要有10％多抗霉素可湿性粉剂1000-1500倍液，25％戊唑醇(剑力通)可湿性粉剂3000-4000倍液等。代森锰锌和乙锰等药物对病害有一定的预防效果。目前生物防控方法的研究主要集中在芽孢杆菌上，如孙洋等通过果树叶片离体实验证明了枯草芽孢杆菌bs-315对苹果斑点落叶病有较好的抑制作用，傅学池等通过田间防病实验筛选到了芽孢杆菌防病菌株b-319(bacillusbrevis)和b-9108(bacilluscereus)，室内实验结合田间试验得出b-319和b-9108对斑点落叶病病情可减轻60％-70％。

又如申请号为201410697783.3的专利公开了“一种防治苹果树落叶病的增效农药组合物”，本发明公开了一种防治苹果树落叶病的增效农药组合物，包括质量配比为100:1～1:100的多效唑和戊唑醇。该发明提供的防治苹果树落叶病的增效农药组合物对苹果树落叶病防治有一定的增效作用，延缓抗性发展，延长药剂使用寿命。申请号为201610570867.x的专利公开了“盆栽苹果树斑点落叶病的防治方法”，该发明提供了一种盆栽苹果树斑点落叶病的防治方法，属于果树病虫害防治领域。该防治方法包括的步骤有：(1)中草药原料前处理；(2)盆栽苹果苗浸根处理；(3)培养土制备；(4)移栽；(5)浇灌。本发明的有益技术效果：本发明极大地降低盆栽苹果树的斑点落叶病发生，同时也能够降低盆栽苹果树斑点落叶病病菌产生抗药性程度。

同样地，化学药剂的喷洒势必会对果蔬的食品安全问题带来隐患，对食品安全造成严重的威胁。此外，化学药剂的定期使用，势必会使作物的病原菌产生抗药性，从而带来的即是化学药剂的过量使用或不同化学药剂的复配使用，进而对食品安全问题带来更大的隐患。同时，化学药剂对土壤、水源等环境带来的污染均是不可逆的。

与化学防治方法相比生物防治方法更具有优势，除了生物制剂生产容易，使用方便外，利用生防菌及其代谢产物制成的混合菌剂对环境更加友好，无污染无农药残留，符合我国可持续发展的战略要求。而且生防菌剂对环境变化敏感度小，效果稳定，这也是它的一大优势。目前，我国虽有意减少化学药剂的使用，但在防治苹果炭疽叶枯病和苹果斑点落叶病上化学药剂仍然是主要的防治手段，尤其是我国新爆发的苹果炭疽叶枯病，还没有有效的生防制剂，这使得针对苹果叶部病害的生防菌剂的开发尤为重要。

本专利提供了一种主要针对苹果炭疽叶枯病和苹果斑点落叶病的生防菌剂，在克服化学药剂带来的食品安全隐患、以及对病原菌产生抗药性、对环境产生污染等问题的同时，该菌剂不仅对以上这两种病害有显著的防治效果，而且对苹果树的其它病害以及果蔬病害的致病菌均有显著的抑菌效果，可将其应用于相应地果蔬病害的防治。

技术实现要素：

本发明解决的问题是克服上述利用化学药剂防治苹果树叶部病害方法的缺陷，提供一种具有防治苹果炭疽叶枯病、苹果斑点落叶病等苹果树叶部真菌性病害以及苹果树其他病害的生防菌——可可链霉菌(streptomycescacaoi)fn，利用可可链霉菌fn制备链霉菌生防菌剂应用于苹果树叶部病害的防治不仅可完全替代化学防治方法，排除食品安全隐患，而且在防治苹果树叶部病害的有效性和抑菌广谱性方面均得到突出的效果。与此同时该链霉菌具备广谱抑菌的特性，还可防治其他果蔬如黄瓜蔓枯病、黄瓜立枯病、番茄早疫病等病害。

由可可链霉菌fn制备的可可链霉菌fn生防菌剂的制备方法，具体如下：

孢子悬液制备：将无菌水加入保存有可可链霉菌fn的2216e固体培养基的斜面上，进而刮去孢子，震荡混匀，得到孢子悬液，所述孢子悬液的菌体浓度为10⁸-10⁹cfu/ml。

种子液培养：将所述孢子悬液按接种量1-3％(v/v)接种到种子液培养基中，28℃，160-240r/min，摇瓶培养90-100h，得到种子液。

优选地，种子液培养：将所述孢子悬液按接种量1-1.5％(v/v)接种到种子液培养基中，28℃，180-220r/min，摇瓶培养95-98h，得到种子液。

更优选地，种子液培养：将所述孢子悬液按接种量1％(v/v)接种到种子液培养基中，28℃，200r/min，摇瓶培养96h，得到种子液。

固体发酵培养：将所述种子液按接种量体积质量比5-15％(v/m)接种到含水量50％的固体发酵培养基中，28℃曲盘发酵培养3-6天。20-30℃风干，用粉碎机研磨，收集通过120目筛子的菌剂，于室温阴暗处储存,得到可可链霉菌fn生防菌剂，所述可可链霉菌fn生防菌剂的菌种活力不小于2×10¹¹cfu/g。

优选地，固体发酵培养：将所述种子液按接种量体积质量比8-12％(v/m)接种到含水量50％的固体发酵培养基中，28℃曲盘发酵培养3-5天，自发酵开始至结束，维持固体发酵培养基的恒定含水量：50％，发酵期间翻倒2-3次，待发酵结束，25-30℃风干，用粉碎机研磨，收集通过120目筛子的菌剂，于室温阴暗处储存，得到可可链霉菌fn生防菌剂，所述可可链霉菌fn生防菌剂的菌种活力不小于2×10¹¹cfu/g。

更优选地，固体发酵培养：将所述种子液按接种量体积质量比10％(v/m)接种到含水量50％的固体发酵培养基中，28℃曲盘发酵培养4天，自发酵开始至结束，维持固体发酵培养基的恒定含水量：50％，发酵期间翻倒3次，待发酵结束，28℃风干，用粉碎机研磨，收集通过120目筛子的菌剂，于室温阴暗处储存,得到可可链霉菌fn生防菌剂，所述可可链霉菌fn生防菌剂的菌种活力不小于2×10¹¹cfu/g。

所述2216e固体培养基(g/l)：细菌蛋白胨no.25、酵母粉1、琼脂20，余量为蒸馏水，ph自然；

所述种子液培养基(g/l)：玉米粉10，蛋白胨10，酵母粉5，磷酸氢二钾2，硫酸镁0.3，余量为蒸馏水，ph自然；

所述固体发酵培养基(％)(m/m)：稻壳20％，麸皮44.7％，玉米粉22％，豆饼粉12％，碳酸钙0.8％，磷酸氢二钾0.3％，硫酸镁0.2％，ph自然。

所述可可链霉菌fn生防菌剂对果蔬真菌性病害具有防治能力。

进一步地，所述可可链霉菌fn生防菌剂产品应用于防治果蔬真菌性病害。

进一步地，所述果蔬真菌性病害为苹果树真菌性病害。

进一步地，所述苹果树真菌性病害为苹果炭疽叶枯病、苹果斑点落叶病、苹果腐烂病、苹果根腐病、苹果轮纹病、苹果疫腐病。

进一步地，所述果蔬真菌性病害为黄瓜蔓枯病、黄瓜立枯病、番茄早疫病、西瓜枯萎病、油菜菌核病、白菜黑斑病。

所述可可链霉菌fn生防菌剂中的可可链霉菌fn具体为可可链霉菌(streptomycescacaoi)fn，保藏编号为cgmccno.13080。

所述可可链霉菌fn是从河北省抚宁县菜园土壤中分离得到。本发明所提供的可可链霉菌(streptomycescacaoi)fn已于2016年10月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)保藏，编号为cgmccno.13080，地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

所述可可链霉菌fn的16srdna序列见序列表seqidno.1。

所述可可链霉菌fn形态特征为：在2216e固体培养基上，菌丝生长良好，基内菌丝呈黄色，气生菌丝呈鼠灰色；在高氏合成一号琼脂培养基(isp1)上生长缓慢，基内菌丝呈浅黄色，气生菌丝呈浅灰色；在麦芽汁酵母膏琼脂培养基(isp2)上生长良好，基内菌丝呈黄色，气生菌丝呈鼠灰色；在燕麦粉琼脂培养基(isp3)，基内菌丝呈淡黄色，气生菌丝呈白色；在无机盐淀粉琼脂培养基(isp4)，基内菌丝呈黄色，气生菌丝呈淡灰色；在甘油天门冬素琼脂培养基(isp5)，基内菌丝呈淡黄色，气生菌丝呈白色；孢子丝呈螺旋形，孢子呈球形；

所述高氏合成一号琼脂培养基(isp1)组成为：可溶性淀粉20g/l，k2hpo40.5g/l，kno31g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，feso4·7h2o0.01g/l，琼脂20g/l，余量为蒸馏水，ph7.2-7.4；

所述麦芽汁酵母膏琼脂培养基(isp2)组成为：酵母粉4g/l，麦芽粉10g/l，葡萄糖4g/l，琼脂20g/l，余量为蒸馏水，ph7.2-7.3；

所述燕麦粉琼脂培养基(isp3)组成为：燕麦20g/l，微量盐溶液1ml/l，琼脂20g/l，余量为蒸馏水，ph7.2；

所述无机盐淀粉琼脂培养基(isp4)组成为：可溶性淀粉10g/l，k2hpo41g/l，mgso4·7h2o1g/l，nacl1g/l，(na4)2so42g/l，caco32g/l，微量盐溶液1ml/l，琼脂20g/l，余量为蒸馏水，ph7.0-7.4；

所述甘油天门冬素琼脂培养基(isp5)组成为：甘油10g/l，l-天冬酰胺1g/l，微量盐溶液1m/l，k2hpo41g/l，琼脂20g/l，余量为蒸馏水，ph自然；

其中所述微量盐溶液组成为：feso4·7h2o0.1g，mncl2·4h2o0.1g，znso4·7h2o0.1g，蒸馏水100ml，ph自然。

进一步地，所述可可链霉菌fn的生理生化特性为：明胶液化，淀粉水解强，牛奶不凝固，不产硫化氢，不产黑色素，不还原硝酸盐，可利用α-d-乳糖、肝糖、d-纤维二糖、甘氨酰-l-谷氨酸、丙酮酸甲酯、吐温40、吐温80、d-甘露醇、d,l-α-甘油、n-乙酰氨基-d-葡萄胺、d-氨基葡萄糖酸。

所述可可链霉菌fn可以抑制导致果蔬真菌性病害的致病菌。

进一步地，所述致病菌包括炭疽叶枯病菌、链格孢菌苹果专化型、贝伦格葡萄座腔菌、苹果黑腐皮壳菌、尖孢镰刀菌、恶疫霉、西瓜壳二孢、立枯丝核菌、茄链格孢菌、西瓜尖孢镰刀菌、核盘菌、芸薹链格孢等在内的多种致病菌的生长。

所述可可链霉菌fn对果蔬真菌性病害具有防治能力。

进一步地，所述果蔬真菌性病害为苹果树真菌性病害。

进一步地，所述苹果树真菌性病害包括苹果树叶部真菌性病害。

进一步地，所述苹果树叶部真菌性病害包括苹果炭疽叶枯病、苹果斑点落叶病。

进一步地，所述苹果树真菌性病害还包括苹果腐烂病、苹果根腐病、苹果轮纹病、苹果疫腐病。

进一步地，所述果蔬真菌性病害还包括黄瓜蔓枯病、黄瓜立枯病、番茄早疫病、西瓜枯萎病、油菜菌核病、白菜黑斑病。

所述可可链霉菌fn在防治果蔬真菌性病害中的应用。

进一步地，所述可可链霉菌fn在防治苹果树真菌性病害中的应用。

进一步地，所述可可链霉菌fn在防治苹果炭疽叶枯病、苹果斑点落叶病、苹果腐烂病、苹果根腐病、苹果轮纹病、苹果疫腐病中的应用。

进一步地，所述可可链霉菌fn在防治黄瓜蔓枯病、黄瓜立枯病、番茄早疫病、西瓜枯萎病、油菜菌核病、白菜黑斑病中的应用。

有益效果：

1、由可可链霉菌fn制备的生防菌剂对苹果斑点落叶病和苹果炭疽叶枯病均有显著的防治效果。

实际应用的田间试验表明，可可链霉菌fn生物防治菌剂在防治苹果斑点落叶上，当用量为稀释1000，3000，5000倍液时，其防治效果分别为：87.10％，85.58％，82.74％。在1％及5％差异水平上，可可链霉菌fn生物防治菌剂防治苹果斑点落叶病在用量为稀释1000倍液时的防治效果，优于其在用量为3000，5000倍液，且其稀释1000倍液时的防治效果显著高于对照药剂10％多抗霉素可湿性粉剂在用药量为稀释1000倍液和80％代森锰锌可湿性粉剂在用药量为稀释600倍液时的防治效果。

可可链霉菌fn生物防治菌剂在防治苹果炭疽叶枯上，当用量为稀释1000，3000，5000倍液时，其防治效果分别为：82.17％，77.83％，73.24％。在1％及5％差异水平上，可可链霉菌fn生物防治菌剂防治苹果炭疽叶枯病在用量为稀释1000倍液时的防治效果，优于其在用量为3000，5000倍液。与此同时，可可链霉菌fn生物防治菌剂稀释1000倍液时的防治效果显著高于对照药剂10％多抗霉素可湿性粉剂在用药量为稀释1000倍液和80％代森锰锌可湿性粉剂在用药量为稀释600倍液时的防治效果。

试验期间未发现可可链霉菌fn生防菌剂有药害现象发生。

2、防治苹果树叶部病害的有效性、广谱性强：可可链霉菌(streptomycescacaoi)fncgmccno.13080，还可对苹果树其他病害：苹果腐烂病、苹果根腐病、苹果轮纹病、苹果疫腐病也具有很强的抑制能力。

3、防治其他果蔬上的真菌性病害的有效性、广谱性强：可可链霉菌fn对其它果蔬上真菌性病害：黄瓜蔓枯病、黄瓜立枯病、番茄早疫病、西瓜枯萎病、油菜菌核病、白菜黑斑病有很强的抑制能力。

4、可可链霉菌fn对果蔬致病性菌具有广谱抑菌性，实验表明，可可链霉菌fn可对果蔬的致病菌均具有有效的抑制作用，以下为可可链霉菌fn对不同致病菌的抑菌率：炭疽叶枯病菌：86.2％、链格孢菌苹果专化型；88.9％、贝伦格葡萄座腔菌：77.1％、苹果黑腐皮壳菌：89.6％、尖孢镰刀菌：80.9％、恶疫霉：83.6％、西瓜壳二孢：71.4％、立枯丝核：74.0％、茄链格孢菌：80.9％、西瓜尖孢镰刀：77.9％、核盘菌：81.4％、芸薹链格孢：90.1％；

5、较高的遗传稳定性：可可链霉菌fn经传30代后，对炭疽叶枯病菌、链格孢苹果专化型、贝伦格葡萄座腔菌、苹果黑腐皮壳菌、尖孢镰刀菌、恶疫霉、西瓜壳二孢、立枯丝核、茄链格孢菌、西瓜尖孢镰刀、核盘菌、芸薹链格孢的抑菌率分别为85.3％、88.0％、76.5％、88.5％、77.1％、82.5％、69.3％、72.5％、78.6％、76.1％、80.2％、88.6％，与可可链霉菌fn第1代抑菌率基本一致，表明本发明所述的可可链霉菌fn不会随传代次数的增加而降低对上述病原菌的抑制活性，具有较高的遗传稳定性。

6、较强的耐热性、耐酸、碱性、较高的耐紫外线能力：可可链霉菌fn具有较强的耐热性，实验表明，可可链霉菌fn可以在50℃的条件下保持良好的生长状态，致死温度达到95℃，由此说明，可可链霉菌fn在高温胁迫下依然具有较高的菌株活力。可可链霉菌对紫外线不敏感，紫外线持续照射24h后，菌存活率达77％，紫外线持续照射32h后，菌株存活率仍大于60％。

可可链霉菌fn不仅在发酵过程中可以保持较强的菌种活力，另一方面也可以说明，发酵菌剂在应用于病原菌的防治过程中，不仅在常温条件下可以保持显著的抑菌效果，而且可以在高温天气，仍然保持良好的菌株活力以及抑菌效力。而且在室外强光照天气下，仍能保持良好的菌株活性。

可可链霉菌fn具有耐酸性以及极强的耐碱性，在ph10的碱胁迫下，仍然呈现良好的生长状态，不仅在发酵过程中可以保持较强的菌种活力，而且在发酵菌剂应用于病原菌的防治过程中，也可以抵抗外界来源于农药、雨雪等不同的酸碱环境，同时保持较高的抑菌活力。

此外，可可链霉菌fn具有良好的耐盐能力，可以耐受盐离子浓度为17％的盐胁迫作用。

7、菌株发酵活力高：本发明提供了可可链霉菌(streptomycescacaoi)fncgmccno.13080生防菌剂的制备，通过液体发酵种子液和固体发酵最终获得菌活力均不小于2.0×10¹¹cfu/g的生防菌剂，在防治苹果树叶部病害的应用上效果十分显著。

8、利用具有拮抗作用的可可链霉菌fn进行防治植物病害不易产生抗药性，等优点，是生物防治的首选。与此同时，可可链霉菌fn可以避免对果蔬的食品安全问题带来隐患，以及对人体健康造成严重的威胁。生防菌剂生产便捷，使用方便，利用可可链霉菌fn及其发酵代谢产物制成的混合菌剂对环境更加友好，无污染无农药残留，符合我国可持续发展的战略要求。而且生防菌剂对环境变化敏感度小，效果稳定。

需要说明的是本发明的技术效果是各工艺步骤及参数相互协同、相互作用的结果，并非简单的工艺的叠加，各工艺的有机结合产生的效果远远超过各单一工艺功能和效果的叠加，具有较好的先进性和实用性。

附图说明

图1为可可链霉菌fn光学显微镜下气生菌丝及孢子链形态(10×40倍)；

图2为苹果斑点落叶病病原菌正常的菌丝和孢子形态以及经可可链霉菌fn处理后的畸变菌丝和畸变孢子形态，其中2a：正常菌丝(10×10倍镜)，2b：正常孢子(10×40倍镜下)，2c：畸变菌丝(10×10倍镜)，2d：畸变孢子(10×40倍镜下)。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

实施例1可可链霉菌(streptomycescacaoi)fn的分离纯化以及筛选

1.可可链霉菌(streptomycescacaoi)fn的分离与纯化

从抚宁菜园中采集土样装入无菌袋中，取10g加入已灭菌的含100ml蒸馏水和玻璃珠的三角瓶中，置于摇床200rpm震荡30min，静置10min后，摇匀用移液器吸取5ml加入含45ml无菌水的小三角瓶中，即稀释10²倍，依次进行梯度稀释至10^-3、10^-4、10^-5、10^-6倍，分别用移液器吸取100μl涂布于含有抗生素(重铬酸钾50mg/l、萘啶酮酸15mg/l和制霉菌素50mg/l)的2216e平板上，每个浓度设置3个重复，置于28℃培养箱中培养5-10天。用灭菌的竹签挑取放线菌单菌落到新鲜配制的2216e平板上进行分离纯化。

2.拮抗菌的筛选

以苹果炭疽叶枯病病原菌和苹果斑点落叶病病原菌为靶标菌，利用平板对峙培养法进行生防菌株的筛选，在直径90mm平板背面画十字，十字交叉点为平板圆心，在十字线上距圆心25mm处4个点其中的3点分别接种3株7mm益生菌菌饼，剩余1点接种空白的7mmpda培养基作为对照，将病原菌7mm菌饼接种在新鲜配制的pda平板中央，置于28℃培养5-10天，筛选得到对苹果炭疽叶枯病和苹果斑点落叶病抑菌能力强的菌株，命名为fn。

3.菌株鉴定

综合fn菌株的形态学特征、生理生化特性和16srdna序列分析结果，将其鉴定为可可链霉菌。具体鉴定结果如下：

可可链霉菌fn形态特征：在2216e固体培养基上，菌丝生长良好，基内菌丝黄色，气生菌丝鼠灰色；高氏合成一号(isp1)生长缓慢，基内菌丝浅黄色，气生菌丝浅灰色；麦芽汁酵母膏琼脂(isp2)生长良好，基内菌丝黄色，气生菌丝鼠灰色；燕麦粉琼脂(isp3)基内菌丝淡黄色，气生菌丝白色；无机盐淀粉琼脂(isp4)基内菌丝黄色，气生菌丝淡灰色；甘油天门冬素琼脂(isp5)，基内菌丝淡黄色，气生菌丝白色；孢子丝螺旋形，孢子球形如附图1所述。

可可链霉菌fn生理生化特性：明胶液化，淀粉水解强，牛奶不凝固，不产硫化氢，不产黑色素，不还原硝酸盐，可利用α-d-乳糖、肝糖、d-纤维二糖、甘氨酰-l-谷氨酸、丙酮酸甲酯、吐温40、吐温80、d-甘露醇、d,l-α-甘油、n-乙酰氨基-d-葡萄胺、d-氨基葡萄糖酸。

可可链霉菌(streptomycescacaoi)fn已于2016年10月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)保藏，编号为cgmccno.13080。

实施例2可可链霉菌fn的生长特性

1.生长温度

将2216e液体培养基(细菌蛋白胨no.25g/l、酵母粉1g/l，余量为蒸馏水，ph自然)分装到透明试管中，121℃湿热灭菌30min，培养液中不得有沉淀。将可可链霉菌fn接种2216e液体培养基中摇瓶48作为接种剂，按1‰分别接种到含2216e液体培养基的试管内，对照不接种。分别在0℃、7℃、15℃、20℃、28℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃的培养箱内进行培养3d-5d，设3个重复，观察并记录生长(沉淀)情况。

2.耐酸碱性

将2216e液体培养基用稀hcl或naoh调节成不同ph(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0)，分装到透明试管中，121℃湿热灭菌30min。按1‰接种可可链霉菌到fn到不同ph的2216e液体培养基中，对照不接种，设3个重复。28℃培养3-5天，记录菌株生长(沉淀)情况。

3.耐盐性

再2216e液体培养基中加入不同量的nacl，配制成盐浓度为1％、2％、5％、7％、9％、11％、13％、15％、17％、20％、25％、30％的2216e液体培养基，分装到透明试管中，121℃湿热灭菌30min。按1‰接种可可链霉菌fn到不同盐浓度的2216e液体培养基中，对照不接种，设3个重复。28℃培养3-5天，记录菌株生长(沉淀)情况。

4.致死温度

将可可链霉菌fn菌液分别放入60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃的水浴锅中，计时10min后立即放入冷水中迅速冷却，设3个重复。分别取100μl涂布新鲜的2216e平板上，置于28℃培养3-5天，记录菌株生长情况。

5.紫外线敏感性

取可可链霉菌fn发酵液100μl涂布到2216e平板上，置于30w紫外灯40cm处分别照射0h、0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、16h、20h、24h、32h、40h、48h后，置于28℃培养3-5天，记录菌株生长情况。

可可链霉菌生长特性见表1，最适生长温度为28℃，生长温度范围是15℃-45℃；最适生长ph7.0，生长ph范围是3.0-12.0；耐15％的盐离子浓度。致死温度为85℃，10min。对紫外线不敏感，紫外线持续照射24h后，菌存活率达77％，紫外线持续照射32h后，菌存活率仍大于60％。

表1可可链霉菌fn生长特性

注：+阳性；++强阳性；w*弱阳性；-阴性

由表1可以看出，可可链霉菌fn具有较强的耐热性，可以在50℃的条件下保持良好的生长状态，致死温度达到95℃，由此说明，可可链霉菌fn在高温胁迫下依然具有较高的菌株活力。对紫外线不敏感，紫外线持续照射24h后，菌存活率达77％，紫外线持续照射32h后，菌存活率仍大于60％。

可可链霉菌fn不仅在发酵过程中可以保持较强的菌种活力，另一方面也可以说明，发酵菌剂在应用于病原菌的防治过程中，不仅在常温条件下可以保持显著的抑菌效果，而且可以在高温的天气，仍然保持良好的菌株活力以及抑菌效力。而且在室外强光照天气下，仍能保持良好的菌株活性。

可可链霉菌fn具有耐酸性以及极强的耐碱性，在ph10的碱胁迫下，仍然呈现良好的生长状态，不仅在发酵过程中可以保持较强的菌种活力，而且在发酵菌剂应用于病原菌的防治过程中，也可以抵抗外界来源于农药、雨雪等不同的酸碱环境，同时保持较高的抑菌活力。

此外，可可链霉菌fn具有良好的耐盐能力，可以耐受盐离子浓度为17％的盐胁迫作用。

实施例3可可链霉菌fn对防治果蔬真菌性病害的应用

测定可可链霉菌fn对苹果炭疽叶枯病、苹果斑点落叶病、苹果轮纹病、苹果腐烂病、苹果根腐病、苹果疫腐病、黄瓜蔓枯病、黄瓜立枯病、番茄早疫病、西瓜枯萎病、油菜菌核病、白菜黑斑病病原菌的抑菌率。在直径90mm的pda平板背面过平板中心画直线，在线上距中心25mm处的2个点接种7mm益生菌菌饼，对照平板接种7mm空白pda培养基。将病原菌7mm菌饼接种pda平板中央，置于28℃培养5-10天，分别统计对照病原菌半径和处理病原菌半径，计算抑菌率。抑菌率％＝(对照病原菌半径mm-处理病原菌半径mm)/(对照病原菌半径mm-病原菌菌饼半径3.5mm)×100％。将可可链霉菌fn进行传代培养，并测定第10代、第15代、第25代、第30代对果蔬真菌性病原菌的抑菌率，实验方法同上。

表2可可链霉菌fn不同代数对12种植物病害病原菌的抑菌率

由表2可以看出，可可链霉菌fn对苹果树病害(苹果炭疽叶枯病、苹果斑点落叶病、苹果腐烂病、苹果根腐病、苹果轮纹病、苹果疫腐病)有很强的抑制能力，除此之外，对其它果蔬上真菌性病害(黄瓜蔓枯病、黄瓜立枯病、番茄早疫病、西瓜枯萎病、油菜菌核病、白菜黑斑病)的抑制能力也很强。

可可链霉菌fn经传30代后，对炭疽叶枯病菌、链格孢苹果专化型、贝伦格葡萄座腔菌、苹果黑腐皮壳菌、尖孢镰刀菌、恶疫霉、西瓜壳二孢、立枯丝核、茄链格孢菌、西瓜尖孢镰刀、核盘菌、芸薹链格孢的抑菌率分别为85.3％、88.0％、76.5％、88.5％、77.1％、82.5％、69.3％、72.5％、78.6％、76.1％、80.2％、88.6％，与可可链霉菌fn第1代抑菌率基本一致，表明本发明所述的可可链霉菌fn不会随传代次数的增加而降低对上述病原菌的抑制活性，具有较高的遗传稳定性。

实施例4可可链霉菌fn抑菌广谱性测定对病原菌菌丝及孢子的影响

以苹果斑点落叶病病原菌链格孢苹果转化型(alternariaalternariaf.spmali)为例。将苹果斑点落叶病病原菌接种到pda平板中央，据平板中央25mm处两侧分别接种益生菌，28℃生长7天。从已长好的平板上切取长方形的靠近益生菌并带有苹果斑点落叶病病原菌的菌块，将切下的菌块用小刀片下薄薄一层，置于载玻片上，通过光学显微镜进行观察。没有接种益生菌的苹果斑点落叶病病原菌进行相同处理。

通过光学显微镜观察苹果斑点落叶病病原菌菌丝和孢子形态结构发现，靠近益生菌边缘的病原菌的菌丝发生了畸变，不能形成正常的孢子(图2)。可能是可可链霉菌fn产生的代谢产物通过pda平板进行扩散，病原菌接触代谢产物后诱使菌丝形态发生改变，菌丝膨大，不能形成正常的孢子。

实施例5可可链霉菌fn生防菌剂的制备

孢子悬液制备：将无菌水加入保存有可可链霉菌fn的2216e固体培养基的斜面上，进而刮去孢子，震荡混匀，得到孢子悬液，所述孢子悬液的菌体浓度为10⁸-10⁹cfu/ml；

种子液培养：将所述孢子悬液按接种量1％(v/v)接种到种子液培养基中，28℃，200r/min，摇瓶培养96h，得到种子液；

固体发酵培养：将所述种子液按接种量体积质量比10％(v/m)接种到含水量50％的固体发酵培养基中，28℃曲盘发酵培养4天，自发酵开始至结束，维持固体发酵培养基的恒定含水量：50％，发酵期间翻倒3次，待发酵结束，28℃风干，用粉碎机研磨，收集通过120目筛子的菌剂，于室温阴暗处储存，得到可可链霉菌fn生防菌剂，所述可可链霉菌fn生防菌剂的菌种活力3.7×10¹¹cfu/g。

所述2216e固体培养基(g/l)：细菌蛋白胨no.25、酵母粉1、琼脂20，余量为蒸馏水，ph自然；

所述种子液培养基(g/l)：玉米粉10，蛋白胨10，酵母粉5，磷酸氢二钾2，硫酸镁0.3，余量为蒸馏水，ph自然；

所述固体发酵培养基(％)(m/m)：稻壳20％，麸皮44.7％，玉米粉22％，豆饼粉12％，碳酸钙0.8％，磷酸氢二钾0.3％，硫酸镁0.2％，ph自然。

以下实施例6-9的培养基均与实施例4中的相同。

实施例6可可链霉菌fn生防菌剂的制备

孢子悬液制备：将无菌水加入保存有可可链霉菌fn的2216e固体培养基的斜面上，进而刮去孢子，震荡混匀，得到孢子悬液，所述孢子悬液的菌体浓度为10⁸-10⁹cfu/ml；

种子液培养：将所述孢子悬液按接种量1％(v/v)接种到种子液培养基中，28℃，160r/min，摇瓶培养90h，得到种子液；

固体发酵培养：将所述种子液按接种量体积质量比15％(v/m)接种到含水量为50％(v/m)的固体发酵培养基中，28℃曲盘发酵培养3天。20℃风干，用粉碎机研磨，收集通过120目筛子的菌剂，于室温阴暗处储存,得到可可链霉菌fn生防菌剂，所述可可链霉菌fn生防菌剂的菌种活力2.2×10¹¹cfu/g。

实施例7可可链霉菌fn生防菌剂的制备

孢子悬液制备：将无菌水加入保存有可可链霉菌fn的2216e固体培养基的斜面上，进而刮去孢子，震荡混匀，得到孢子悬液，所述孢子悬液的菌体浓度为10⁸-10⁹cfu/ml；

种子液培养：将所述孢子悬液按接种量3％(v/v)接种到种子液培养基中，28℃，240r/min，摇瓶培养100h，得到种子液；

固体发酵培养：将所述种子液按接种量体积质量比5％(v/m)接种到含水量50％的固体发酵培养基中，28℃曲盘发酵培养6天。30℃风干，用粉碎机研磨，收集通过120目筛子的菌剂，于室温阴暗处储存,得到可可链霉菌fn生防菌剂，所述可可链霉菌fn生防菌剂的菌种活力2.3×10¹¹cfu/g。

实施例8可可链霉菌fn生防菌剂的制备

孢子悬液制备：将无菌水加入保存有可可链霉菌fn的2216e固体培养基的斜面上，进而刮去孢子，震荡混匀，得到孢子悬液，所述孢子悬液的菌体浓度为10⁸-10⁹cfu/ml；

种子液培养：将所述孢子悬液按接种量1％(v/v)接种到种子液培养基中，28℃，180r/min，摇瓶培养95h，得到种子液；

固体发酵培养：将所述种子液按接种量体积质量比8％(v/m)接种到含水量50％的固体发酵培养基中，28℃曲盘发酵培养3天，自发酵开始至结束，维持固体发酵培养基的恒定含水量：50％，发酵期间翻倒2次，待发酵结束，25℃风干，用粉碎机研磨，收集通过120目筛子的菌剂，于室温阴暗处储存,得到可可链霉菌fn生防菌剂，所述可可链霉菌fn生防菌剂的菌种活力3.2×10¹¹cfu/g。

实施例9可可链霉菌fn生防菌剂的制备

孢子悬液制备：将无菌水加入保存有可可链霉菌fn的2216e固体培养基的斜面上，进而刮去孢子，震荡混匀，得到孢子悬液，所述孢子悬液的菌体浓度为10⁸-10⁹cfu/ml；

种子液培养：将所述孢子悬液按接种量1.5％(v/v)接种到种子液培养基中，28℃，220r/min，摇瓶培养98h，得到种子液；

固体发酵培养：将所述种子液按接种量体积质量比12％(v/m)接种到含水量50％的固体发酵培养基中，28℃曲盘发酵培养5天，自发酵开始至结束，维持固体发酵培养基的恒定含水量：50％，发酵期间翻倒3次，待发酵结束，30℃风干，用粉碎机研磨，收集通过120目筛子的菌剂，于室温阴暗处储存,得到可可链霉菌fn生防菌剂，所述可可链霉菌fn生防菌剂的菌种活力3.5×10¹¹cfu/g。

实施例10可可链霉菌fn生物防治菌剂防治苹果斑点落叶病的田间试验

可可链霉菌fn生防菌剂按实施例5中所述方法制备。

田间试验设计：共6个处理，即可可链霉菌fn生防菌剂1000倍稀释液；可可链霉菌fn生防菌剂3000倍稀释液；可可链霉菌fn生防菌剂5000倍稀释液；10％多抗霉素可湿性粉剂1000倍稀释液；80％代森锰锌可湿性粉剂600倍稀释液；上述稀释液体均为清水，对照组为清水。每个处理重复4次，合计24个小区，每小区2棵苹果树，随机区组排列。试验地点在陕西省宝鸡市千阳县草碧镇屈家湾村苹果园进行，试树品种为“富士”，树龄12年，果树株距3m，行距4m。可可链霉菌fn生防菌剂为实施例6中所述方法制备，用清水稀释适当浓度后喷施。

施药共计6次，第一次5月18日，第二次5月30日，第三次6月12日，第四次7月4日。第五次7月17日，第六次8月3日。使用北京丰茂dfh-16a型背负手动喷雾器，采用全株茎叶均匀喷雾法进行处理。喷液量以均匀喷湿叶片正反面，有药液下滴为度。

调查方法：分别于5月16日药前和8月3日末次药后10-14天后调查。每小区2株树均调查，每株分东、西、南、北、中5个方向各固定2个新梢，调查其全部叶片并计算病情指数和防治效果。叶部病级分级标准如下：

0级：无病斑；

1级：病斑面积占整个叶面积的10％以下；

3级：病斑面积占整个叶面积的11％-25％；

5级：病斑面积占整个叶面积的26％-40％；

7级：病斑面积占整个叶面积的41％-65％；

9级：病斑面积占整个叶面积的66％以上。

药效计算方法：病情指数＝100×∑[(各级病叶数×相对级数值)]/(调查总叶片数×9)；防治效果(％)＝[1-(对照区药前病情指数×处理区药后病情指数)/(对照区药后病情指数×处理区药前病情指数)]×100％。利用dps软件的duncan’s新复极差检验法对数据进行分析，结果如表3所示。

表3可可链霉菌fn生防菌剂对苹果斑点落叶病的防治效果

注:小写字母表示在5％水平上的差异显著性，大写字母表示在1％水平上的差异显著性。

按实施例4中所述方法制备的可可链霉菌fn生防菌剂，用清水稀释1000倍后，均匀喷施在果树上至叶片有药液下滴为准，于春梢开始喷施，共喷施6次，对苹果斑点落叶病的防效达87.10％。

需要说明的是：本发明实施例6-9制备的可可链霉菌fn生物防治菌剂同样具有上述实验效果，各实施例之间及与上述实验效果差异性不大。

实施例11可可链霉菌生防菌剂防治苹果炭疽叶枯病的田间试验

可可链霉菌fn生防菌剂按实施例5中所述方法制备。

田间试验设计：共6个处理，可可链霉菌fn生防菌剂1000倍稀释液；可可链霉菌fn生防菌剂3000倍稀释液；可可链霉菌fn生防菌剂5000倍稀释液；10％多抗霉素可湿性粉剂1000倍稀释液；80％代森锰锌可湿性粉剂600倍稀释液；上述稀释液体均为清水，对照组为清水。每个处理重复4次，合计24个小区，每小区2棵苹果树，随机区组排列。试验地点在陕西省宝鸡市千阳县草碧镇屈家湾村苹果园进行，试树品种为“金冠”，树龄15年，果树株距3m，行距4m。可可链霉菌fn生防菌剂为实施例6中所述方法制备，用清水稀释适当浓度后喷施。

施药共计6次，第一次5月16日，第二次6月1日，第三次6月13日，第四次7月5日。第五次7月17日，第六次8月7日。使用北京丰茂dfh-16a型背负手动喷雾器，采用全株茎叶均匀喷雾法进行处理。喷液量以均匀喷湿叶片正反面，有药液下滴为度。

调查方法：5月16日药前并未发生炭疽叶枯病。于8月7日末次药后10-14天后调查。每小区2株树均调查，每株分东、西、南、北、中5个方向各固定2个新梢，调查其全部叶片并计算病情指数和防治效果。叶部病级分级标准如下：

0级：无病斑；

1级：病斑面积占整个叶面积的10％以下；

3级：病斑面积占整个叶面积的11％-25％；

5级：病斑面积占整个叶面积的26％-40％；

7级：病斑面积占整个叶面积的41％-65％；

9级：病斑面积占整个叶面积的66％以上。

药效计算方法：病情指数＝100×∑[(各级病叶数×相对级数值)]/(调查总叶片数×9)；防治效果(％)＝[1-(对照区药前病情指数×处理区药后病情指数)/(对照区药后病情指数×处理区药前病情指数)]×100％。利用dps软件的duncan’s新复极差检验法对数据进行分析，结果如表4所示。

表4可可链霉菌fn生防菌剂对苹果炭疽叶枯病的防治效果

按实施例4中所述方法制备的可可链霉菌fn生防菌剂，用清水稀释1000倍后，均匀喷施在果树上至叶片有药液下滴为度，于春梢开始喷施，共喷施6次，对苹果炭疽叶枯病的防效达82.17％。

由实施例9、实施例10的田间试验结果表明，可可链霉菌fn生物防治菌剂防治苹果树斑点落叶和炭疽叶枯在用量为稀释1000，3000，5000倍液时，对苹果树安全无药害。

可可链霉菌fn生物防治菌剂在防治苹果斑点落叶上，当用量为稀释1000，3000，5000倍液时，其防治效果分别为：87.10％，85.58％，82.74％。在1％及5％差异水平上，可可链霉菌fn生物防治菌剂防治苹果斑点落叶病在用量为稀释1000倍液时的防治效果，优于其在用量为3000，5000倍液，且其稀释1000倍液时的防治效果显著高于对照药剂10％多抗霉素可湿性粉剂在用药量为稀释1000倍液和80％代森锰锌可湿性粉剂在用药量为稀释600倍液时的防治效果。

可可链霉菌fn生物防治菌剂在防治苹果炭疽叶枯上，当用量为稀释1000，3000，5000倍液时，其防治效果分别为：82.17％，77.83％，73.24％。在1％及5％差异水平上，可可链霉菌fn生物防治菌剂防治苹果炭疽叶枯病在用量为稀释1000倍液时的防治效果，优于其在用量为3000，5000倍液。与此同时，可可链霉菌fn生物防治菌剂稀释1000倍液时的防治效果显著高于对照药剂10％多抗霉素可湿性粉剂在用药量为稀释1000倍液和80％代森锰锌可湿性粉剂在用药量为稀释600倍液时的防治效果。

可可链霉菌fn生物防治菌剂的1000倍稀释液对苹果斑点落叶病和苹果炭疽叶枯病都有很好的防治效果，且优于对照药剂10％多氧霉素可湿性粉剂1000倍液和80％代森锰锌可湿性粉剂600倍液。试验期间未发现可可链霉菌fn生防菌剂有药害现象发生。

需要说明的是：本发明实施例6-9制备的可可链霉菌fn生物防治菌剂同样具有上述实验效果，各实施例之间及与上述实验效果差异性不大。

实施例12可可链霉菌fn生物防治菌剂的的热稳定性

将实施例5制备的可可链霉菌fn生物防治菌剂分别于50，70，90，100，121℃温度下处理30min，分别用无菌水稀释100倍待测。以苹果斑点落叶病病原菌为试验对象，将7mm病原菌菌饼接种到pda平板中央，过平板中心划线，在线上距中心25mm处的2个点用打孔器打7mm孔，分别加入100μl待测液，对照加入100μl无菌水。置于28℃培养7-10天，分别统计对照病原菌半径和处理病原菌半径，计算抑菌率。抑菌率％＝(对照病原菌半径mm-处理病原菌半径mm)/(对照病原菌半径mm-病原菌菌饼半径3.5mm)×100％。

表5可可链霉菌fn生物防治菌剂的热稳定性测定

由表5可以看出，可可链霉菌fn生物防治菌剂经高温处理后，抑菌能力没有显著改变。从抑菌率可以看出，菌剂经过不同高温处理后，仅100℃和121℃处理30min后略有下降，但仍能达到83.7％以上。可见，可可链霉菌fn生物防治菌剂的抗细菌活性具有较强的热稳定性。

需要说明的是：本发明实施例6-9制备的可可链霉菌fn生物防治菌剂同样具有上述实验效果，各实施例之间及与上述实验效果差异性不大。

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<110>陕西枫丹百丽生物科技有限公司

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