防治香蕉枯萎病的内生真菌L‑14及其应用的制作方法

本发明涉及植物保护领域，尤其涉及一种防治香蕉枯萎病的内生真菌，具体地说涉及一种防治香蕉枯萎病的内生真菌Schizothecium sp.L-14及应用。

背景技术：

香蕉枯萎病又称香蕉巴拿马病、黄叶病、凋萎病，是制约香蕉生产的一种毁灭性土传病害。该病由镰刀菌属尖孢镰刀菌古巴专化型侵染引起，近年在华南蕉区有扩大为害趋势。目前尚无有效克制香蕉枯萎病的药剂，较为耐病的香蕉品种又无法达到产量的要求。生物防治作为综合防治香蕉枯萎病的措施之一，是一项有发展前景的环境友好型技术。

目前，国内外研究学者对香蕉枯萎病的生物防治已开展不少研究，已报道的生防微生物包括了真菌、细菌和放线菌等。柯仿钢等(2010)发现通过连续施用木霉菌株gz-2菌剂对枯萎病的防治效果达74.4％；石妞妞等(2015)于接种香蕉枯萎病菌前4d和2d，施用枯草芽孢杆菌T122F，对香蕉枯萎病防效达66％。茹祥(2012)在海南吊罗山原始林区分离到两株对香蕉枯萎病有较好生防效果的放线菌DL-24和DL-28。尽管生防微生物资源的筛选收集工作已经开展得较为广泛，但因田间环境因素复杂，适用于大规模田间应用的生防微生物资源依然很少。内生真菌是一类能与寄主植物互惠共生的微生物资源，其定殖宿主具有非专一性，且在胁迫环境中，其分布更为广泛。

技术实现要素：

本发明提供一种内生真菌菌株L-14，已于2016年4月18日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC NO.12240，属于裂壳菌(Schizothecium sp.)真菌。

菌株L-14的分离所需材料与方法如下：

1.材料

土样采集后尽快处理或置于4℃冰箱待用。

选用白菜种子，种子表面消毒方法：体积浓度75％酒精20秒→质量浓度1％次氯酸钠1分钟→无菌水漂洗三次，每次1分钟→无菌滤纸吸干水分→置于纯琼脂上培养2-3天，出芽长成无菌苗。

2.菌株L-14的分离

将土样与灭菌育苗土以重量比2:1比例混合后装入培养杯中，将上述表面消毒后的白菜苗，培养1-2个月后收获，用龙头水冲洗白菜幼苗的根，采用质量浓度1％次氯酸钠1-2分钟进行表面消毒，灭菌水冲洗3次后，吸干水分后置于重量浓度为1/2玉米粉培养基上，于25℃培养箱中培养并逐日观察，待菌丝从根段部位长出后及时转接到麦芽汁培养基上，获得纯培养菌株。

生防菌株的分类鉴定：

1.菌株的形态学观察

将从冰箱取出的菌种接种至马铃薯葡萄糖培养基(PDA)上，培养3周后观察菌落形态特征。用插片法将纯化的菌株接于燕麦培养基，25℃培养2-4周，待明显看到菌丝着生在盖玻片上时，将玻片取出，于光学显微镜下进行观察。

2.菌株的分子鉴定

将内生真菌菌株L-14培养于马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)，在28℃转速120r/min摇床中震荡培养14d后，过滤收集菌丝。菌丝体总DNA采用Saghai et al.(1984)【Phytopathology,2015,105:1512-1521Saghai MA,Soliman KM,Jorgensen RA,et al.Ribosomal DNA spacer-length Polymorphism in barley:mendelian inheritance chromosomal location and population dynamics[J].Pro.Natl.Acard.Sci.USA,1984,81(24):5014-5018】的CTAB法提取。28SrDNA的区域PCR扩增采用通用引物LROR和LR5。PCR反应体系为：TIANgel一管便携式MasterMix(成分：10mmol/L Tris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl₂，250μmol/L Dntp each，0.05U Pplymerase/μL、ddH₂O)9μL，20μmol/L正反引物各1μL，模板DNA 1μL，用超纯水定容至25μL。PCR反应参数：94℃预变性5min， 94℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸10min。PCR扩增产物测序由上海生工生物工程技术有限公司完成。

序列使用ClustalX 1.81和BioEdit v7.0软件进行分析，实验获得的28S rRNA基因D1/D2区序列及其在GenBank中下载的最相似序列，使用MEGA6.06软件基于Kimura双参数模型构建Neighbor-Joining系统发育树，经bootstrap1000次循环检验系统树的可靠性。

3.内生真菌菌株L-14的形态学鉴定

该菌株在CMMY培养基上长速较快，28℃下培养两周后菌落直径60-65mm，圆形，棕色至深棕色，粉状(如图2所示)。显微镜下观察可见菌丝光滑，有隔，浅黄褐色。分生孢子梗保龄球状至长瓶状，顶端有明显囊领，部分弯曲，偶有缢缩，不分枝或偶有1-2个分枝，浅黄褐色，光滑，0-2个分隔，分隔处稍有缢缩或不缢缩，分生孢子梗长7.9-25.7μm，梗最宽部位1.7-3.8μm，梗最窄部位0.7×1.7μm。分生孢子从分生孢子梗顶部链生，浅黄褐色，梨形、倒卵球形或楔形，基部有平整截面，光滑，无隔，1.9-3.3×1-2μm(如图3、4所示)。

4.序列分析及系统发育分析

对菌株L-14的28SrRNA基因序列进行PCR扩增、纯化、测序后，测得其序列长度为900bp。将该序列进行BLAST分析，选取相似性极高的部分菌株，构建NJ系统发育树(如图1所示)。菌株L-14与Schizothecium属种聚到一起，支持率为94％，结合该菌株的形态学特征，将其鉴定为裂壳菌(Schizothecium sp.)真菌。

本发明还提供了该菌株L-14在防治香蕉枯萎病上的应用。

菌株L-14在平皿防治上防治香蕉枯萎病上的应用，包括以下几个步骤：

步骤A:将菌株L-14活化后接种于燕麦培养基上，备用；

步骤B：选择长势一致的无菌香蕉组培苗移栽至菌落上，根系平铺于菌株L-14菌落表面，每菌落移栽一株组培苗；将培养皿放入组培瓶中，再将组培瓶放入培养箱中共培养，获得菌株L-14-香蕉苗共生体。

优选的，所述步骤B中，培养箱培养条件为：温度25℃、光照强度 180μmol/m²·s²、光照时间16h/d，培养15d。

菌株L-14在盆栽防治上的应用包括以下几个步骤：

步骤A＇:取长势一致的3-4叶香蕉幼苗统一栽种于营养杯中，采用无病自然土种植；

步骤B＇:将活化后的菌株L-14接入马铃薯葡萄糖液体培养基中，用灭菌纱布过滤收集菌丝团，用灭菌水冲洗数次后，将菌丝团打碎配制成L-14菌液，备用；

步骤C＇：对步骤A＇得到的香蕉苗用菌株L-14菌液进行灌根。

优选的，所述步骤B＇中，所述L-14菌液的浓度为5×10⁵CFU/mL的菌液。

优选的，所述步骤C＇中，每株香蕉苗灌根50mL菌液，每隔15d灌根一次，共灌根三次。

本发明的有益效果：菌株L-14对香蕉枯萎病的防治效果稳定，平皿防效平均可达到72.42％，盆栽防效平均可达到56.52％。

附图说明

图1是菌株L-14与Schizothecium属种聚到一起的系统进化树。

图2是菌株L-14在PDA上的菌落形态。

图3、4是菌株L-14产孢梗和分生孢子(标尺＝10μm)。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明：

实施例1

内生真菌菌株L-14抗香蕉枯萎病的平皿防治

步骤(1):内生真菌菌株L-14与香蕉组培苗的共培养

将供试菌株L-14活化后接种于燕麦培养基(燕麦粉10g/L，琼脂18g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，KH₂PO₄ 1.5g/L，NaNO₃ 1g/L)上，每皿接种3个菌块，培养10d，备用。选择长势一致的无菌香蕉组培苗移栽至菌落上，根系平铺于菌落表面，每菌落移栽一株组培苗，每皿栽3株。将培养皿放入组培瓶 中，于25℃、光照强度180μmol/m²·s²、光照时间16h/d的培养箱中共培养15d。以不接种内生真菌菌株的处理为对照，每个处理3个重复，每个重复7皿。

步骤(2):抗香蕉枯萎病内生真菌菌株L-14的平皿防治试验

将镰刀菌活化后接于水琼脂培养基(琼脂9g/L)上，每皿接种3个菌块，于28℃培养箱中培养4d，备用。将步骤(1)培养获得的菌株L-14-香蕉苗共生体连同培养基一起平移至长有病原菌的水琼脂培养基上，置于28℃，光照强度180μmol/m²·s²，湿度80％的恒温恒湿培养箱中培养15d。对照则直接接入带有镰刀菌的水琼脂平板上。观察记录各处理的病级情况，并计算病情指数和防治效果。平皿试验病情分级标准：0级-外观无可见症状；1级-香蕉植株长势无明显受阻，全株黄萎面积不超35％；2级-香蕉植株弱小，全株黄萎面积达35％-80％；3级-香蕉植株全株黄萎面积达80％以上，甚至全株枯死。

防效计算公式为：

内生真菌菌株L-14抗香蕉枯萎病的平皿防治结果：

通过平皿防治试验发现，内生真菌菌株L-14对香蕉枯萎病表现出较强的抑菌能力，3个重复抑菌率达70％以上，平均防治效果为72.42％。

表1内生真菌菌株L-14对香蕉枯萎病的平皿防治效果

实施例2

内生真菌菌株L-14对香蕉枯萎病的盆栽防治

步骤(1)：内生真菌菌株L-14菌液的制备

将活化后的内生真菌菌株L-14菌块接入马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)中，于25℃转速120r/min摇床中震荡培养14d后，用灭菌纱布过滤收集菌丝团，用灭菌水冲洗数次后，将菌丝团打碎配制成5×10⁵CFU/mL的菌液，备用。

步骤(2)：镰刀菌孢子悬浮液的制备

参照柯仿钢等，西贡蕉枯萎病生防木霉菌株gz-2的鉴定及生物学特性研究[J].西南农业学报，2010，23(5)：1533-1539方法，配制浓度为1×10⁶CFU/mL的菌液，4℃冰箱保存备用。

步骤(3)：内生真菌菌株L-14对香蕉枯萎病的盆栽防治试验

本实验在广西农业科学院微生物研究所网室内进行。取长势一致的香蕉幼苗(3-4叶)统一栽种于20cm×19cm的营养杯中，采用无病自然土种植。每株香蕉苗灌根50mL L-14菌液，每隔15d灌根一次，共灌根三次。于最后一次灌根结束10d后，对香蕉苗进行伤根接种镰刀菌孢子悬浮液。保持适温适湿，观察香蕉苗植株发病情况，约于接种后25d解剖香蕉植株球茎，观察记录香蕉苗病级，并计算防效。每个处理3个重复，每个重复 8株香蕉苗，以清水灌根并接种镰刀菌孢子悬浮液为对照。病情分级标准：0级-球茎健康无变色；1级：球茎变色面积占球茎面积的20％以下；2级-球茎变色面积占球茎面积的20％-40％；3级-球茎变色面积占球茎面积的40％-60％；4级-球茎变色面积占球茎面积的60％-80％；5级-球茎变色面积占球茎面积80％以上，甚至全部球茎变色坏死。防效计算公式为：

内生真菌菌株L-14对香蕉枯萎病的盆栽防治结果

如表2可知，通过盆栽防治试验可以看出，内生真菌菌株L-14对香蕉枯萎病的防治效果稳定，3个重复的防治效果均在50％以上，平均防效达56.52％，对香蕉枯萎病的发生有明显的抑制作用。

表2内生真菌菌株L-14对香蕉枯萎病的盆栽防治效果

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。