本发明涉及生物免疫
技术领域：
，涉及一种兔胎儿成纤维细胞的新用途，尤其涉及一种利用兔胎儿成纤维细胞制备玉米赤霉烯酮单克隆抗体的方法。
背景技术：
玉米赤霉烯酮(zearalenone，zen)，又称f2毒素，是由禾谷镰刀菌等菌种产生具有雌激素作用真菌毒素。zen首先从赤霉病玉米中分离出，故命名为“玉米赤霉烯酮”，是玉米赤霉菌的代谢产物，其化学名为6-(10-羟基-6氧基-十一碳烯基)β-雷锁酸内酯，广泛存在于霉变的玉米、高粱、小麦、燕麦、大麦等谷类作物以及奶中，产生玉米赤霉烯酮最常见菌属是禾谷镰刀菌，此外为三线镰刀菌、木贼镰刀菌、雪腐镰刀菌、粉红镰刀菌等，对人类和动物可产生多种毒副作用。zen具有类雌激素样作用、生殖发育毒性、免疫毒性、细胞毒性、肝毒性，对肿瘤产生也有一定影响，还可导致动物的生产性能下降、免疫抑制，给畜牧业带来了很大的经济损失，甚至会对人类和动物的健康造成严重的危害。谷实类原料在田间、收获过程、收获后储藏期间以及饲料和食品成品储存、使用等诸多环节中，都有可能受到zen的污染，placinta等(1999)对二十多个国家的谷物和动物饲料及饲料原料中的霉菌毒素污染情况作了调查研究，发现大多数国家的谷物和动物饲料中都不同程度地受到zen的污染。目前大多数国家对食品、谷物、饲料中zen含量都有十分严格规定，如澳大利亚规定黑麦中zen含量不得超过60μg/kg；意大利规定谷物和谷类产品中zen含量不能超过100μg/kg；法国规定植物油和谷类中zen含量必须低于200μg/kg。我国《gb2715–2005粮食卫生标准》规定供人食用小麦、玉米中zen不超过60μg/kg，《gb13078.2–2006饲料卫生标准》规定饲用玉米和配合饲料中zen最大含量为500μg/kg。zen污染饲料和食品后，不仅使农业经济受到严重影响，且还会带来严重食品安全问题，威胁到人类健康。因此，为了确保食品和饲料安全，对zen进行快速、灵敏而准确测定非常重要。目前检测zen的方法主要有薄层色谱法(tlc)、高效液相色谱法(hplc)、液相色谱-质谱法(lc-ms)、气相色谱-质谱法(gc-ms)、胶体金和酶联免疫吸附法(elisa)等。采用色谱分析需要昂贵的仪器，复杂的样品预处理(净化，浓缩或衍生)和大量的有机溶剂和其他化学品，操作人员要求高，不能满足基层单位大规模筛选和现场抽检的需要；而胶体金和酶联免疫吸附法属于免疫学范围，具有简便、灵敏、快捷、成本低、适合大批量检测等特点，尤其适合我国很多生产企业单位的自检和抽查快检，以及适于现场样品的大量筛查等，近年来备受人们的关注。免疫学方法的基础在于抗体的获得，目前国内该类抗体的制备技术还仍然是传统的杂交瘤细胞技术，饲养层细胞主要是小鼠来源的各种细胞(如腹腔巨噬细胞、小鼠成纤维细胞等)，每次使用需饲养并处死大量小鼠，浪费资源，不利于动物保护，因此，提供一种新的鼠源杂交瘤细胞的饲养层细胞，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。技术实现要素：针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种利用兔胎儿成纤维细胞制备玉米赤霉烯酮单克隆抗体的方法，采用兔胎儿成纤维细胞作为饲养层细胞进行小鼠杂交瘤细胞培养，能够在促进单克隆杂交瘤细胞的生长，同时该成纤维细胞可冻存后复苏多次使用，无需每次动物组织分离培养，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。为达此目的，本发明采用以下技术方案：第一方面，本发明提供一种兔胎儿成纤维细胞用于培养鼠源杂交瘤细胞的用途。所述培养例如可以是将兔胎儿成纤维细胞用作鼠源杂交瘤细胞的饲养层细胞进行培养。本发明中，所述的饲养层细胞为两周龄的兔胎儿成纤维细胞，该成纤维细胞为贴壁细胞，形状成梭形长条状，细胞群呈不规则三角形、漩涡状或放射状排列。本发明中，发明人深入研究胚胎干细胞领域与单克隆抗体领域的技术知识，考虑到胎儿成纤维细胞可以作为一种干细胞进行培养，干细胞具有无限增殖的能力，能够进行反复地传代培养，创造性地将胚胎干细胞中惯用的兔胎儿成纤维细胞应用于单克隆杂交瘤细胞的培养过程，兔和小鼠均属于啮齿目，但属于不同的种属，利用不同种属间的细胞共生培养的方法来制备单克隆抗体，目前国内外未见报道；发明人利用了替代小鼠来源的兔胎儿成纤维细胞作为饲养层细胞，该饲养细胞为兔胎儿成纤维细胞，能够提供小鼠杂交瘤细胞生长所必须的养分，产生效价高、特异性强的抗体，同时供细胞母兔正常存活，避免动物杀生，动物保护福利；一次获取的兔胎儿成纤维细胞系，能够反复地进行冻存和传代，每次制备单克隆抗体无需重新获取饲养细胞，方便、简单，同时也为其它单克隆抗体的制备提供了实验基础，为其它动物来源的饲养层细胞制备单克隆抗体提供了新思路。优选地，所述兔胎儿成纤维细胞取自剖腹产的兔胎儿。优选地，所述兔胎儿的周龄为1-3周，例如可以是1周、2周或3周，优选为2周。优选地，所述兔胎儿成纤维细胞的获取方法包括如下步骤：(1)取妊娠1-3周的母兔并进行麻醉；(2)手术刨宫产取出兔胎儿；(3)去除步骤(2)取出的兔胎儿的头、四肢和内脏后，将剩余组织剪碎并消化成单细胞；(4)将步骤(3)得到的细胞接种并培养后冻存备用。优选地，步骤(1)所述的妊娠时间为7-21天，进一步优选为10-15天，再进一步优选为14天。优选地，步骤(1)所述麻醉的步骤为：阿托品皮下注射0.5-2mg/kg体重，间隔10-20min，舒泰-50肌肉注射5-20mg/kg体重。优选地，所述间隔时间例如可以是10min、11min、13min、15min、17min、19min或20min。优选地，所述阿托品的注射量为0.5-2mg/kg体重，进一步优选为1mg/kg体重。优选地，所述舒泰-50的注射量为5-20mg/kg体重，进一步优选为7.5mg/kg体重。优选地，步骤(3)所述剪碎的大小为0.5-2mm3，例如可以是0.5mm3、1mm3、1.5mm3或2mm3。优选地，步骤(3)所述消化的方法为酶消化法，优选为胰酶消化法；优选地，步骤(4)所述细胞接种的密度为1×105-5×106个/ml，优选为5×105个/ml。具体地，兔成纤维细胞的获取：人工辅助兔交配，妊娠两周兔，皮下注射阿托品，数分钟后耳缘静脉注射舒泰-50(zoletil-50)，剖腹产取出胎儿，d-hank’s洗涤2次，去除头、四肢、内脏后，将剩余部分组织剪碎成约1mm3大小，d-hank’s洗涤3次；加入消化液，移液管反复吹打消化；待溶液浑浊后，静置1min，取上层浑浊液于另一洁净离心管，d-hank’s液离心洗涤2次，细胞计数并用培养液(含dmem/f12+10％fbs)调整密度接种于六孔板和培养瓶中，置co2培养箱中，37℃、5％co2、饱和湿度下静置培养，剩余未消化组织重复上述步骤再次消化，直至组织块基本消失。所述的兔胎儿成纤维细胞获取方法采用胰酶消化法，最终得到原代胎儿成纤维细胞进行部分冻存备用，部分用于杂交瘤细胞的饲养层细胞。优选地，所述培养鼠源杂交瘤细胞的方法包括如下具体步骤：(1)制备已含100μl/孔的兔胎儿成纤维细胞的96孔板；(2)用培养液稀释杂交瘤细胞，每个浓度的细胞悬液以100μl/孔的量分别加入步骤(1)得到的96孔板的4列共32个孔中；(3)培养4-5天在倒置显微镜下可见克隆长出，记录下每孔中克隆生长情况；(4)培养7-10天，根据克隆生长快慢，抽取培养上清液进行检测。具体步骤如下：(1)取状态良好的兔胎儿成纤维细胞，作为饲养层细胞，制备已含100μl/孔的兔胎儿成纤维细胞的96孔板；(2)用含14％胎牛血清的ht培养液(第一次亚克隆用ht培养液，以后的亚克隆均不需要加入ht，仅用含14％小牛血清的rpmi1640培养液即可)稀释细胞(第一次亚克隆分别为40个/ml、20个/ml和10个/ml；第二次及以后的亚克隆分别为20个/ml、10个/ml和5个/ml)，每个浓度的细胞悬液以100μl/孔的量分别加入4列共32个孔中(该96孔板为步骤1所制备的已含100μl/孔饲养细胞的孔板)(每4列为同一细胞浓度，自左至右，浓度递减)；(3)培养4-5天在倒置显微镜下可见克隆长出，记录下每孔中克隆生长情况(数量及大小)；(4)培养7-10天，根据克隆生长快慢，抽取培养上清液进行检测(上清检测包括阳性筛选及阻断实验，第三次亚克隆后保种上清要选择性初步测定ic50)。所述杂交瘤细胞培养方法为采用本发明上文所述兔胎儿成纤维细胞作为杂交瘤细胞的饲养层细胞，从而促进杂交瘤细胞的生长和克隆化。第二方面，本发明提供一种鼠源杂交瘤细胞，所述鼠源杂交瘤细胞采用兔胎儿成纤维细胞培养得到。优选地，所述鼠源杂交瘤细胞分泌玉米赤霉烯酮单克隆抗体。第三方面，本发明提供一种玉米赤霉烯酮单克隆抗体，所述玉米赤霉烯酮单克隆抗体由第二方面所述的鼠源杂交瘤细胞分泌得到。所述单克隆抗体可由动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞培养与克隆化、小鼠腹腔诱生和腹水纯化等过程制备得到。第四方面，本发明提供一种如第二方面所述的鼠源杂交瘤细胞和/或如第三方面所述的玉米赤霉烯酮单克隆抗体用作制备免疫胶体金检测试剂盒和/或药物。第五方面，本发明提供一种如第二方面所述的鼠源杂交瘤细胞、如第三方面所述的玉米赤霉烯酮单克隆抗体或如第四方面所述的试剂盒和/或药物用于检测食品、农产品或者环境样品中的玉米赤霉烯酮污染。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明提供的兔胎儿成纤维细胞作为鼠源杂交瘤细胞的饲养层细胞的新用途，采用兔胎儿成纤维细胞作为饲养层细胞进行小鼠杂交瘤细胞培养，能够在促进单克隆杂交瘤细胞的生长，产生效价高、稳定性好、特异性强的单克隆抗体，同时该成纤维细胞可冻存后复苏多次使用，无需再次进行动物组织分离培养，方法简单，成本低廉，制备出能够用于快速、灵敏、经济、高效的玉米赤霉烯酮免疫检测的单克隆抗体，对食品、农产品或者环境样品的检测具有重大价值，同时母兔正常健康存活，起到了社会动物福利作用，也为其它新的抗体制备奠定了基础，提供了新的思路。附图说明图1为兔胎儿成纤维细胞图，分辨率为100×。具体实施方式为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。实施例1动物免疫1.1选用6-8周龄的雌性balb/c小鼠，每组免疫4只。1.2免疫原的处理用无菌生理盐水稀释免疫原，加入等体积的佐剂混合，佐剂在使用前须振摇，使其充分混匀(可溶性抗原，第一次使用福氏完全佐剂，以后免疫使用福氏不完全佐剂，冲击免疫不使用佐剂)，皮下注射200μl/只，其中100μl为佐剂。1.3小鼠的免疫：按照表1的程序进行小鼠免疫。表1免疫小鼠程序表实施例2饲养层细胞的获取人工辅助兔交配，妊娠两周兔，皮下注射阿托品1mg/kg体重，15分钟后耳缘静脉注射舒泰-50(zoletil-50)7.5mg/kg体重，剖腹产取出胎儿，d-hank’s洗涤2次，去除头、四肢、内脏后，将剩余部分组织剪碎成约1mm3大小，d-hank’s洗涤3次；加入5ml消化液(0.05％胰酶+0.04％edta)，移液管反复吹打消化15min；待溶液浑浊后，静置1min，取上层浑浊液于另一洁净离心管，d-hank’s液离心洗涤2次，细胞计数并用培养液(含dmem/f12+10％fbs)调整密度5×105个/ml，接种于六孔板和培养瓶中，置co2培养箱中，37℃、5％co2、饱和湿度下静置培养，剩余未消化组织重复上述步骤再次消化，直至组织块基本消失，显微镜下观察兔胎儿成纤维细胞，结果如图1所示；由图1可知，兔胎儿成纤维细胞呈梭形长条状，细胞群呈不规则三角形、漩涡状或放射状排列。实施例3细胞融合3.1细胞复苏(1)从液氮罐中取出骨髓瘤细胞冻存管，立即浸入39℃温水中，并不时摇动令其尽快融化；(2)从水浴中取出冻存管，在无菌条件下打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加入到15ml无菌离心管中，并加入10mlrpmi1640不完全培养液，混匀；(3)室温1100rpm离心5min；弃上清液，加入rpmi1640完全培养液ⅰ重悬细胞为均悬液，调整细胞密度，接种培养皿，37℃、5％co2孵箱培养；(4)根据细胞生长状态，更换一次rpmi1640完全培养液ⅰ，继续培养。3.2制备新鲜骨髓瘤细胞(1)培养骨髓瘤细胞至对数生长期，确保其形态良好(圆润，透亮)；(2)收集培养的骨髓瘤细胞：弃培养上清液，再用无菌移液管吸取10mlrpmi1640不完全培养基轻轻吹打细胞，将洗下的细胞悬液置于15ml无菌离心管中，细胞计数(白细胞计数法)，确保每只小鼠注射细胞数量约为1000万，1100rpm室温离心5min；(3)重悬骨髓瘤细胞(用无菌吸管吸尽上清液，轻轻敲打桌面使沉淀细胞松散，用500μlrpmi1640不完全培养基重悬细胞)；(4)背部皮下多点注射骨髓瘤细胞；(5)注射10-15天后将小鼠断颈处死，浸泡于0.1％新洁尔灭中消毒5-15min，在无菌条件下，用无菌眼科剪剪开皮肤；(6)用无菌眼科剪及眼科镊取出肿瘤，置于rpmi1640不完全培养液中清洗三次，除去其表面包膜；(7)用眼科剪将肿瘤剪碎，置于碾磨杵内，碾磨成细胞悬液(边研磨边滴加rpmi1640不完全培养液，共10ml左右)；(8)上述骨髓瘤细胞悬液沿管壁缓慢加入到淋巴细胞分离液中(22℃温浴5-10min，骨髓瘤细胞体积为淋巴细胞分离液体积的2倍)，1800rpm室温(22℃左右)离心20min；(9)轻轻取出离心管，可见自下往上依次为：红细胞层、粒细胞层、淋巴细胞分离液、骨髓瘤细胞层、rpmi1640不完全培养液；(10)小心吸尽上层rpmi1640不完全培养液，吸出骨髓瘤细胞并转入另一无菌离心管中，加入10mlrpmi1640不完全培养液1100rpm，室温离心5min，用10mlrpmi1640不完全培养液重悬清洗好的骨髓瘤细胞，轻柔混匀并计数(白细胞计数法)。3.3脾内冲击免疫制备免疫脾细胞(1)第14天取小鼠血清进行效价检测，第18天后挑选血清效价高的小鼠，进行冲击免疫；(2)免疫剂量：抗原100μl/只，不加佐剂，用无菌生理盐水稀释，脾内注射；脾内注射方法：采用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠(先用无菌生理盐水将戊巴比妥钠配制至终浓度为6.7mg/ml，注射剂量为0.01ml/g体重)；腹腔注射后，小鼠烦躁，呼吸急促，行动不便，10-15min后无翻转能力，此时用透明胶带将小鼠右侧卧位固定；用无菌镊将其外表皮夹起，用无菌眼科剪剪开(不可剪破腹膜)；在腹膜下可见紫红色脾脏，用无菌注射器将抗原缓慢注入脾脏(且注且退，缓慢出针)；用手术缝合线及缝合针缝合小鼠外表皮；将缝合好的小鼠置于22-24℃环境中，准备充足鼠粮及灭菌饮水，待其自然苏醒。3.4细胞融合及杂交瘤的培养(1)制备免疫脾细胞悬液：采用与免疫品系相同的小鼠，常用6-10周龄balb/c雌性小鼠；眼眶取血，断颈处死小鼠，浸泡于0.1％新洁尔灭中消毒5-15min。在无菌条件下，用无菌眼科剪剪开皮肤，暴露脾脏；用无菌眼科剪及眼科镊取出脾脏，置于rpmi1640不完全培养液中清洗三次，除去其表面的筋膜及结缔组织；将脾脏置于平皿中不锈钢筛网(150目)上，用眼科剪将其剪碎，用无菌注射器推杆研磨成细胞悬液(边研磨边滴加1640不完全培养液，共10ml左右，少量多次冲洗筛网)；收集脾细胞悬液，轻柔混匀并计数(红细胞计数法)；1400rpm离心6min，收集脾细胞；弃尽上清液，用含14％胎牛血清的hat选择性培养液重悬细胞(先将离心管轻轻敲击桌面使沉淀细胞松散，再用少量hat培养液使细胞分散均匀。(2)将骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按1:5-1:10的比例混合装入50ml无菌离心管，1200rpm室温离心6min；用无菌吸管吸尽残留液体；将离心管轻轻敲击手心，使细胞松散；分别加入(边加边旋转搅拌)37℃预热好的peg溶液(1.2mlpeg/次融合)及rpmi1640不完全培养液，速度及步骤如下表2：表2细胞融合流程表时间步骤0-1min缓慢加入peg溶液1-1.5min轻轻旋转离心管，搅拌细胞悬液1.5-2.5min缓慢加入1mlrpmi1640不完全培养液2.5-3.5min缓慢加入1mlrpmi1640不完全培养液3.5-4.5min缓慢加入2mlrpmi1640不完全培养液4.5-5.5min缓慢加入2mlrpmi1640不完全培养液5.5-6.5min缓慢加入9mlrpmi1640不完全培养液(3)1100rpm室温离心6min；弃尽上清，用少量含14％胎牛血清的hat培养液重悬细胞；将上述悬液加入含14％胎牛血清的hat培养液(终体积为130-160ml)；用八道移液器将上述融合细胞悬液按100μl/孔的量加入已制备完成的96孔饲养层细胞培养板中(每块细胞培养板选e1、f1、g1、h1四孔做为对照孔，其中e1、f1两孔加入100μl含14％胎牛血清的hat培养液重悬的sp2/0细胞，g1、h1两孔加入100μl含14％胎牛血清的hat培养液)；将上述96孔细胞培养板放入37℃、5％co2孵箱培养。(4)融合细胞的培养：在细胞融合后培养4天更换新鲜hat选择性培养液(含14％胎牛血清)(吸液时动作轻缓，每孔更换200μl)；待培养至7天时，观察sp2/0细胞对照孔内细胞生长状态，如果全部死亡，则将培养液更换为ht培养液(含14％胎牛血清)(吸液时动作轻缓，每孔更换200μl)(sp2/0细胞未全部死亡则应推迟更换ht培养液时间)。(5)融合细胞上清的筛选：在杂交瘤细胞克隆大小约占孔底1/10-1/5面积时(培养时间约为10-13天)，挑选上清进行检测；半抗原融合细胞上清检测先进行阳性克隆筛选，再进行阳性克隆阻断实验；当阳性孔很多时，挑选细胞圆润，透亮，且上清od值较高，半抗原阻断较好的10个阳性孔进行第一次亚克隆。部分融合细胞上清检测结果如下表3-表6：表3zen融合细胞上清检测结果第一板0.1090.1030.1160.1080.1160.1090.1030.1020.1050.1130.110.1170.10.1020.1110.0930.1110.1280.1020.0910.0880.0930.0980.1180.1050.1080.1830.1730.0950.1130.110.0880.1530.0860.133阳1.1270.1090.1020.10.0890.1010.110.0960.0990.1120.1130.1阳1.0920.1060.1040.1080.10.0960.1150.120.1060.1040.1180.103空0.1140.10.0950.1140.0830.0970.0960.0890.0890.0920.1030.086空0.0990.1520.1230.1290.1280.1070.1160.1180.1280.1230.120.143阴0.1220.1050.0960.1140.0930.0980.0960.1450.10.0920.1070.098阴0.106表4zen融合细胞上清检测结果第四板0.1150.1160.1090.120.1050.1150.1260.1280.1160.1670.132阴0.1490.1340.1140.130.1140.1310.1110.1170.1050.1180.1340.123阴0.1460.1390.1390.1310.1320.1180.1230.1340.120.1330.1420.146空0.1580.1480.130.1390.1160.1120.1150.1180.1310.1430.1220.12空0.1510.1320.1330.1310.110.1230.1230.1340.1110.1210.1250.141阳0.9010.1360.1290.130.1250.1440.1290.1250.1410.1220.1450.123阳0.9650.1440.1440.1460.1380.1250.1160.1330.1230.1280.1360.1450.1340.1210.1420.1340.1250.130.1180.1390.1310.1330.130.0910.090.0910.0860.0860.0810.0840.0860.0880.0850.085表5zen融合细胞上清检测结果第六板0.0920.0880.0930.090.0950.0950.0960.0970.1010.1170.117阴0.1380.0830.0830.0880.0750.0840.0830.0840.090.1010.1320.084阴0.1570.0860.0820.0810.0840.0820.0810.0880.0920.0980.0940.098空0.1580.1370.0950.1030.0840.1530.0920.090.1110.1090.1060.114空0.1310.0840.0840.0930.1050.1020.1030.1060.1150.1050.1120.113阳0.610.0870.0850.1050.1090.0910.1030.0910.0940.1720.1010.102阳0.5980.0860.0940.0930.0960.110.0940.0950.0980.0980.10.1190.090.0810.0870.0850.0870.1020.0860.0850.0850.0980.10.0850.0890.0750.0860.0850.0920.0990.0940.1210.1320.096阳0.921表6zen融合细胞上清检测结果第十一板0.0810.0850.0870.0810.0830.0880.0980.0940.0870.0940.1040.1070.0730.0730.0770.0720.070.0790.0740.0810.0790.0830.080.0980.0730.0750.0840.0780.0790.0740.0870.0820.080.0810.104阳1.0340.0790.0790.0790.080.0830.0770.0960.0830.0830.0820.166阳1.1530.0830.0860.0850.0830.0890.0940.0860.1080.0880.0870.097空0.0990.0810.0790.0840.0780.0820.0850.0880.0940.0840.0850.096空0.0950.0830.0790.0860.0920.1280.0910.0950.0940.2680.0940.103阴0.0980.0860.090.0870.0810.0780.0880.0910.0950.0850.090.094阴0.090.0880.1080.1280.1170.1040.0990.0980.1680.1130.098h实施例4细胞克隆化(有限稀释法)4.1兔胎儿成纤维细胞复苏，作为饲养层细胞。4.2用含14％胎牛血清的ht培养液(第一次亚克隆用ht培养液，以后的亚克隆均不需要加入ht，仅用含14％小牛血清的rpmi1640培养液即可)稀释细胞(第一次亚克隆分别为40个/ml、20个/ml和10个/ml；第二次及以后的亚克隆分别为20个/ml、10个/ml和5个/ml)，每个浓度的细胞悬液以100μl/孔的量分别加入4列共32个孔中(该96孔板为步骤1所制备的已含100μl/孔饲养细胞的孔板)(每4列为同一细胞浓度，自左至右，浓度递减)；4.3培养4-5天在倒置显微镜下可见克隆长出，记录下每孔中克隆生长情况(数量及大小)；4.4培养7-10天，根据克隆生长快慢，抽取培养上清液进行检测(上清检测包括阳性筛选及阻断实验，第三次亚克隆后保种上清要选择性初步测定ic50)；4.5第一次亚克隆检测后，挑选od值高、细胞状态好且有阻断作用的单克隆进行第二次亚克隆，步骤如前；4.6第二次亚克隆后，挑选od值高、细胞状态好且有阻断作用的单克隆进行第三次亚克隆，步骤如前；第三次亚克隆孔全部为阳性，则可进行最后的细胞扩增培养及冻存，建立一个新的细胞系；如果第三次亚克隆不是全阳，挑选其中细胞状态好的单克隆进行复检后酌情考虑；4.7在细胞上清筛选阳性后到第三次亚克隆前的各个阶段的细胞均需扩增培养冻存(-70℃冰箱)；4.8三亚后拟冻存细胞需进行全面检测，筛选最好的单克隆细胞株进行保种(同一单克隆细胞系最终冻存6-8支即可)；第一次亚克隆的检测结果见表7；表7zen第一次亚克隆细胞上清检测结果经过第一次亚克隆后，9b3为全阴，4f9及7d7均有阳性单克隆孔。挑选相应孔细胞上清液进行阻断实验，结果见表8；表8zen第一次亚克隆单克隆细胞上清阻断实验结果标品浓度：ng/ml0.9011.3591.6440.5191.6961.2821.0130.682阳1.34400.2750.3830.3520.3160.4630.3160.2450.248阳1.4524001.6171.2981.3541.5581.2591.621.0020.742空0.21300.4150.3410.3560.4290.2870.390.2610.23空0.2134001.3541.5441.5021.3491.630.5760.9760.653阴0.21400.3250.3940.4010.3030.3820.2370.2750.229阴0.2074000.4891.4730.6231.2641.7441.4420.9241.731标0.2500.2450.410.2710.3540.4030.2590.250.442标0.239400由表8可知，经过第一次亚克隆后，4f9及7d7的阳性单克隆孔细胞上清均有较好的阻断效果；结合克隆细胞生长状态，挑选相应孔细胞进行第二次亚克隆，上清检测结果见表9；表9zen第二次亚克隆上清检测实验结果(部分)由表9可知，经过第二次亚克隆后，4f9的阳性单克隆孔细胞效价较低，细胞生长状态较差，7d7的阳性单克隆孔细胞有较高的效价，克隆细胞生长状态较好。结合效价及细胞状态，挑选相应孔细胞进行第三次亚克隆，上清检测结果见表10；表10zen第三次亚克隆上清检测实验结果由表10可知，经过第三次亚克隆后，除7d7-e3-b12和7d7-g10-h12外，其余八板均为整板阳性，可进行保种冻存工作；故仅挑选这八板中的强阳性单克隆细胞上清进行阻断实验以指导后续工作，阻断实验结果见表11；表11zen第三次亚克隆单克隆上清阻断实验结果由表11可知，7d7系列细胞株培养上清液效价较高且阻断效果良好，进行最后保种。实施例5细胞复苏与冻存5.1细胞复苏在记录本中找出要复苏的细胞在液氮罐的位置；将冻存管从液氮罐中取出，立即用镊子夹起放入加热至39℃的水浴锅中，不断振荡冷冻管，待管内的冻存液完全溶化后，取出于超净台上操作；取10mlrpmi1640培养液于15ml无菌离心管中，再把冻存管中的冻存液移入，混匀离心管里的细胞液；1100rpm离心5min；弃上清，在超净台上轻敲离心管底部，先用少量的含14％的小牛血清的rpmi1640培养液将细胞吹散，再加入适量的含14％的小牛血清的rpmi1640培养液，吹打均匀；将细胞液加入6孔板中的4个孔；将细胞放于二氧化碳培养箱中培养。5.2细胞冻存将要冻存的细胞弃上清(冻存前一天需更换培养液)；用rpmi1640培养液将细胞从平皿中吹下，吹洗两次，收集细胞悬液于离心管中；1100rpm离心5min；弃上清，尽量除净，轻敲离心管底部，加入300μl的冷冻液将细胞吹散，再加入剩下的冷冻液，按5×106/ml/支分装；写上日期及细胞名称，用封口膜封口；将冷冻管放入泡沫塑料盒内，先将其放于-20℃冰箱4-6h或过夜，再转入-70℃冰箱冻存2天左右，最后按指定位置放入液氮罐，注意在放入液氮罐时动作要迅速，因为液氮容易挥发；还应戴上厚棉手套避免手被冻受伤；定期观察液氮的量，避免液氮量不够而造成细胞的死亡。实施例6小鼠腹水制备6.1取8-10周龄雌性balb/c小鼠(最好是经产的)，每只小鼠腹腔注射灭菌液体石蜡0.5ml；6.27-10天后，每只小鼠腹腔接种5×105-1×106个杂交瘤细胞；6.37-15天产生腹水，分阶段或一次性收集腹水(收集前先用75％酒精擦拭小鼠腹部表皮)；6.4将收集腹水于37℃放置30min，使纤维蛋白凝块析出；6.54000rpm4℃离心30min，收集中间层透明腹水；6.6分装并做好相应标记后，4℃(0.05％硫柳汞)或-20℃(0.05％硫柳汞)保存。实施例7单克隆抗体的纯化7.1预处理：取小鼠腹水经9000rpm，4℃离心10min，去除试管中的漂浮物。(注意：以下操作均须戴一次性手套或乳胶手套，且需保持器皿的清洁，尽可能保持无菌，但无需在无菌条件下操作)7.2将预处理的腹水装入一个烧杯中，室温搅拌条件下，逐滴加入2倍体积的0.06mol/lph5.0醋酸钠缓冲液，用0.1mol/lhcl调整ph至4.5(缓慢加入，用ph试纸检测)。7.3室温搅拌条件下，按照每1ml腹水(指加入醋酸钠缓冲液前预处理腹水的体积)加入33μl正辛酸的比例，逐滴加入所需体积的正辛酸，室温静置30min，4℃静置至少2h。7.4经正辛酸处理的腹水9000rpm，4℃离心30min(如上清中仍有悬浮物，取出上清再离心20min)，离心完成后弃沉淀，取出上清。7.5取出上清，加入十分之一体积的ph为7.4的0.1mol/l的pbs(钠盐)，用1mol/lnaoh缓慢调节ph至7.4。7.6将上述调整ph的腹水于冰浴下预先搅拌10min。按照每毫升加入0.277g硫酸铵的比例，缓慢加入硫酸铵，冰浴搅拌30min，4℃静置过夜；(注意：加入硫酸铵的速度要缓慢，以加入硫酸铵完全溶解后再加入新的固体硫酸铵为标准)7.7次日，将上述处理液加入离心管中，9000rpm，4℃离心1h，弃上清。沉淀用少量的0.017.8经纯化的单克隆抗体用紫外定量(0.74×od280)，并加入等比例甘油，混匀后，按照1ml每管分装，并贴好相应标签(标签上内容包括：抗体编号、品名、浓度、数量、纯化日期、保存方式)，于－20℃保存。取zen纯化后不同浓度的单克隆抗体进行阻断实验，结果见表12；表12zen纯化后不同浓度的单克隆阻断实验结果标品浓度ng/ml00.0980.1970.3950.781.563.1256.2512.52550空白7d7-e4-e11-a70.9030.8670.7410.580.3790.2870.2290.1780.1530.1460.1220.1287d7-e4-e11-a110.9310.80.6910.5710.3690.2610.1920.1690.1420.1290.1250.1397d7-b8-h3-e120.7710.6490.5340.4680.3290.2570.210.1660.160.1470.1780.1847d7-b8-d12-e120.8540.7260.6370.4820.3170.2450.2080.1750.1560.160.1290.171标品浓度ng/ml00.0980.1970.3950.781.563.1256.2512.52550空白7d7-e4-e11-a71.4811.6541.5431.2130.9120.6370.6060.5340.4880.4390.3890.3837d7-e4-e11-a111.4391.2791.2071.1460.8050.530.5160.4720.4220.3710.340.4667d7-b8-h3-e121.5911.5321.4151.4081.1030.6890.5630.4590.3980.3690.3450.3327d7-b8-d12-e121.7671.6971.5931.6111.1020.7120.5170.4520.3780.3890.3870.323标品浓度ng/ml00.0980.1970.3950.781.563.1256.2512.52550空白7d7-e4-e11-a71.8391.5821.5711.530.9350.7160.5510.4440.3530.3940.3640.4627d7-e4-e11-a111.8051.3481.4121.1170.7780.5750.4350.350.2990.2540.2550.2767d7-b8-h3-e121.5331.451.5471.2150.9720.6360.4930.410.4160.2830.2350.2217d7-b8-d12-e121.5321.3751.3641.2130.8250.5930.4410.3550.2690.2530.2730.25由表12可知，以上四个编号的细胞株的单克隆抗体具有良好的阻断效果，其ic50在0.4-1.6ng/ml之间。综上所述，本发明提供的兔胎儿成纤维细胞的新用途，将兔胎儿成纤维细胞作为鼠源杂交瘤细胞的饲养层细胞，能够促进细胞的增长，产生效价高、特异性强的玉米赤霉烯酮抗体，对食品、农产品或者环境样品的检测具有重大价值，同时母兔正常健康存活，起到了社会动物福利作用，也为其它新的抗体制备奠定了基础，提供了新的思路。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属
技术领域：
的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。当前第1页12