本发明涉及基因工程领域。具体地，本发明涉及一种葡萄糖氧化酶cngoda及其基因与应用。
背景技术
葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase,god)一种黄素依赖型的需氧脱氢酶，能够在有氧环境下专一性的氧化β-d-葡萄糖，生成葡萄糖酸和过氧化氢。葡萄糖氧化酶广泛地分布于动物、植物和微生物中，由于微生物具有生长繁殖速度快，来源广等特点使之成为葡萄糖氧化酶的主要来源。
葡萄糖氧化酶作为饲料添加剂之一，具有巨大的潜在应用价值。另外，葡萄糖氧化酶还具有广泛的应用前景，由于其催化专一性和高效性的优点，已应用于食品、饲料、医药、检测试纸和生物传感器等领域。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种新来源的葡萄糖氧化酶。
本发明的再一目的是提供上述葡萄糖氧化酶的基因。
本发明的再一目的是提供包含上述葡萄糖氧化酶基因的重组载体。
本发明的再一目的是提供包含上述葡萄糖氧化酶基因的重组菌株。
本发明的再一目的是提供一种制备葡萄糖氧化酶的方法。
本发明的再一目的是提供上述葡萄糖氧化酶的应用。
本发明首先所要解决的问题是克服现有技术的不足，并提供一种性质优良的、适合于在饲料、食品、医药等行业中应用的新的葡萄糖氧化酶。该葡萄糖氧化酶cngoda，ncbi序列比对结果显示，其氨基酸序列如seqidno.1：
其中，该酶全长614个氨基酸，n端17个氨基酸为信号肽序列“mhsihflaaflaavsea”。因此，成熟的葡萄糖氧化酶god的理论分子量为64.733kda，其氨基酸序列如seqidno.2：
该葡萄糖氧化酶最适ph为7.0，在ph6.0-ph10.0范围内，该酶能够维持其70％以上的酶活力；最适温度30℃，在15℃-50℃范围内能够维持50％以上的酶活力，具有较良好的温度稳定性。
本发明通过pcr的方法克隆了这个葡萄糖氧化酶基因cngoda，结果表明，葡萄糖氧化酶cdna全长1842bp，其cdna序列如seqidno.3示：
其中，信号肽的碱基序列为：
“atgcattcgattcatttcctagctgctttcctggctgcagtctctgaagct”
因此，成熟基因的编码序列为seqidno.4示：
成熟蛋白理论分子量为64.733kda，该酶属于葡萄糖/甲醇/胆碱氧化还原酶家族。将葡萄糖氧化酶基因cngodacdna序列及其氨基酸序列在genbank中进行blast比对，确定cngoda是一种新的葡萄糖氧化酶。
本发明还提供了包含上述葡萄糖氧化酶基因的重组载体，优选为ppic9-cngoda。将本发明的葡萄糖氧化酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将葡萄糖氧化酶基因插入到质粒ppic9上的ecori和noti限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于aoxl启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒ppic9-cngoda。
本发明还提供了包含上述葡萄糖氧化酶基因的重组菌株，优选为重组菌株gs115/cngoda。
本发明还提供了一种制备葡萄糖氧化酶的方法，包括以下步骤：
1)用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组葡萄糖氧化酶的表达；
3)回收并纯化所表达的葡萄糖氧化酶。
其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母(pichiapastoris)细胞、啤酒酵母(saccharomycescerevisiae)细胞或多型汉逊酵母(hansenulapolymorpha)细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(pichicpastoris)gs115，得到重组菌株gs115/cngoda。
本发明还提供了上述葡萄糖氧化酶的应用，运用基因工程手段来产业化生产葡萄糖氧化酶。
本发明从枝孢菌cladosporiumneopsychrotolernssl-16菌株中得到了一个新的葡萄糖氧化酶基因，是第一次在这一物种中发现此酶，从而扩展了葡萄糖氧化酶的研究范围，并且该酶也有良好的催化活性，且容易发酵生产。所有这些优点都意味着新发现的葡萄糖氧化酶在饲料、食品、医药等行业中将具有更重要的应用价值。
附图说明
图1根据本发明的具体实施方式的重组葡萄糖氧化酶的最适ph值。
图2根据本发明的具体实施方式的葡萄糖氧化酶的ph稳定性。
图3根据本发明的具体实施方式的葡萄糖氧化酶最适反应温度。
图4根据本发明的具体实施方式的葡萄糖氧化酶热稳定性。
具体实施方式
试验材料和试剂
1、菌株及载体：毕赤酵母(pichiapastorisgs115)；毕赤酵母表达载体ppic9及菌株gs115购自于invitrogen公司。
2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自takara公司，连接酶购自invitrogen公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
3、培养基：
(1)产酶培养基(/l)：葡萄糖172.11g，玉米浆11.05g，碳酸钙52.29g，牛肉蛋白胨3.5g，(nh4)h2po40.5g，mgso4·7h2o0.125g，feso4·7h2o0.125g。121℃灭菌处理20min。
(2)大肠杆菌lb培养基：1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％naci，ph7.0。
(3)bmgy培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％ynb，0.000049<biotin，1％甘油(v/v)。
(4)bmmy培养基：除以0.5％甲醇代替甘油外，其余成份均与bmgy相同。
说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)j.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1葡萄糖氧化酶编码基因god的克隆
(1)提取枝孢菌cladosporiumneopsychrotolernssl-16总rna
首先，将在产酶培养基中培养3天的菌，收集到滤纸上并压干，加入已高温灭菌的研钵中，液氮迅速研磨至粉末。然后将研磨好的菌体转移至一个新的、装有800μltrizol的1.5ml离心管中，吹打混匀，室温放置5min。加入200μl氯仿，剧烈振摇15s，室温放置3min，于4℃，12000rpm离心15min。吸取上清，加入等体积异丙醇，混匀，室温放置10min，于4℃，12000rpm离心10min。弃上清，沉淀用70％乙醇洗涤2次，沉淀在空气中干燥5min，加入适量dnase/rnase-free去离子水溶解rna。
(2)葡萄糖氧化酶cdna的获取
利用oligo(dt)20和反转录酶得到总cdna的一条链，然后设计合成带有ecori和noti限制性酶切位点的引物f和r(见表1)，对cngoda的成熟蛋白的编码区进行pcr扩增，获得葡萄糖氧化酶的cdna序列。
表1实施例1所需的引物
实施例2葡萄糖氧化酶工程菌株的构建
(1)表达载体的构建及在毕赤酵母中的表达
利用ecori和noti酶切实施例1中pcr产物，连接进入表达载体ppic9(invitrogen,sandiego)，葡萄糖氧化酶god成熟蛋白的序列插入到上述表达载体的信号肽序列的下游，与信号肽形成正确的阅读框架，构建成酵母表达载体ppic9-cngoda，大肠杆菌感受态细胞trans1，挑选阳性转化子进行dna测序，测序表明序列正确的转化子用于大量制备重组质粒。用限制性内切酶bglii进行线性化表达质粒载体dna，电击转化酵母gs115感受态细胞，30℃培养2-3天，挑取在md平板上生长的转化子进行进一步的表达实验，具体操作请参考毕赤酵母表达操作手册。
以同样的方式构建包含信号肽序列的重组表达载体。
(2)高葡萄糖氧化酶活性转化子的筛选
用灭过菌的牙签从长有转化子的md板上挑取单菌落，按照编号先点到md平板上，将md平板置于30℃培养箱中培养1～2天，至菌落长出。按编号从md平板上挑取转化子接种于装有3mlbmgy培养基的离心管中，30℃，220rpm摇床培养48h；将摇床培养48h的菌液3,000×g离心15min，去上清，离心管中再加入1ml含有0.5％甲醇的bmmy培养基，在30℃、220rpm诱导培养；诱导培养48h后，3,000×g离心5min，取上清用于酶活性检测，从中筛选出高葡萄糖氧化酶活性的转化子，具体操作请参考毕赤酵母表达操作手册。
实施例3重组葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的发酵
(1)重组葡萄糖氧化酶在摇瓶水平的大量表达
将筛选出的酶活较高的转化子接种于300mlbmgy液体培养基中，30℃，220rpm摇床振荡培养48h，进行菌体富集；4,500rpm离心5min，轻柔弃上清，将菌体转接到100ml含有0.5％甲醇的bmmy液体培养基中，30℃，220rpm诱导培养72h。诱导培养期间，每间隔24h补加一次甲醇溶液以补偿甲醇的损失，使甲醇终浓度保持在0.5％左右；12,000×g离心10min，收集上清发酵液，检测酶活性并进行sds-page蛋白电泳分析。
(2)重组葡萄糖氧化酶的纯化
收集摇瓶表达的重组葡萄糖氧化酶上清液，首先利用10kda膜包进行浓缩，此过程中低盐缓冲液置换了发酵液中的培养基，然后用10kda超滤管进一步的浓缩。浓缩能稀释到一定倍数的重组cngoda，通过离子交换层析进行纯化。具体地，取cngoda浓缩液2.0ml经预先用20mmpbs(ph6.9)平衡过的hitrapqsepharosexl阴离子柱，然后用0-1mol/l的nacl进行线性梯度洗脱，对分步收集的洗脱液检测酶活性和进行蛋白浓度的测定。
实施例4重组葡萄糖氧化酶部分性质分析
采用分光光度法对本发明的葡萄糖氧化酶进行酶活测定。具体方法如下：在ph6.0，30℃条件下，5ml的反应体系包括2.5ml邻联茴香胺缓冲液，0.3ml18％的葡萄糖溶液，0.1ml90u/ml辣根过氧化物酶，0.1ml适当的稀释酶液，反应3rnin，加入2ml2m硫酸终止反应，冷却后测定od540吸光值。葡萄糖氧化酶活性单位定义：在一定条件下，每分钟能将lμmolβ-d-葡萄糖氧化生成d-葡萄糖酸和过氧化氢的酶量为1个活性单位(u)。
(1)葡萄糖氧化酶cngoda的最适ph及ph稳定性
经纯化的实施例2葡萄糖氧化酶样品在不同ph值下测定酶活以确定其最适反应。配制不同ph值所用缓冲液：ph1.0～3.0甘氨酸-盐酸缓冲液；ph3.0～8.0的柠檬酸-磷酸氢二钠系列缓冲液及ph8.0～l0.0甘氨酸-氢氧化钠系列缓冲液，用不同ph值的缓冲液来配制邻联茴香胺溶液。30℃下测定的最适ph结果(图1)表明：cngoda的最适ph为7.0，在ph6.0-ph8.0范围内，酶活力能够维持在60％以上。
将酶液在不同ph值的缓冲液中于25℃下处理60min，在最适ph下测定酶活性以进行该酶ph稳定性的研究。分析结果表明(图2)ph6.0-ph9.0之间基本稳定，能够维持80％以上的酶活力。经ph5.0和ph10.0处理后酶活力也能分别保持在60％和70％左右，说明该酶具有较良好的ph稳定性。
(2)葡萄糖氧化酶cngoda的最适温度及热稳定性
在ph6.0条件下，测定不同温度(0-55℃)下已纯化葡萄糖氧化酶样品的酶活力。分析实验结果表明，该酶的最适反应温度为30℃，在15-50℃之间依然具有50％以上的酶活力(图3)。
热稳定性测定为葡萄糖氧化酶样品在不同温度(30℃、35℃、40℃)下处理不同时间后，在30℃下进行酶活性测定。热稳定性实验表明(图4)：该葡萄糖氧化酶在35℃下处理60min，剩余酶活在70％以上，但40℃下处理20min后仅剩余约20％的酶活力。
<110>中国农业科学院饲料研究所
<120>一种葡萄糖氧化酶cngoda及其基因与应用
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