一种榧树转录组序列的EST‑SSR标记特异引物及筛选方法与流程

本发明属于分子生物学dna标记技术及应用领域，具体涉及榧树(torreyagrandis)转录组序列的est(expresssequencetag-simplesequencerepeat，表达序列标签)-ssr(简单序列重复)标记的特异引物及筛选方法，属于分子标记技术领域。

背景技术：

榧树(torreyagrandis)隶属于榧属(torreyaarn)，全世界榧属植物共有7种2变种，包括佛罗里达榧(torreyataxifolia)、加州榧(torreyacalifornica)、日本榧(torreyanucifera)、榧树(torreyagrandis)、巴山榧(torreyafargesii)、四川榧(torreyaparvifolia)云南榧(torreyafargesiivar.yunnanensis)和九龙山榧(torreyagrandisfort.exlind.var.jiulongshanensis)，榧树是我国分布最广、栽培利用历史最久、经济价值最高的树种之一。榧树物种种内性状变异复杂，有许多自然变异类型，也包含人工栽培的香榧品种。香榧具有性状稳定、品质优良(种仁含油量达65％左右，不饱和脂肪酸达80％以上)等特点。但目前香榧生产中存在着栽培品种单一、品种退化等突出问题，同时香榧童期长，采用常规杂交育种手段进行良种选育一般需要十几年乃至几十年的时间，这极大地阻碍了香榧良种选育、新品种创制。因此，开发香榧及其榧树种内不同类型的分子遗传标记，检测遗传多样性、研究遗传结构，进而实施分子辅助育种，对于缩短育种进程，提高育种效率都具有十分重要的意义。

ssr是广泛存在于真核和原核生物基因组中的遗传标记，具有共显性、覆盖性广、信息量大、操作简单等优势。已广泛应用于苹果、樱桃、柑橘、葡萄等果树中。传统的ssr引物主要从基因组文库中获得，其步骤复杂、工作量大，开发成本高。近年来，高通量测序技术迅猛发展，est-ssr(微卫星)是ests测序计划的副产物，开发成本较低，共显性遗传，多态性高，重复性及稳定性好，是目前最适合用于种质鉴定分析的标记技术之一。在榧属植物分子标记开发方面，金则新等建立了长叶榧issr-pcr的反应体系，梁丹等人建立了香榧aflp实验体系并利用aflp进行了榧树雌雄株的鉴定，刘浩凯等利用srap技术研究了雌性榧树4个居群的遗传多样性，戴正等用rapd和scar标记鉴定了香榧幼苗的性别，张党权等利用rapd将榧树的几个栽培品种进行了分类。yi等基于1棵香榧树的叶片转录组数据，从4600条unigene中获得1713个ssr位点，设计了108对引物，其中37对引物有扩增产物，19对引物在供试样品中检测到多态性。另外，由于est是功能基因的表达片段，在其中发现的微卫星标记具有直接标记功能基因的优势，并可能同一些生产性状相关联，这对遗传图谱构建以及分子辅助育种都有很高的应用价值。

利用‘细榧’和圆榧种子转录组数据进行的ssr引物标记与开发，可能把香榧重要经济性状与之关联，达到分子辅助育种的目的，并可进一步进行香榧功能基因的研究。目前还未见榧属种间及榧树种内不同类型est-ssr标记的研究报道。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种基于细榧种子转录组序列和圆榧种子转录组序列开发的est-ssr特异引物，基于细榧种子转录组序列和圆榧种子转录组序列开发的est-ssr特异引物具有扩增稳定、电泳条带清晰、多态性丰富等优点，可有效用于榧属种间及榧树种内不同类型遗传多样性分析、品种指纹图谱构建和分子标记辅助选择育种等研究领域。

为实现本发明的发明目的，发明人提供如下技术方案：

发明人首先提供了榧树转录组序列的est-ssr标记特异引物，所述的特异引物分别为：

zafu-1：

f:ggctatgctacacccaaagaa(seqidno.1)，

r：ggggcaccacctattgtatg(seqidno.2)；

zafu-2：

f：tcaaagtgcaaccggtacaa(seqidno.3)，

r:caacaggccaacatggagta(seqidno.4)；

zafu-3：

f：gggttacccccttgctttat(seqidno.5)，

r:ccctactttatttccgtgcg(seqidno.6)；

zafu-4：

f：gaattcccattcccattgtg(seqidno.7)，

r:acccccttctgctctgattt(seqidno.8)；

zafu-5：

f：aatgaatgcgtgttacgctg(seqidno.9)，

r:ttggagcggaaggaataatg(seqidno.10)；

zafu-6：

f:ccaatttgtggagcgtttct(seqidno.11)，

r:tgtggaaaggtggtgaacaa(seqidno.12)；

zafu-7：

f:ttttccaactccaacccttg(seqidno.13)，

r:atgtttggggttgacgtgtt(seqidno.14)；

zafu-8：

f:aattggcccttcattcaaca(seqidno.15)，

r:ctagtgggtgcatttgagcc(seqidno.16)；

zafu-9：

f:ggagcgagcgtagcgtatag(seqidno.17)，

r:gttgctgcatcttcctcctc(seqidno.18)；

zafu-10：

f:gcctggtctgcttcttgttc(seqidno.19)，

r:aggcaaaggctgcaatagaa(seqidno.20)；

zafu-11：

f:acatctgcaaggcaaggttc(seqidno.21)，

r:ttgaattttcaccaggctcc(seqidno.22)；

zafu-12：

f:tgctaatgtttgctttgaatgg(seqidno.23)，

r:aacaacctaaacttttgccgaa(seqidno.24)；

zafu-13：

f:gaaattaaacgcgttcaggg(seqidno.25)，

r:cattgctgtccgtctcgtaa(seqidno.26)；

zafu-14：

f:cacaatcctccattcatcca(seqidno.27)，

r:gccactggtgtgattctcaa(seqidno.28)；

zafu-15：

f:atttgatacgacggaaacgg(seqidno.29)，

r:ggtggtcaatatcccatgct(seqidno.30)；

zafu-16：

f:aaggttgccacctcagtcac(seqidno.31)，

r:acagaacgtctccaaccgac(seqidno.32)。

榧树est-ssr分析的步骤是从发明人实验室细榧种仁转录组数据和圆榧种仁转录组数据采用trinity软件组装，获得转录本序列。组装共得到246862条transcript和142213条unigene。利用misa程序(microsatelliteidentificationtool,http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html)对筛选得到的1kb以上的unigene做ssr位点搜索。对于2-6个碱基重复单元重复次数依次按照重复次数分别为9、8、5、5、5次的微卫星片段进行筛选分离，从而得到含有微卫星重复的ests序列。

对榧树est-ssr设计引物，利用primer3程序在微卫星两端的侧翼序列设计特异引物。引物设计的主要原则：引物长度控制在20bp；退火温度58℃-62℃；上下游引物的tm值相差不大于2℃；pcr产物长度在100-300bp之间；gc含量在40％-60％之间；每个位点产生3对候选引物。

发明人还提供了一种榧树转录组序列的est-ssr标记的筛选方法，包括：首先对细榧种仁和圆榧种仁转录组数据采用trinity软件组装，获得转录本序列，组装共得到246862条transcript和142213条unigene；然后利用misa程序(microsatelliteidentificationtool,http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html)对筛选得到的1kb以上的unigene做ssr位点搜索，对于2-6个碱基重复单元重复次数依次按照重复次数分别为9、8、5、5、5次的微卫星片段进行筛选分离，从而得到含有微卫星重复的ests序列；然后利用primer3程序进行引物设计，引物设计的主要原则：引物长度控制在20bp、退火温度58℃-62℃、上下游引物的tm值相差不大于2℃、pcr产物长度在100-300bp之间、gc含量在40％-60％之间、每个位点产生3对候选引物；最后对est-ssr标记的重复性、稳定性和多态性进行综合评价，得到est-ssr标记，所述的筛选到的est-ssr标记的特异引物分别为：

zafu-1：

f:ggctatgctacacccaaagaa(seqidno.1)，

r：ggggcaccacctattgtatg(seqidno.2)；

zafu-2：

f：tcaaagtgcaaccggtacaa(seqidno.3)，

r:caacaggccaacatggagta(seqidno.4)；

zafu-3：

f：gggttacccccttgctttat(seqidno.5)，

r:ccctactttatttccgtgcg(seqidno.6)；

zafu-4：

f：gaattcccattcccattgtg(seqidno.7)，

r:acccccttctgctctgattt(seqidno.8)；

zafu-5：

f：aatgaatgcgtgttacgctg(seqidno.9)，

r:ttggagcggaaggaataatg(seqidno.10)；

zafu-6：

f:ccaatttgtggagcgtttct(seqidno.11)，

r:tgtggaaaggtggtgaacaa(seqidno.12)；

zafu-7：

f:ttttccaactccaacccttg(seqidno.13)，

r:atgtttggggttgacgtgtt(seqidno.14)；

zafu-8：

f:aattggcccttcattcaaca(seqidno.15)，

r:ctagtgggtgcatttgagcc(seqidno.16)；

zafu-9：

f:ggagcgagcgtagcgtatag(seqidno.17)，

r:gttgctgcatcttcctcctc(seqidno.18)；

zafu-10：

f:gcctggtctgcttcttgttc(seqidno.19)，

r:aggcaaaggctgcaatagaa(seqidno.20)；

zafu-11：

f:acatctgcaaggcaaggttc(seqidno.21)，

r:ttgaattttcaccaggctcc(seqidno.22)；

zafu-12：

f:tgctaatgtttgctttgaatgg(seqidno.23)，

r:aacaacctaaacttttgccgaa(seqidno.24)；

zafu-13：

f:gaaattaaacgcgttcaggg(seqidno.25)，

r:cattgctgtccgtctcgtaa(seqidno.26)；

zafu-14：

f:cacaatcctccattcatcca(seqidno.27)，

r:gccactggtgtgattctcaa(seqidno.28)；

zafu-15：

f:atttgatacgacggaaacgg(seqidno.29)，

r:ggtggtcaatatcccatgct(seqidno.30)；

zafu-16：

f:aaggttgccacctcagtcac(seqidno.31)，

r:acagaacgtctccaaccgac(seqidno.32)。

作为优选，本发明所述的一种榧树转录组序列的est-ssr标记的筛选方法中，所述的特异引物对细榧、榧树雄株、大圆榧、九龙山榧雌株、九龙山榧雄株、长叶榧雌株、长叶榧雄株、巴山榧雄株和日本榧雌株进行pcr扩增，其中：扩增体系总体积为10μl，含10×buffer(mg²⁺)1μl、dntpmix0.8μl、上下游引物各0.5μl、rtaq酶0.05μl、模板0.5μl和ddh2o6.65μl，混合均匀后置于pcr仪中扩增；扩增程序为：95℃预变性5min，然后进行34次循环，每个循环包括94℃变性45s，54-58℃退火30s，72℃延伸1min，最后72℃延伸3min，4℃保存，各个引物的最佳退火温度在预期退火温度上下浮动10℃之间进行优化，直至预期产物清晰单一。

作为优选，本发明所述的一种榧树转录组序列的est-ssr标记的筛选方法中，所述的特异引物对细榧、榧树雄株、大圆榧、九龙山榧雌株、九龙山榧雄株、长叶榧雌株、长叶榧雄株、巴山榧雄株和日本榧雌株进行pcr扩增，pcr产物的检测方法如下：扩增得到的产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳，主要工艺参数为：电压5-10v/cm，15-20分钟；检测扩增产物的特异性后，再用8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，主要工艺参数为：电泳缓冲液为1×tbe，电压180v，电泳90min；然后再用硝酸银染色系统进行检测，分析确定多态性。

作为优选，本发明所述的一种榧树转录组序列的est-ssr标记的筛选方法中，筛选获得重复性好，稳定的多态丰富的微卫星标记，其步骤是利用至少两个转录组分析得到的多态引物，继续用大量个体检测其重复性和稳定性，同时得到其多态特征。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明可方便快捷的用于做榧属种间及榧树种内不同类型种质资源和遗传多样性的分析，分子种群遗传学、种质资源的鉴定、遗传图谱构建和功能基因的研究，进一步用于榧树的分子设计育种和资源调查。

附图说明

图1是zafu-1在est-ssr标记的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果，

图2是zafu-2在est-ssr标记的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果，

图3是zafu-3在est-ssr标记的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果，

图4是zafu-4在est-ssr标记的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果，

图5是zafu-5在est-ssr标记的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果，

图6是zafu-6在est-ssr标记的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果，

图7是zafu-7在est-ssr标记的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果，

图8是zafu-8在est-ssr标记的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果，

图9是zafu-9在est-ssr标记的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果，

图10是zafu-10在est-ssr标记的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果，

图11是zafu-11在est-ssr标记的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果，

图12是zafu-12在est-ssr标记的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果，

图13是zafu-13在est-ssr标记的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果，

图14是zafu-14在est-ssr标记的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果，

图15是zafu-15在est-ssr标记的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果，

图16是zafu-16在est-ssr标记的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果，

图中，1细榧2榧树雄株3大圆榧4九龙山榧雌株5九龙山榧雄株6长叶榧雌株7长叶榧雄株8巴山榧雄株9日本榧雌株，marker所用的是1000bp的。

具体实施方式

下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。若无特别指明，实施例采用的方法为本领域通用技术。

实施例中主要材料、试剂和仪器设备说明：

眼科剪，镊子，1.5ml离心管，微量移液器、微量移液器枪头。脱氧核糖核苷酸dntp，热聚合taq酶，小型离心机(qspin^tm，baygene)，涡旋振荡器(ql-866型，qilinebeier)，ph计(mettlertoledo320phmeter)、高压蒸气灭菌锅(sanyo)、电泳仪(dyy-6c型，北京六一)、电泳仪(dyy-12c型，北京六一)、dna序列分析电泳仪(dycz-20c型，北京六一)、调速多用振荡器(hy-2型，上海国华)、水浴锅(上海精宏)、凝胶成像系统(bio-radgd2000)、pcr仪(abiveriti96wellthermalcycler)。

本发明的样本细榧、榧树雄株、大圆榧、九龙山榧雌株、九龙山榧雄株、长叶榧雌株、长叶榧雄株、巴山榧雄株和日本榧雌株。9个榧树单株中，巴山榧雄株，采自湖北省保康县；长叶榧雌雄株，采自浙江省桐庐县；九龙山榧雌雄株，采自浙江省遂昌县；日本榧雌株，采自江苏省南京市；细榧，大圆榧和榧树雄株采自浙江省杭州市富阳区。

本发明实施例所用的常规药品苯酚氯仿抽提液(25:24:1)，甲醛，氢氧化钠(分析纯)，硝酸银，氯化钠(分析纯)，尿素，丙烯酰胺，甲叉，tris-碱，硼酸，乙二胺四乙酸(edta)，过硫酸铵，十二烷基硫酸钠(sds)，无水乙醇购自国药集团琼脂糖，溴化乙锭，去离子甲酰胺，temed，蛋白酶k等购自takara公司，脱氧核糖核苷酸dntp，热聚合taq酶购自tiangen公司，质粒文库测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；

本发明实施例所用主要仪器包括：小型离心机(qspin^tm，baygene)，涡旋振荡器(ql-866型，qilinebeier)，ph计(mettlertoledo320phmeter)、高压蒸气灭菌锅(sanyo)、电泳仪(dyy-6c型，北京六一)、电泳仪(dyy-12c型，北京六一)、dna序列分析电泳仪(dycz-20c型，北京六一)、调速多用振荡器(hy-2型，上海国华)、水浴锅(上海精宏)、凝胶成像系统(bio-radgd2000)、pcr仪(abiveriti96wellthermalcycler)。

实施例中未注明具体条件的实验方法，是按照常规条件，例如sambrook等作者的分子克隆实验室手册(newyork：coldspringharborlaboratorypress，1989)中所述的。

实施例1

1、ssr位点的来源和est-ssr序列的筛选

发明人从实验室细榧种仁转录组数据和圆榧种仁转录组数据采用trinity软件组装，获得转录本序列。组装共得到246862条transcript和142213条unigene。利用misa程序(microsatelliteidentificationtool,http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html)对筛选得到的1kb以上的unigene做ssr位点搜索。对于2-6个碱基重复单元重复次数依次按照重复次数分别为9、8、5、5、5次的微卫星片段，从而得到含有微卫星重复的ests序列。利用引物设计软件primer3.0在微卫星两端的侧翼序列设计特异引物。

2、est-ssr标记引物的设计

在微卫星重复区的侧翼序列利用软件primer3程序设计引物，引物要求满足以下条件：引物长度控制在20bp；退火温度58℃-62℃；上下游引物的tm值相差不大于2℃；pcr产物长度在100-300bp之间；gc含量在40％-60％之间；每个位点产生3对候选引物。

3、引物的优化

各引物的最佳退火温度在预期退火温度上下浮动10℃之间进行优化，直至预期目的产物能被清晰稳定的扩增。pcr扩增的反应程序为：95℃预变性5min；然后进行34次循环，每个循环包括94℃变性45s，54-58℃退火30s，72℃延伸1min；最后72℃延伸3min，4℃保存。反应体系为：总体积10μl，其中含10×buffer(内含1.5mmmg²⁺)1μl，dntpmix0.8μl，上下游引物各0.5μl，rtaq酶0.05μl，ddh2o6.65μl，模板0.5μl。模板是随机的10个榧树个体的dna混合池。扩增得到的产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳-eb染色系统进行检测，选择单一或杂带少、特异性产物，较高的温度作为最佳退火温度。

4、est-ssr位点的确定

根据步骤3中优化的退火温度选取35个个体检测这些est-ssr标记的多态性。pcr反应程序为：95℃预变性5min，然后进行34次循环，每个循环包括94℃变性45s，54-58℃退火30s(退火温度因不同引物而异)，72℃延伸1min；最后72℃延伸3min。反应体系为：总体积10μl，其中含10×buffer(内含1.5mmmg²⁺)1μl，dntpmix0.8μl，上下游引物各0.5μl，rtaq酶0.05μl，模板0.5μl，ddh2o6.65μl。pcr扩增产物用8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，恒压180v，电泳90min，硝酸银染色系统进行检测，干燥后分析确定多态性，最后筛选出16个榧树est-ssr标记，这些标记的具体信息如表1。

表1开发获得的16个榧树est-ssr标记

实施例2

1、提取榧树的dna

具体步骤如下：

提前将ctab放入65℃水浴锅中水浴(30min)，用冰盒取新鲜的样品，剪碎后置于2ml的离心管中(样品量约为管子的1/4)。在每个离心管中加入一颗直径为4mm左右的钢珠，在液氮中浸泡5-7分钟，充分预冷后，用均质仪磨碎。加800μl提前水浴过的ctab提取液于离心管中(ctab提取液中加1％的β-巯基乙醇)，将离心管置于65℃水浴锅中水浴40min，期间上下颠倒摇晃一次。12000rpm，4℃，离心10min，取上清，加等体积的24:1的氯仿-异戊醇(氯仿:异戊醇＝24:1)，充分摇匀，静置5-8min。12000rpm，4℃，离心10min，取上清，加等体积的24:1，充分摇匀，12000rpm，4℃，离心10min，取上清，加等体积的-20℃预冷过的异丙醇，充分摇匀，可见絮状沉淀。置于-20℃冰箱40min左右。12000rpm，4℃，离心10min，倒掉液体，加500μl75％乙醇洗涤两遍，置于通风橱15-20min，风干至半透明，加灭菌后的ddh2o30-40μl。检测质量。

2、pcr扩增

各est-ssr标记引物的最佳退火温度如表1所示，pcr反应体系为：95℃预变性5min；然后进行34次循环，每个循环包括94℃变性45s，54-58℃退火30s，72℃延伸1min；最后72℃延伸3min，4℃保存。反应体系为：总体积10μl，其中含10×buffer(1.5mmmg²⁺)1μl，dntpmix0.8μl，上下游引物各0.5μl，rtaq酶0.05μl，ddh2o6.65μl，模板0.5μl。扩增得到的产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳-eb染色系统进行检测。

3、电泳检测

经琼脂糖凝胶电泳检测(电压5-10v/cm，15-20分钟)，特异扩增的pcr产物用8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳缓冲液为1×tbe，恒压180v，功率200w，电泳90分钟后进行染色和显色，首先将胶片放入银染液中，在震荡仪上震荡5min左右，倒出银染液，用ddh2o漂洗两次。然后将胶片放入显色液中显色，在震荡仪上震荡直至有清晰的条带出现，胶片取出后用ddh2o漂洗两次，凝胶置于可见光灯箱上观察并拍照保存。银染液配置：ddh2o450ml，无水乙醇50ml和agno30.75g。显色液配置：ddh2o450ml，20％naoh50ml和甲醛2ml。

干燥后的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果如图1至图16所示。

sequencelisting

<110>浙江农林大学

<120>一种榧树转录组序列的est-ssr标记特异引物及筛选方法

<130>20170306

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<212>dna

<213>人工序列

<400>21

acatctgcaaggcaaggttc20

<210>22

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>22

ttgaattttcaccaggctcc20

<210>23

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>23

tgctaatgtttgctttgaatgg22

<210>24

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>24

aacaacctaaacttttgccgaa22

<210>25

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>25

gaaattaaacgcgttcaggg20

<210>26

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>26

cattgctgtccgtctcgtaa20

<210>27

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>27

cacaatcctccattcatcca20

<210>28

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>28

gccactggtgtgattctcaa20

<210>29

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>29

atttgatacgacggaaacgg20

<210>30

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>30

ggtggtcaatatcccatgct20

<210>31

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>31

aaggttgccacctcagtcac20

<210>32

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>32

acagaacgtctccaaccgac20