一种快速鉴定纯合子转基因羊的方法及其应用与流程

本发明涉及转基因动物遗传育种领域，具体地，涉及一种快速鉴定纯合子转基因羊的方法及其应用。

背景技术：

转基因技术是现代农业中重要的遗传育种技术之一，在转基因动物的研究中，若外源基因随机插入动物基因组中，插入拷贝数和位点都不确定，在进行转基因后代育种时，后代会出现基因分离现象，从而导致转基因遗传不稳定或表达不稳定的现象。转基因动物自交群体由杂合子转基因动物、纯合子转基因动物、同胞非转基因动物组成，只有纯合子转基因的动物才能稳定遗传，而不会出现性状分离现象，也只有纯合子的转基因动物才能作为侯选的优良育种材料。因此，如何快速、准确地鉴定和筛选出纯合子转基因羊是转基因羊育种的关键之一。

传统的转基因动物纯合子鉴定方法常为southern杂交法，southern杂交法是分子生物学的经典实验方法，cgh、fish等方法也常用于转基因拷贝数及纯合子的分析(larramendymletal,1998；kallioniemiaetal,1996；armourjaetal,2000)。但上述方法存在一定缺陷，工作量大、周期长、步骤繁多、费时费力。southern方法在基因组酶切消化不彻底的情况下会对插入基因拷贝数产生误判，同时在该实验过程中涉及放射性同位素等具有潜在危险性的药品，对发生重排的外源基因检测的精度不够等(wenghbetal,2004)。近年来，利用实时荧光定量pcr的方法来进行外源基因定量检测的方法迅速发展起来，而实时荧光定量pcr的检测结果和southern杂交法的检测结果接近(inghamdjetal，2001；songpetal,2002)操作更简单易行。

实时荧光定量pcr在实际应用中该方法主要体现在两种方式上:一种是利用已知外源基因拷贝数的基因组作为标准品,通过建立标准曲线来进行绝对定量；另一种则是以基因组上已知拷贝数的内源基因作为内参,通过相对定量法来确定外源基因的拷贝数。在应用绝对定量法来检测转基因拷贝数时，基因组 dna与标准品的绝对定量的误差等可能会导致实验结果的不稳定与较大的误差。而目前的相对定量法在构建质粒标准品时多为将内参基因与目的基因分别构建阳性质粒，这种方法造成阳性质粒中基因的拷贝数无法精确定量，导致标准曲线的误差，造成实验结果不准确并大大增加了工作量。

因此，本领域迫切需要开发一种能够克服上述已有技术缺陷，并且能够快速鉴定纯合子转基因羊的鉴定方法。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种能够快速鉴定纯合子转基因羊的鉴定方法。

本发明的另一目的是在于提供了一种纯合子转基因羊在转基因羊纯系建立和转基因羊新品种培育中的应用。

本发明的第一方面提供了一种用于鉴定纯合子转基因羊的特异性引物对，所述引物对包括扩增prp基因的第一引物对，所述第一引物对包括上游引物和下游引物：

上游引物prp-f2：5’-acccagattttaacatagag-3’(seqidno.:1)；

下游引物prp-r2：5’-ttttacagaaaccaaggacc-3’(seqidno.:2)。

在另一优选例中，所述prp基因为内参基因。

在另一优选例中，所述的第一引物对的上游引物的长度为15-30个碱基，较佳地为17-25个碱基。

在另一优选例中，所述的第一引物对的下游引物的长度为15-30个碱基，较佳地为17-25个碱基。

在另一优选例中，所述引物对还包括扩增hlz(人溶菌酶)基因的第二引物对，所述第二引物对包括上游引物和下游引物：

上游引物hlz-f2：5’-agttcccttcagtcactctttgt-3’(seqidno.:3)；

下游引物hlz-r2：5’-tcatcccttcactcattcattc-3’(seqidno.:4)。

在另一优选例中，所述的第二引物对的上游引物的长度为15-30个碱基，较佳地为17-25个碱基。

在另一优选例中，所述的第二引物对下游引物的长度为15-30个碱基，较佳地为17-25个碱基。

在另一优选例中，所述第一引物对和所述第二引物对带有可检测标记。

本发明第二方面提供了一种用于鉴定纯合子转基因羊的特异性引物对组 合，包括扩增prp基因的第一引物对，所述第一引物对包括上游引物和下游引物：

(i)prp-f2：5’-acccagattttaacatagag-3’(seqidno.:1)；

prp-r2：5’-ttttacagaaaccaaggacc-3’(seqidno.:2)；和

扩增hlz基因的第二引物对，所述第二引物对包括上游引物和下游引物：

(ii)hlz-f2：5’-agttcccttcagtcactctttgt-3’(seqidno.:3)；

hlz-r2：5’-tcatcccttcactcattcattc-3’(seqidno.:4)。

本发明第三方面提供了一种用于鉴定纯合子转基因羊的试剂盒，所述试剂盒包括：

(a)第一容器，以及位于所述容器内的用于鉴定纯合子转基因羊的第一引物对，所述引物对包括扩增prp基因的特异性引物对：

prp-f2：5’-acccagattttaacatagag-3’(seqidno.:1)；和

prp-r2：5’-ttttacagaaaccaaggacc-3’(seqidno.:2)；

以及使用说明书。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括(b)第二容器，以及位于所述容器内的用于鉴定纯合子转基因羊的第二引物对，所述引物对包括扩增hlz基因的特异性引物对：

hlz-f2：5’-agttcccttcagtcactctttgt-3’(seqidno.:3)；和

hlz-r2：5’-tcatcccttcactcattcattc-3’(seqidno.:4)。

在另一优选例中，所述试剂盒包含以下组分：dna聚合酶、pcr缓冲液、mg²⁺、dntp、和蒸馏水。

在另一优选例中，所述试剂盒包括a盒和b盒，其中，

a盒为标本处理单元，包括所述dna抽提试剂盒；

b盒为核酸扩增检测单元，包括dna聚合酶、pcr缓冲液、mg²⁺、dntp、蒸馏水等。

在另一优选例中，所述试剂盒还含有任选的pcr检测相关试剂，如premixextaq、roxreferencedyeⅱ、蒸馏水。

在另一优选例中，所述的pcr检测相关试剂为premixextaq。

本发明第四方面提供了一种本发明第一方面所述引物对或本发明第二方面所述引物对组合的用途，用于制备试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒用于(i)鉴定和筛选纯合子的转基因羊；和/或(ii)检测hlz基因在纯合子转基因羊基 因组中的拷贝数。

在另一优选例中，所述检测为实时定量pcr双标准曲线法检测。

本发明第五方面提供了一种鉴定纯合子转基因羊的方法，包括步骤：

(a)提供一待测样本，所述待测样本含有转基因羊的基因组dna；

(b)在第一反应体系中，以所述待测样本为模板，用所述第一引物对扩增所述待测样本中的内参基因，获得第一扩增产物；并在第二反应体系中，以所述待测样本为模板，用所述第二引物对扩增所述待测样本中的外源目的基因，获得第二扩增产物；

(c)比较所述外源目的基因的第二扩增产物和所述内参基因的第一扩增产物的数值，从而判断所述待测样本是否为纯合子的转基因羊。

在另一优选例中，所述第一引物对包括上游引物和下游引物：

上游引物prp-f2：5’-acccagattttaacatagag-3’(seqidno.:1)；

下游引物prp-r2：5’-ttttacagaaaccaaggacc-3’(seqidno.:2)。

在另一优选例中，所述第二引物对包括上游引物和下游引物：

上游引物hlz-f2：5’-agttcccttcagtcactctttgt-3’(seqidno.:3)；

下游引物hlz-r2：5’-tcatcccttcactcattcattc-3’(seqidno.:4)。

在另一优选例中，所述内参基因包括prp基因。

在另一优选例中，所述外源目的基因包括人溶菌酶(hlz)基因。

在另一优选例中，所述第一反应体系和第二反应体系中，引物不同，其他反应条件相同或基本相同。

在另一优选例中，所述的第一引物对的浓度为0.2μm-1.0μm，较佳地，0.3－0.7μm，更佳地，0.4-0.6μm，最佳地，0.4μm。

在另一优选例中，所述的第二引物对的浓度为0.2μm-1.0μm，较佳地，0.3－0.7μm，更佳地，0.4-0.6μm，最佳地，0.4μm。

在另一优选例中，所述比较是计算所述第二扩增产物和所述第一扩增产物的数值的比值。

在另一优选例中，在所述步骤(c)中，比较所述外源目的基因的第二扩增产物和所述内参基因的第一扩增产物的数量或ct值，从而判断所述待测样本中所述外源目的基因和所述内参基因的相对拷贝数，和/或判断所述待测样本是否为纯合子的转基因羊。

在另一优选例中，在所述步骤(c)中，分别测定hlz基因的第二扩增产物和 prp基因的第一扩增产物的数量或ct值，从而判断所述待测样本中hlz基因和prp基因的相对拷贝数，和/或判断所述待测样本是否为纯合子的转基因羊。

在另一优选例中，所述的pcr扩增反应条件如下：95℃30秒；95℃5秒，60℃34秒。

在另一优选例中，所述的pcr扩增反应进行40个循环。

在另一优选例中，在所述扩增步骤之前，还包括步骤(i’)：对待测样本进行处理，从而提取样本中的核酸模板。

在另一优选例中，在所述扩增步骤之前，还包括步骤(i”)：分别以提取的核酸模板和正常山羊基因组dna为模板，构建含有hlz基因和prp基因的标准质粒。

在另一优选例中，当所述外源目的基因的第二扩增产物的ct值(ct1)与所述内参基因的第一扩增产物的ct值(ct0)的比值(ct1/ct0)为1.5-2.5(较佳地，1.7-2.3，更佳地，1.9-2.1)时，则表明待测样本为纯合子的转基因羊。

在另一优选例中，当所述外源目的基因的第二扩增产物的ct值(ct1)与所述内参基因的第一扩增产物的ct值(ct0)的比值(ct1/ct0)为0.8-1.2(较佳地，0.9-1.1)时，则表明待测样本为单倍体的转基因羊。

在另一优选例中，当所述外源目的基因的第二扩增产物的ct值(ct1)与所述内参基因的第一扩增产物的ct值(ct0)的比值(ct1/ct0)为0时，则表明待测样本为非转基因羊。

在另一优选例中，当hlz基因的第二扩增产物的ct值(ct1)与prp基因的第一扩增产物的ct值(ct0)的比值(ct1/ct0)为1.5-2.5(较佳地，1.7-2.3，更佳地，1.9-2.1)时，则表明待测样本为纯合子的转基因羊。

在另一优选例中，当hlz基因的第二扩增产物的ct值(ct1)与prp基因的第一扩增产物的ct值(ct0)的比值(ct1/ct0)为0.8-1.2(较佳地，0.9-1.1)时，则表明待测样本为单倍体的转基因羊。

在另一优选例中，当hlz基因的第二扩增产物的ct值(ct1)与prp基因的第一扩增产物的ct值(ct0)的比值(ct1/ct0)为0时，则表明待测样本为非转基因羊。

在另一优选例中，所述的方法还包括对所述转基因羊纯合程度的鉴定步骤(d)：将步骤(c)鉴定得到的纯合子转基因羊与正常山羊杂交，从而鉴定所述转基因羊的纯合程度。

在另一优选例中，当所述纯合子转基因羊与正常山羊杂交后代的阳性率为100％时，则表明所述转基因羊的纯合程度较高。

在另一优选例中，所述的待测样本包括血液样本、细胞样本、组织样本。

在另一优选例中，所述的检测方法是非诊断且非治疗性的。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了g0代与正常羊配种后转基因羊后代整合检测鉴定图；其中，m：dl2000dnamarker；1-22：杂合子转hlz基因山羊与正常羊杂交后代；+：pcr阳性对照(模板为阳性质粒)；-：pcr阴性对照(模板为正常羊基因组dna)。

图2显示了荧光定量标准品载体示意图。

图3显示了荧光定量pcr标准曲线及扩增效率图。

图4显示了以prp为内参基因，采用双标准曲线法检测转基因羊后代中hlz的相对定量结果图。

图5显示了以actin为内参基因，采用双标准曲线法检测转基因羊后代中hlz的相对定量结果图。

图6显示了杂合子羊与杂合子羊配种后代整合检测鉴定图；其中，m：dl2000dnamarker；1-22：转hlz基因杂合子羊与杂合子羊杂交后代；+：pcr阳性对照(模板为阳性质粒)；-：pcr阴性对照(模板为正常羊基因组dna)。

图7显示了纯合子羊与正常羊配种后代整合检测鉴定图，其中，m：dl2000dnamarker；1-22：纯合子转hlz基因山羊与正常羊杂交后代；+：pcr阳性对照(模板为阳性质粒)；-：pcr阴性对照(模板为正常羊基因组dna)。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，通过筛选了大量样本，意外筛选出2对能够高效扩增鉴定纯合子转基因羊的引物对，分别为hlz基因和prp基因的引物对。具体地，本发明采用了羊朊蛋白内源性基因(prp基因)为内参基因，利用real-timepcr双标准曲线法，通过构建含有hlz基因和prp基因的标准 质粒，比较hlz和prp基因的扩增产物的ct值，从而鉴定和筛选纯合子的转基因羊。在此基础上，本发明人完成了本发明。

内参基因(prp基因)

羊朊蛋白(prionprotein，prp)基因位于13号染色体上，编码约250个氨基酸的朊蛋白，该基因在羊的基因组内以高度保守、单拷贝形式存在，在羊各组织器官中稳定表达。

引物

如本文所用，术语“扩增外源目的基因和内参基因的引物”、“扩增hlz基因和prp基因的引物”、“本发明的引物”是指这样的引物(对)，其扩增出的扩增产物具有hlz基因和prp基因的互补链序列。

经过大量引物(对)的筛选，本发明人发现，如seqidno.:1和seqidno.:2所示的引物对，以及seqidno.:3和seqidno.:4所示的引物对能够高效地扩增出hlz基因和prp基因的基因序列，且所扩增出的产物条带清晰无弥散。

本发明中，所使用的hlz基因和prp基因的扩增特异性引物对所针对的目标序列为转基因羊。

将seqidno.:1-2所示的引物对单独或与seqidno.:3-4所示的引物对组合对纯合子的转基因羊进行鉴定，可以发现，本发明的引物对可高灵敏地、高特异性地检测出纯合子的转基因羊

试剂盒

本发明还提供了一种用于鉴定纯合子转基因羊的试剂盒，所述试剂盒包括：

(a)第一容器，以及位于所述容器内的用于鉴定纯合子转基因羊的第一引物对，所述引物对包括扩增prp基因的特异性引物对：

prp-f2：5’-acccagattttaacatagag-3’(seqidno.:1)；和

prp-r2：5’-ttttacagaaaccaaggacc-3’(seqidno.:2)；

以及使用说明书。

在一优选例中，所述试剂盒中还包括(b)第二容器，以及位于所述容器内的用于鉴定纯合子转基因羊的第二引物对，所述引物对包括扩增hlz基因的特异性引物 对：

hlz-f2：5’-agttcccttcagtcactctttgt-3’(seqidno.:3)；和

hlz-r2：5’-tcatcccttcactcattcattc-3’(seqidno.:4)。

所述的试剂盒中还可以含有其他组分，例如进行样本处理、dna模板提取的试剂组合。

在一优选实施方式中，所述试剂盒包含以下组分：dna聚合酶、pcr缓冲液、mg2+、dntp、和蒸馏水。

所述的试剂盒还含有dna抽提试剂盒，购于天根生化科技有限公司。

所述试剂盒还含有任选的pcr检测相关试剂，如dna聚合酶、pcr缓冲液、mg²⁺、dntp、蒸馏水等。

所述的pcr检测相关试剂可自商业购买来源获得，如premixextaq。

本发明试剂盒中引物的浓度没有特别限制，可以由本领域技术人员根据所需的扩增效率进行决定。优选地，本发明扩增hlz基因的特异性引物的浓度为0.2μm-1.0μm，较佳地，0.3－0.7μm，更佳地，0.4-0.6μm，优选0.40μm，本发明扩增prp基因的特异性引物的浓度为0.2μm-1.0μm，较佳地，0.3－0.7μm，更佳地，0.4-0.6μm，优选0.40μm。

鉴定方法、转基因羊纯系的建立以及转基因羊新品种的培育

本发明还提供了一种鉴定纯合子转基因羊的方法，包括步骤：

(a)提供一待测样本，所述待测样本含有转基因羊的基因组dna；

(b)在第一反应体系中，以所述待测样本为模板，用所述第一引物对扩增所述待测样本中的内参基因，获得第一扩增产物；并在第二反应体系中，以所述待测样本为模板，用所述第二引物对扩增所述待测样本中的外源目的基因，获得第二扩增产物；

(c)比较反应体系中所述外源目的基因的第二扩增产物和所述内参基因的第一扩增产物的数值，从而判断所述待测样本是否为纯合子的转基因羊。

在本发明中，本发明还提供了纯合子转基因羊在转基因羊纯系建立和转基因羊新品种中培育中的应用。

具体步骤为：将鉴定的纯合子转基因公羊与纯合子转基因母羊按常规方法在实验羊牧场种养殖，待其发育到性成熟后，按常规方法进行亲缘选配；得到的后代即为遗传性状稳定的转基因羊纯合子家系，将获得的转基因羊纯合子家系按常规方 法在实验羊牧场养殖和培育，从而培育出优良羊类新品种。

本发明的主要优点包括：

1.本发明以山羊内源性朊蛋白基因为内参基因，结合real-timepcr和双标准曲线的方法鉴定纯合子，不需要样品浓度完全一致，同时也可以避免加样误差带来的结果不稳定现象，也不需要复杂的数据分析，操作简单、快速、准确，需要的dna量少、而且可以高通量分析待测转基因羊样品。

2.用本发明的鉴定方法鉴定出来的纯合子转基因羊可以作为亲本用于建立转基因羊纯系，从而培育出养殖性状优良，遗传性状稳定的养殖羊类新品种，加快遗传性状稳定的转基因羊新品种的培育进程。

3.本发明的鉴定方法简便易行，操作简便，可以对转hlz基因羊杂交群体中的纯合子和杂合子转基因羊进行准确、快速和高通量筛选。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1以朊蛋白为内参基因的转基因羊纯合子的鉴定方法

实验方法

1.dna提取

取200μl转hlz基因羊血液，按“血液/细胞/组织基因组dna提取试剂盒”操作指南(北京天根生物技术公司产品)，提取转hlz基因羊基因组dna。

2.阳性转hlz基因羊鉴定

采用常规pcr技术鉴定阳性hlz转基因羊。检测所需上下游引物序列分别为：hlz-f(5’-gagtgcagtggcatgatctcag-3’)(seqidno.:5)和hlz-r(5’-gtaagcaggagcaatggcat-3’)(seqidno.:6)；引物由invitrogen公司合成。

pcr检测体系总体积为20μl，包括2μl10×labuffer(mg²⁺plus)，3.2μldntp(10mm)，上下游引物各0.8μl；1μlgdna；0.2μllataq聚合酶。pcr 反应程序为95℃预变性5min；95℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸1min,30cycles；72℃再延伸10min。取5μl反应产物于1％琼脂糖凝胶电泳检测，预期扩增的转基因片段大小为1510bp。

3.纯合子鉴定与筛选

转入基因hlz在纯合子转基因羊基因组中的拷贝数是其在杂合子转基因羊基因组中拷贝数的2倍，通过real-timepcr分析转基因羊中转植基因hlz的基因型来鉴别转基因羊纯合子和杂合子：以山羊基因组中拷贝数恒定不变的prnp基因为内参基因，以转入基因hlz为目标基因，进行real-timepcr分析。

3.1标准质粒构建

以hlz转基因的羊基因组dna为模板，分别用hlz-f1和hlz-r1扩增245bp的人溶菌酶序列；以正常山羊基因组dna为模板，分别用prp-f1和prp-r1扩增209bp的朊蛋白基因序列，pcr扩增体系为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30cycles；72℃再延伸10min。pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳后用胶回收试剂盒回收。并将hlz序列克隆至pbluscriprⅱ载体的xbaⅰ和sacⅰ之间，得中间载体pbsk-hlz；将prp串联克隆至中间载体pbsk-hlz的kpnⅰ和bamhi之间，得标准pbsk-prp-hlz(标准质粒示意图见图2)。

所述各引物为：

hlz-f1：5’-gctctagaagttcccttcagtcactctttgt-3’(seqidno.:7)；

hlz-r1：5’-cgagctctcatcccttcactcattcattc-3’(seqidno.:8)；

prp-f1：5’-ggggtaccacccagattttaacatagag-3’(seqidno.:9)；

prp-r1：5’-cgggatccttttacagaaaccaaggacc-3’(seqidno.:10)

3.1标准曲线建立

标准质粒pbsk-prp-hlz用ddh2o分别稀释至1.5×10⁸、1.5×10⁷、1.5×10⁶、1.5×10⁵、1.5×10⁴、1.5×10³拷贝/μl6个梯度，分别用作prp基因及插入序列hlz的定量模板。

定量反应体系:premixextaq^tmⅱ(2×)10μl，上下游引物各0.8μl(10μmol/l),模板2μl,roxreferencedyeⅱ(50×)0.4μl,ddh2o定容到20μl体系。定量反应条件为:95℃30s；95℃5s,60℃34s,40个循环。每个样品3个平行。以拷贝数的对数为横坐标,以ct值为纵坐标分别绘制hlz和prp的标准曲线。

hlz基因上下游引物分别为

hlz-f2：5’-agttcccttcagtcactctttgt-3’(seqidno.:3)

hlz-r2：5’-tcatcccttcactcattcattc-3’(seqidno.:4)。

prp基因上下游引物分别为：

prp-f2：5’-acccagattttaacatagag-3’(seqidno.:1)

prp-r2：5’-ttttacagaaaccaaggacc-3’(seqidno.:2)。

3.2转hlz基因山羊拷贝数分析

分别提取转人溶菌酶基因山羊的基因组dna，通过紫外分光光度计测定其浓度。参照山羊基因组全序列长度,计算其分子量,将基因组dna稀释到10⁴～10⁷拷贝数/μl的浓度范围。

分别测定转人溶菌酶基因山羊的hlz和prp的ct值,按照构建的标准曲线(图3)计算其拷贝数。由于山羊的prp基因为2个拷贝,所以依照公式:hlz拷贝数/基因组＝(hlz拷贝/prp拷贝数)×2可以计算出每个山羊基因组中的插入序列hlz的拷贝数，结果见图4，可见t6转基因羊中hlz拷贝数显著高于原代转基因羊t1，约为t1的两倍，判定为纯合子转基因羊。从图4中可以看出，用prp基因作为内参基因时，波动性很小，准确性高，稳定性好。

4.纯合子验证

将步骤3筛选出的纯合子转基因羊与正常奶山羊杂交后按照步骤1和2所示方法鉴定杂交后代的阳性率。根据孟德尔遗传定律，纯合子转基因羊与正常羊杂交后代的阳性率为100％(图7)，纯合子与杂合子转基因羊杂交后代的阳性率约为75％(图6)，杂合子转基因羊与正常羊杂交后代的阳性率为50％(图1)。

实施例2用实施例1的鉴定方法鉴定的纯合子转基因羊的应用

实验方法

1.将鉴定的纯合子转基因公羊与纯合子转基因母羊按常规方法在实验羊牧场种养殖，待其发育到性成熟后，按常规方法进行亲缘选配；

2.得到的后代即为遗传性状稳定的转基因羊纯合子家系，将获得的转基因羊纯合子家系按常规方法在实验羊牧场养殖和培育，从而培育出优良羊类新品种。

结果表明，本发明的方法得到的纯合子转基因羊遗传性状稳定，可用于转 基因优良新品种的培育。

对比例

以如下引物扩增actin序列，采用实施例1的3.1的方法构建标准品质粒pbsk-actin-hlz。并以此为标准质粒进行定量pcr扩增。

hlz-f1：5’-gctctagaagttcccttcagtcactctttgt-3’(seqidno.:7)；

hlz-r1：5’-cgagctctcatcccttcactcattcattc-3’(seqidno.:8)；

actin-f1：5′-cccaagcttcacacggtgcccatctacga-3′(seqidno.:11)；

actin-r1：5′-ggggtaccatgtcacggacgatttcccgct-3′(seqidno.:12)。

采用如下引物进行定量扩增，反应体系:premixextaq^tmⅱ(2×)10μl，上下游引物各0.8μl(10μmol/l),模板2μl,roxreferencedyeⅱ(50×)0.4μl,ddh2o定容到20μl体系。定量反应条件为:95℃30s；95℃5s,60℃34s,40个循环。每个样品3个平行。以拷贝数的对数为横坐标,以ct值为纵坐标分别绘制hlz和actin的标准曲线。

hlz-f2：5’-agttcccttcagtcactctttgt-3’(seqidno.:3)；

hlz-r2：5’-tcatcccttcactcattcattc-3’(seqidno.:4)；

actin-f2：5’-cacacggtgcccatctacga-3’(seqidno.:13)；

actin-r2：5’-atgtcacggacgatttcccgct-3’(seqidno.:14)。

分别测定转基因羊的actin和prp的ct值,按照构建的标准曲线计算其拷贝数。由于山羊的actin基因为2个拷贝,所以依照公式:hlz拷贝数/基因组＝(hlz拷贝/actin拷贝数)×2可以计算出每个山羊基因组中的插入序列hlz的拷贝数。结果如图5所示，t6转基因羊中hlz拷贝数显著高于其它羊，约为原代转基因羊t1两倍，故判定为纯合子转基因羊。然而，actin作为内参基因时，波动性较大，稳定性差，准确度低。

结果表明，分别以prp及actin为内参基因，用于转基因羊中hlz拷贝数检测时结果虽然相似，但prp为内参检测时的结果更为稳定，准确度更高，重复性更好。

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