本发明属于微生物应用领域病毒培养技术，具体涉及一种病毒液的浓缩方法。
背景技术
生物制药产品如单克隆抗体、重组蛋白、疫苗、血液衍生物和动物产品具有传播感染性病毒的风险，这是由于源材料可能本身污染了病毒或病毒样颗粒。此外，生物制药产品的生产过程易受来自外部来源的病毒污染的影响。因此生物制药产品的制造者需要在他们的制备过程中加入足够的病毒清除步骤以确保他们的产品不含污染的病毒。
病毒清除研究中最常用来定量病毒污染物的病毒测定是组织培养限制剂量50％(tcid50)、空斑形成单位(pfu)和病灶形成单位(ffu)测定。这些测定中的每一个通过将待测试的物质的稀释液暴露于合适的培养细胞来操作。在掺入的进料中可获得的最大病毒滴度受到病毒原液的滴度的限制。监管指南规定进料不应当掺入高于合并体积的10％的病毒原液体积。此外，病毒掺入对单元操作的性能的影响的实际考虑常将病毒掺入的百分比限制至较低的值。在任何情况下，较高滴度的病毒原液使得能够较高滴度地掺入病毒原液，反过来这表示较高滴度的病毒原液使得能够证实高效病毒清除步骤的较高lrv。因此要求指示病毒的滴度需达到106tcid50以上，但不同病毒在细胞上的增殖效果不同，常规的增殖培养不能得到高滴度的病毒，因此需要采取必要的浓缩方式来提高病毒滴度。
作为提高溶液中病毒的浓度、对病毒进行浓缩的方法，有物理方法：如超离心分离法，但是该方法需要昂贵的仪器和漫长的分离时间，且作业中需要大量的劳力。还有化学法，如用硫酸铵、聚乙二醇等沉淀病毒来进行浓缩的方法，但这些方法中，由于使用的试剂或进行沉淀的其它成分对感染细胞有害等原因，存在阻碍后续操作的隐患以及病毒沉淀后还必须进行纯化等繁琐工作。此外，还有使用抗体来浓缩病毒粒子本身的方法，但该方法抑制病毒表面的蛋白质功能，存在对病毒的感染性造成影响的隐患，如将病毒粒子从抗体上分离时，必须使用强酸性条件(ph2～3)进行洗脱，这就存在给病毒粒子造成不适的隐患。
技术实现要素：
本发明的一个目的是提供一种简单易行的病毒液的浓缩方法。
为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种病毒液的浓缩方法，将生物膜放置于器皿中，然后按照1g所述的生物膜的重量加入18～25ml病毒液的量向所述的器皿中加入所述的病毒液，在2～8℃下吸附1～3h后进行冷冻干燥，然后用含1～3wt％胎牛血清的培养基复溶，将所述的生物膜剪碎后匀浆，然后经离心去除生物膜碎片，上清液经过滤得到浓缩后的病毒液。
优选地，所述的生物膜为脱细胞后的生物膜。
本发明中的生物膜可以为羊膜、猪膜等动物膜。
本发明中的病毒可以为细小病毒、呼肠孤病毒等指示病毒。
优选地，所述的病毒液为将病毒接种于细胞，进行细胞培养至90％～100％细胞出现病变，然后经反复冻融使宿主细胞破碎，离心去除细胞碎片，收集上清液即为所述的病毒液。
进一步优选地，所述的病毒液的具体制备方法为：将病毒主代毒种，用不含胎牛血清的培养基稀释8～12倍，然后接种于细胞中，吸附0.5～1.5h使病毒悬液与细胞充分接触，加入含1～3wt％胎牛血清的培养基，进行所述的细胞培养至90％～100％细胞出现病变，然后经反复冻融使宿主细胞破碎，离心去除细胞碎片，收集上清液即为所述的病毒液。
进一步优选地，用于接种所述的病毒的细胞为生长成片的细胞。
优选地，所述的生物膜平铺于所述的器皿中。
优选地，向所述的器皿中加入所述的病毒液后，对所述的器皿进行称重记为w1；向所述的器皿中加入含1～3wt％胎牛血清的培养基复溶后，对所述的器皿进行称重记为w2；控制所述的w2为所述的w1的0.3～0.5倍。
优选地，控制所述的离心的温度为3～5℃，转速为2500～3500rpm，离心时间为8～12min。
优选地，采用0.22μm一次性滤器进行所述的过滤。
由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优势：
本发明的浓缩方法简单易行，浓缩后的病毒液在保持病毒感染能力的同时，提高了病毒滴度(不低于107.0tcid50/0.1ml)，且可获得已分离状态的病毒液，在病毒去除/灭活验证中具有广泛应用前景。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明的基本原理、主要特征和优点，而本发明不受以下实施例的限制。实施例中采用的实施条件可以根据具体要求做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
实施例1
1、细胞传代：从液氮中取出1管冻存的st细胞，在37℃水浴中迅速融化，用无菌移液管吸取1.0ml细胞悬液到15ml无菌离心管中，逐滴滴加含10wt％fbs的mem培养基至5～15ml，吹吸数次，混匀，立即离心(3000rpm，5min)，弃去上清液。再加入10～20ml的10wt％fbs的mem培养基，吹吸数次，混匀后转种于加有10wt％fbs的mem培养基的t25培养瓶中，放置于37℃、5％co2培养箱中培养，培养48h～72h，当细胞长满单层时，备用。
2、病毒的传代培养：从-70℃冰箱(工作病毒库)取出1管冻存的ppv病毒，37℃水浴复溶，用不含fbs的mem培养基作10倍稀释，然后吸取1ml接种于已经长满单层细胞的细胞瓶内，置37℃、5％co2培养箱吸附1h，每15分钟摇动细胞培养瓶1次，让ppv病毒悬液与细胞充分接触。取出细胞培养瓶，加入含5％fbs的mem细胞培养液10～15ml，再放入37℃，含5％co2培养箱孵育。倒置显微镜下观察细胞状态，待90％细胞出现病变即可终止培养，取出。将含有病毒及宿主细胞的培养基，放置于-20℃反复冻融3次破碎宿主细胞，释放病毒。然后，4℃离心(3000rpm，10min)去除细胞碎片，上清液即为所需的病毒悬液。小瓶分装上清液，置于-70℃冰箱冷冻备用。
3、浸泡染毒和冻干：将脱细胞后的羊膜平铺于10cm平皿中，按1:25(g：ml)比例沿平皿壁小心加入上述病毒悬液，使羊膜浸泡于病毒液中，称重后将其于2～8℃冰箱吸附2h后置于冷冻干燥机中冻干。
4、病毒释放：将冻干后的含病毒的羊膜用含2wt％fbs的mem培养基复溶至冻干前重量的一半，剪碎羊膜并匀浆30s，将匀浆悬液置于4℃离心(3000rpm，10min)去除碎片，小心吸出上清并用0.22μm一次性滤器过滤，滤出液即为浓缩后的病毒液。
5、病毒滴度测定：将5组浓缩后的病毒液用含2wt％胎牛血清的mem培养基进行10倍系列稀释至10-8，接种至已种好st细胞的96孔培养板中，每个稀释度各接种8孔，每孔100μl，同时设细胞对照孔，置37℃、5％co2培养箱中培养。在48h和96h时取出换液(含2wt％fbs的mem培养基)，到120h时取出置于显微镜下观察，逐孔记录细胞病变情况，按reed-muench法计算tcid50，结果如下
实施例2
1、细胞传代：从液氮中取出1管冻存的llc-mk2细胞，在37℃水浴中迅速融化，用无菌移液管吸取1.0ml细胞悬液到15ml无菌离心管中，逐滴滴加含10wt％fbs的dmem培养基至5～15ml，吹吸数次，混匀，立即离心(3000rpm，5min)，弃去上清液。再加入10～20ml的10wt％fbs的dmem培养基，吹吸数次，混匀后转种于加有10wt％fbs的dmem培养基的t25培养瓶中，放置于37℃、5％co2培养箱中培养，培养24h～48h，当细胞长满单层时，备用。
2、病毒的传代培养：从-70℃冰箱(工作病毒库)取出一管冻存的reov-3病毒于37℃水浴复溶，用不含fbs的mem培养基作10倍稀释，然后吸取1ml接种于已经长满单层细胞的细胞瓶内，置37℃、5％co2培养箱吸附1h，每15分钟摇动细胞培养瓶1次，让病毒悬液与细胞充分接触。取出细胞培养瓶，加入含5％fbs的dmem细胞培养液10～15ml，再放入37℃，含5％co2培养箱孵育。倒置显微镜下观察细胞状态，待90％细胞出现病变即可终止培养，取出。将含有病毒及宿主细胞的培养基，放置于-20℃反复冻融2～3次破碎宿主细胞，释放病毒。然后，4℃离心(6000rpm，10～30min)去除细胞碎片，上清液即为所需的病毒悬液。小瓶分装上清液，置于-70℃冰箱冷冻备用。
3、浸泡染毒和冻干：将脱细胞后的羊膜平铺于10cm平皿中，按1:25(g：ml)比例沿平皿壁小心加入上述病毒悬液，使羊膜浸泡于病毒液中，称重后将其于2～8℃冰箱吸附2h后置于冷冻干燥机中冻干。
4、病毒释放：将冻干后的含病毒的羊膜用含2wt％fbs的dmem培养基复溶至冻干前重量的一半，剪碎羊膜并匀浆30s，将匀浆悬液置于4℃离心(3000rpm，10min)去除碎片，小心吸出上清并用0.22μm一次性滤器过滤，滤出液即为浓缩后的病毒液。
5、病毒滴度测定：将五组浓缩后的病毒液用含2wt％胎牛血清的dmem培养基进行10倍系列稀释至10-8，接种至已种好llc-mk2细胞的96孔培养板中，每个稀释度各接种8孔，每孔100μl，同时设细胞对照孔，置37℃、5％co2培养箱中培养。每隔72h取出换液(含2wt％fbs的dmem培养基)，到7d时取出置于显微镜下观察，逐孔记录细胞病变情况，按reed-muench法计算tcid50。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。