一种96孔板磁珠提取口腔拭子DNA的方法与流程

本发明涉及生物技术领域，特别地，涉及一种96孔板磁珠提取口腔拭子dna的方法。

背景技术：

dna提取是分子生物学的基本实验，它是不断发展的基因芯片检测中最基本的方法，也是基因芯片制备、分析和诊断的前提，因此，dna提取是生物学最基础的技术之一。

成功的核酸分离纯化需要四个重要的步骤：组织或细胞的破碎和裂解、核蛋白复合体的变性、核酸酶的灭活以及污染物的去除，通过理想的抽提方法可以获取高质量的靶核酸，同时没有蛋白、糖、脂和其它核酸污染等。

目前，常用的dna提取方法主要有玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法等物理方法，ctab法、异硫氰酸胍法、碱裂解法等化学方式，以及酶提取法等生物提取方式；根据核酸分离纯化方式的不同有硅质材料、阴离子交换树脂提取等。其中，植物来源的dna提取方法主要有十六烷基三乙基澳化按(ctab)法、sds法和高盐低ph法等；细菌、真菌来源的dna提取方法为碱裂解法、煮沸法、sds裂解法以及triton-溶菌酶裂解法等；动物来源的dna最为经典的提取方法主要有酚抽提法、异丙醇沉淀法、甲酞胺裂解法，现行的很多方法都是在此基础上改进得来。

口腔黏膜为复层鳞状上皮，具有代谢旺盛、更新快、易脱落的特点，它由多层细胞组成，基底层具有旺盛分裂能力，其上皮脱落细胞虽然细胞核固缩，但与其他组织细胞一样具有完整的基因组dna，从而成为法医学和遗传学dna多态性检测分型的生物性检验材料。既往多采用酚氯仿法或chelex-100等方法，存在酚、氯仿污染或收获率低、纯度不高等缺点。

采用口腔拭子法(口腔脱落细胞)提取口腔上皮细胞是一种非介入、无痛苦、无创伤、简单的dna标本采集方法，该方法适用于采集任何年龄段人群的dna样本，同时也可应用于新生儿、婴幼儿或老弱病残者等不便采血人群之用。

目前，口腔拭子dna的提取多采用96孔板磁珠提取，处理口腔拭子样本时，需要先将拭子头剪下放入1.5ml左右离心管中，加入消化液及蛋白酶k，进行细胞的裂解和酶解反应后，再转入96深孔板进行后续的实验。一方面，两次分步操作的方式增加了操作步骤、造成时间浪费，同时在样品转移的过程中，也极大的增加了混样的风险。

技术实现要素：

本发明提供了一种96孔板磁珠提取口腔拭子dna的方法，解决了现有技术中口腔拭子dna提取样品易混样的问题。

为实现上述目的，本发明提出了一种裂解及酶解口腔拭子dna的方法，包括如下步骤：

(1)取细胞培养板，按照顺序一一对应空位，将口腔拭子头置于深孔板中；

(2)向所述细胞培养板中加入消化液和蛋白酶k；

(3)密封所述细胞培养板；

(4)将所述细胞培养板于振荡器上充分混匀并水浴处理，得到dna酶解液。

所述细胞培养板为96孔板。

所述细胞培养板为96深孔板。

所述步骤(3)中，使用所述细胞培养板的专用胶垫进行密封。

所述水浴处理步骤的温度为56℃。

所述消化液为blbuffer。

所述消化液的加入量为500ul。

所述蛋白酶k的加入量为20ul。

本发明还公开了一种96孔板磁珠提取口腔拭子dna的方法，包括如下步骤：

(a)按照所述裂解及酶解口腔拭子dna的方法，得到所述dna酶解液；

(b)将所述dna酶解液转移到新的细胞培养板上，按照现有技术常规方法进行后续的dna提取。

所述步骤(b)中，还包括加入磁珠进行提取的步骤。

本发明所述96孔板磁珠提取口腔拭子dna的方法，在处理拭子样品时，直接以96深孔板为载体，并处理获得dna酶解液，可以直接将所述dna酶解液置于新的细胞培养板上进行常规后续处理，整个过程将从离心管转移时混样的风险降到最低，同时减少操作步骤，节省了操作时间。

附图说明

图1是本发明实施例1中96孔板提取口腔拭子dna的操作示意图；

图2是本发明实施例1中96孔板提取口腔拭子dna的另一角度操作示意图；

图3是本发明对比例中单管离心管提取口腔拭子dna的操作示意图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

实施例1

如图1、2所示，本实施例所述96孔板磁珠提取口腔拭子dna的方法是以96孔板进行，包括如下步骤：

(a)口腔拭子dna的裂解及酶解，具体包括：

(1)取96深孔板为细胞培养板，按照《样本提取表》的顺序，一一对应空位，使用手术剪将口腔拭子头剪下，置于所述96深孔板中；

(2)向所述细胞培养板中加入500ul的消化液blbuffer和20ul的蛋白酶k；

(3)以所述96深孔板专用胶垫密封所述96深孔板；

(4)将所述96深孔板于振荡器上充分混匀并控制56℃水浴处理，得到dna酶解液；

(b)将所述dna酶解液转移到新的细胞培养板上，按照现有技术常规方法进行后续的dna提取，具体包括：

(1)加入350ul无水乙醇，加入30ul磁珠，置于混匀仪上1200rpm，混匀1分钟；静置吸附10分钟，并在静置第3分钟、第6分钟分别混匀1次；

(2)吸附结束后，混匀磁珠，将深孔板置于磁力架上，至溶液澄清后，撕去胶垫，弃去深孔板内上清液，注意不要触碰到磁珠；

(3)加入600ul已加乙醇的洗涤液bw1，盖上胶垫，置于混匀仪上1350rpm，混匀1分钟；并将深孔板置于磁力架上，至溶液澄清后，撕去胶垫，弃去深孔板内上清液，注意不要触碰到磁珠；

(4)加入600ul已加乙醇的洗涤液bw1，盖上胶垫，按照上述方法再洗涤一次；

(5)随后加入500ul80％乙醇溶液，盖上胶垫，按照上述方法洗涤一次；

(6)将96深孔板置于干式加热器上，40℃烘干5分钟；

(7)加入50ul洗脱液ce，置于混匀仪上1600rpm，混匀1分钟，于56℃水浴孵育10分钟进行dna洗脱，并在第5分钟混匀1次；

(8)孵育结束后混匀磁珠，置于磁力架上至溶液澄清，吸取上清；使用nanodrop测定浓度，将浓度填写到《样本浓度表》中，于-20℃保存待用。

对比例

所述对比例中提取口腔拭子dna的方法与实施例1相同，其区别仅在于，如图3所示，所述步骤(a)中，所述裂解及酶解dna的步骤中，在处理口腔拭子样本时，先将口腔拭子头剪下放入1.5ml左右离心管中，加入相同的消化液及蛋白酶k，在相同条件下，进行细胞的裂解和酶解反应，得到所述dna酶解液；待消化完毕后，再转入96深孔板中，按照现有技术常规方法进行后续的dna提取，所述dna提取步骤同实施例1。

实验例

对上述实施例1中以96深孔板进行操作和对比例中以现有单管提取口腔拭子的方法中所提取得到的dna样本浓度和纯度进行检测并对比，记录数据如下表1。

表1两种方法dna样本浓度和纯度对比

由上表可看出使用96深孔板和单管孵育样本得到dna样本的浓度，其纯度近似，没有显著的差异，但本发明所述方法使用96深孔板进行dna提取操作相比于单管提取操作能大大的减少操作的时间、且有效降低转移时混样的风险。

以上对本发明实施例进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。