本发明涉及一种超高压提取落叶松二氢槲皮素提取物的制备方法，该提取物以二氢槲皮素为主要成分并含有少量其他成分，该项技术属于天然产物分离与纯化技术。
背景技术：
花旗松素独有的五羟基结构使其具有众多的生物学活性，如抗病毒、抗氧化、抗炎、抑制恶性肿瘤细胞生长、调节酶活性等，因此被广泛应用于食品、药品、化妆品、工业、农业等多个领域。二氢槲皮素是自然界中广泛存在的一种二氢黄酮醇类的化合物,目前被发现分布在50多种植物中,其中尤以落叶松中储量丰富，容易形成规模化生产。
落叶松是我国东北地区主要三大针叶用材树种之一，中国东北地区天然分布和人工栽培的落叶松种类长白山落叶松、日本落叶松、兴安落叶松和朝鲜落叶松。
专利”一种利用超高压设备提取植物中有效成分的方法”（zl201510231951.4）指出，将粉状植物原材料装入容器中，加入水或5%-60%酒精浸泡，料液比为1:1-1:3，充分搅拌，浸泡4-8小时，使植物细胞充分吸水膨胀；将经过充分浸泡膨胀的植物原料装入塑料袋或塑料瓶中，排除袋或瓶中的空气，封严；将塑料袋或瓶放入超高压舱中，加压50-600兆帕，保持压力时间3-10分钟；卸压。本发明采用落叶松与酒精比例为1:2-1:3，但用60-95%酒精浸泡，效果明显优于5%-60%酒精浸泡，二氢槲皮素出率更高，也更优于水煮、醇沉，醚萃取技术（zl201310302501.0），不仅收率高，而且省略醚萃取过程，解决产品溶剂残留，并且对环境无污染。本发明采用超高技术，所用容剂量小，能耗非常低，时间非常短，不同于以往的水提醇沉或醇提水沉，需要处理大量溶剂，如，落叶松木粉中二氢槲皮素的预处理乙醇提取方法（cn104841156a），料液比1：8～1：35，乙醇回流提取至少重复进行2次，本发明采用落叶松与酒精比例为1:2-1:3，最多重复2次。
据俄罗斯文献报道[1]，兴安落叶松（larix.gmelini）提取物中，除了含有二氢槲皮素外，还含有香橙素、圣草酚、槲皮素、柚皮素、山奈酚、松属素等黄酮类物质。据专利“长白落叶松提取物的制备方法及医药用途”（zl201310302501.0）报告，长白落叶松中以二氢槲皮素为主，其他包括：香橙素、圣草酚、槲皮素和山奈酚。本发明在朝鲜落叶松中又发现2种新的成分，经质谱、1hnmr、13cnmr分别鉴定为3,5,7-三羟基色原酮（4）和(2r,3r)-3'-o-甲基花旗松素。本发明分离得到的二氢槲皮素提取物，主要含有二氢槲皮素，其他少量成分是香橙素、槲皮素、3,5,7-三羟基色原酮（图1）和(2r,3r)-3'-o-甲基花旗松素（图2）。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种从朝鲜落叶松木屑以乙醇为溶剂，利用超高压设备提取二氢槲皮素的制备方法，本技术所用容剂量小，能耗非常低，时间非常短，解决了现有技术的水解过程生产周期长、生产效率低、工艺路线复杂操作难度大的技术问题；
本发明目的的实现是通过以下步骤实现：1）选落叶松树根，原材料中二氢槲皮素含量为2%-4.5%；2）原材料前处理：将侧根与主根分割归类，用清水洗净泥沙后风干；去除树皮及毛根，切成片后粉碎成木屑（0.4×0.4×8mm）；3）将上述木屑材料装入容器中，加入水浸泡，料液比为1:5～1:10，充分搅拌，浸泡4-8小时，使木屑粉充分吸水膨胀，然后滤出水分，湿润木屑；4）将经过充分浸泡膨胀的木屑原料装入塑料袋，加入60%-95%酒精，料液比为1:1-1:3，排除袋中的空气，封严，将塑料袋放入超高压舱中，加压400-600兆帕，保持压力时间10分钟，然后卸压，取出袋中的酒精溶液；5）取出已经破壁的落叶松木屑倒入容器中，加入60%-95%酒精，料液比为1:1-1:3，浸泡过夜后，取出容器中的酒精溶液，与4）处理得到的酒精溶液合并；
6）将步骤5）得到的酒精提取液，真空减压回收，浓缩到一定体积，保持50-60℃条件下，去除杂质，
然后溶液浓缩至1.02-1.08，加95%酒精1/5体积，室温放置3天，得二氢槲皮素粗结晶；
7）将6）得到的粗结晶物与纯化水（结晶物与纯化水之比为1:3.5—4.5）混合倒入加热罐中搅拌2h，温度为95℃，罐中液体入转移容器中，室温条件下条件下静止72小时，得二氢槲皮素提取物，纯度92%以上。
本发明揭示落叶松二氢槲皮素提取物中，除含有已经报道的成分之外，又分离得到2个新成分，经质谱与核磁共振鉴定为，3,5,7-三羟基色原酮和(2r,3r)-3'-o-甲基花旗松素。
本发明的积极效果在于，通过超高压设备提取二氢槲皮素的制备方法，所用容剂量小，能耗非常低，时间非常短，解决了现有技术的水解过程生产周期长、生产效率低、工艺路线复杂操作难度大的技术问题。
本发明的积极效果还在于，通过超高压设备提取二氢槲皮素的制备方法得到的(2r,3r)-3'-o-甲基花旗松素具有较强的抗氧化、抗衰老、降血糖、抗炎的生物活性。
附图1.3,5,7-三羟基色原酮结构式
附图2.(2r,3r)-3'-o-甲基花旗松素结构式
附图3.3,5,7-三羟基色原酮1h-nmr；
附图4.3,5,7-三羟基色原酮13c-nmr；
附图5.(2r,3r)-3'-o-甲基花旗松素1h-nmr；
附图6.(2r,3r)-3'-o-甲基花旗松素13c-nmr；
附图7.(2r,3r)-3'-o-甲基花旗松素cd谱;
附图8.3,5,7-三羟基色原酮esi-ms;
附图9.(2r,3r)-3'-o-甲基花旗松素esi-ms.
附图10.(2r,3r)-3'-o-甲基花旗松素对raw264.7细胞活性的影响
附图11.(2r,3r)-3'-o-甲基花旗松素对lps诱导小鼠细胞no的生成情况
具体实施例
下面通过具体的实施例进一步描述本发明，但并非是限制本发明的范围。
实施例1
将朝鲜落叶松侧根与主根分割归类，用清水洗净泥沙后风干；去除树皮及毛根，切成片后粉碎成木屑（0.4×0.4×8mm）；上述木屑材料装入容器中，加水室温浸泡，料液比为1:5，充分搅拌，浸泡4-8小时，使木屑粉充分吸水膨胀，然后滤出水分，使木屑含水量保持在40%；将上述处理的木屑3kg原料装入塑料袋，加入95%酒精，料液比为1:3，排除袋中的空气，封严，将塑料袋放入超高压舱中，加压400-600兆帕，保持压力时间10分钟，然后卸压，取出袋中的酒精溶液，再取出已经破壁的落叶松木屑倒入容器中，加入60%-95%酒精，料液比为1:3，搅拌浸泡过夜后，取出容器中的酒精溶液，与处理得到的酒精溶液合并，真空减压回收酒精至无醇味，并浓缩到一定体积，保持50-60℃条件下，去除杂质，然后溶液浓缩至比重1.02-1.08，加95%酒精1/5体积，室温放置3天，得二氢槲皮素粗结晶；得到的粗结晶物与纯化水（结晶物与纯化水之比为1:3.5—4.5）混合倒入加热罐中搅拌2h，温度为95℃，罐中液体入转移容器中，室温条件下条件下静止72小时，得二氢槲皮素提取物，纯度92%，50g，扣除原材料含水率，木屑粉为1.2公斤，收率为4.1%。
实施例2
将朝鲜落叶松侧根与主根分割归类，用清水洗净泥沙后风干；去除树皮及毛根，切成片后粉碎成木屑（0.4×0.4×8mm）；上述木屑材料装入容器中，加水室温浸泡，料液比为1:5，充分搅拌，浸泡4-8小时，使木屑粉充分吸水膨胀，然后滤出水分，使木屑含水量保持在40%；将上述处理的木屑3kg原料装入塑料袋，加入95%酒精，料液比为1:2，排除袋中的空气，封严，将塑料袋放入超高压舱中，加压500兆帕，保持压力时间10分钟，然后卸压，取出袋中的酒精溶液，再取出已经破壁的落叶松木屑倒入容器中，加入95%酒精，料液比为1:2，搅拌浸泡过夜后，取出容器中的酒精溶液，与处理得到的酒精溶液合并，真空减压回收酒精至无醇味，并浓缩到一定体积，保持60℃条件下，去除杂质，然后溶液浓缩至比重1.02-1.08，加95%酒精1/5体积，室温放置3天，得二氢槲皮素粗结晶；得到的粗结晶物与纯化水（结晶物与纯化水之比为1:3.5—4.5）混合倒入加热罐中搅拌2h，温度为95℃，罐中液体入转移容器中，室温条件下条件下静止72小时，得二氢槲皮素提取物，纯度91%，40g，扣除原材料含水率，木屑粉为1.2公斤，收率为3.3%。
实施例3
将朝鲜落叶松侧根与主根分割归类，用清水洗净泥沙后风干；去除树皮及毛根，切成片后粉碎成木屑（0.4×0.4×8mm）；上述木屑材料装入容器中，加水室温浸泡，料液比为1:5，充分搅拌，浸泡4-8小时，使木屑粉充分吸水膨胀，然后滤出水分，使木屑含水量保持在40%；将上述处理的木屑3kg原料装入塑料袋，加入95%酒精，料液比为1:1，排除袋中的空气，封严，将塑料袋放入超高压舱中，加压500兆帕，保持压力时间10分钟，然后卸压，取出袋中的酒精溶液，再取出已经破壁的落叶松木屑倒入容器中，加入95%酒精，料液比为1:1，搅拌浸泡过夜后，取出容器中的酒精溶液，与处理得到的酒精溶液合并，真空减压回收酒精至无醇味，并浓缩到一定体积，保持60℃条件下，去除杂质，然后溶液浓缩至比重1.02-1.08，加95%酒精1/5体积，室温放置3天，得二氢槲皮素粗结晶；得到的粗结晶物与纯化水（结晶物与纯化水之比为1:3.5—4.5）混合倒入加热罐中搅拌2h，温度为95℃，罐中液体入转移容器中，室温条件下条件下静止72小时，得二氢槲皮素提取物，纯度90.4%，37g，扣除原材料含水率，木屑粉为1.2公斤，收率为3.1%。
实施例4
将朝鲜落叶松侧根与主根分割归类，用清水洗净泥沙后风干；去除树皮及毛根，切成片后粉碎成木屑（0.4×0.4×8mm）；上述木屑材料装入容器中，加水室温浸泡，料液比为1:5，充分搅拌，浸泡4-8小时，使木屑粉充分吸水膨胀，然后滤出水分，使木屑含水量保持在40%；将上述处理的木屑3kg原料装入塑料袋，加入95%酒精，料液比为1:1，排除袋中的空气，封严，将塑料袋放入超高压舱中，加压500兆帕，保持压力时间10分钟，然后卸压，取出袋中的酒精溶液，再取出已经破壁的落叶松木屑倒入容器中，加入95%酒精，料液比为1:1，95%酒精，料液比为1:1，搅拌浸泡过夜后，取出容器中的酒精溶液，剩余的木屑粉倒入容器中，再次加入95%酒精，料液比为1:1，搅拌浸泡3h后，取出酒精溶液，3次处理得到的酒精溶液，合并，真空减压回收酒精至无醇味，并浓缩到一定体积，保持60℃条件下，去除杂质，然后溶液浓缩至比重1.02-1.08，加95%酒精1/5体积，室温放置3天，得二氢槲皮素粗结晶；得到的粗结晶物与纯化水（结晶物与纯化水之比为1:3.5—4.5）混合倒入加热罐中搅拌2h，温度为95℃，罐中液体入转移容器中，室温条件下条件下静止72小时，得二氢槲皮素提取物，纯度90.7%，45g，扣除原材料含水率，木屑粉为1.2公斤，收率为3.7%。
实施例5朝鲜落叶松中二氢槲皮素提取物中所含杂质进行分离纯化与结构鉴定
运用聚酰胺柱色谱、葡聚糖凝胶sephadexlh-20柱色谱对杂质进行分离纯化，利用核磁共振氢谱、碳谱、质谱、圆二色散谱等数据对分离纯化的化合物进行结构鉴定，采用薄层色谱法（tlc）对二氢槲皮素提取物的杂质进行检查。从提取物中分离鉴定出5个化合物，其中(2r,3r)-二氢槲皮素（1）为该提取物的主成分，其杂质分别为(2r,3r)-香橙素（2）、槲皮素（3）、3,5,7-三羟基色原酮（4）和(2r,3r)-3'-o-甲基花旗松素（5）化合物1黄色粉末，[α]25d+20.0(c0.1,meoh)；1h-nmr(600mhz,cd3od)d：4.50(1h,d,j=11.5hz,h-3)，4.91(1h,overlapped,j=11.5hz,h-2)，5.87(1h,d,j=2.1hz,h-8)，5.91(1h,d,j=2.1hz,h-6)，6.79(1h,d,j=8.1hz,h-5')，6.84(1h,dd,j=2.0,8.1hz,h-6')，6.95(1h,d,j=2.0hz,h-2')；13c-nmr(150mhz,cd3od)d：72.2(c-3)，83.7(c-2)，94.8(c-8)，95.8(c-6)，100.4(c-10)，114.4(c-2')，114.6(c-5')，119.5(c-6')，128.4(c-1')，144.9(c-4')，145.7(c-3')，163.1(c-9)，163.9(c-7)，167.3(c-5)，197.0(c-4)。以上数据与文献报道的二氢槲皮素数据基本一致[2]，根据其h2,3的耦合常数j=11.5hz，以及cd谱中295nm显示负cotton效应，329nm显示正cotton效应[3]，确定化合物1为(2r,3r)-二氢槲皮素。
化合物2白色羽状结晶，[α]25d+18.9(c0.1,meoh)；1h-nmr(600mhz,cd3od)d：4.52(1h,d,j=11.6hz,h-2)，4.96(1h,d,j=11.6hz,h-3)，5.84(1h,br.s,h-8)，5.88(1h,br.s,h-6)，6.82(2h,d,j=8.3hz,h-3',5')，7.34(2h,d,j=8.3hz,h-2',6')；13c-nmr(150mhz，cd3od)d：72.2(c-3)，83.5(c-2)，95.2(c-8)，96.2(c-6)，100.1(c-10)，114.7(c-3',5')，127.9(c-1')，128.9(c-2',6')，157.8(c-4')，163.1(c-9)，163.9(c-7)，168.5(c-5)，196.7(c-4)。以上数据与文献报道的香橙素数据基本一致[4]，根据其h2,3的耦合常数j=11.6hz，以及cd谱中291nm显示负cotton效应，328nm显示正cotton效应[5]，确定化合物2为(2r,3r)-香橙素。
化合物3黄色粉末，1h-nmr(600mhz,dmso-d6)d：6.18(1h,br.s,h-6)，6.40(1h,br.s,h-8)，6.89(1h,d,j=8.4hz,h-5')，7.54(1h,br.d,j=8.4hz,h-6')，7.67(1h,br.s,h-2')，12.50(1h,s,5-oh)；13c-nmr(150mhz,dmso-d6)d：93.7(c-8)，98.7(c-6)，103.3(c-1)，115.4(c-2')，116.2(c-5')，120.5(c-6')，122.5(c-1')，136.2(c-3)，145.6(c-3')，147.2(c-2)，148.1(c-4')，156.6(c-9)，161.3(c-5)，164.5(c-7)，176.4(c-4)。以上数据与文献报道的数据基本一致[6]，鉴定化合物3为槲皮素。
化合物4淡黄色针晶，esi-msm/z：193.0142[m-h]-，分子式c9h6o5。1h-nmr(600mhz,dmso-d6)d：6.18(1h,d,j=1.3hz,h-6)，6.32(1h,d,j=1.3hz,h-8)，8.08(1h,s,h-2)，9.20(1h,s,3-oh)，10.78(1h,s,7-oh)，12.50(1h,s,5-oh)；13c-nmr(150mhz,dmso-d6)d：94.0(c-8)，98.8(c-6)，104.8(c-10)，140.3(c-3)，141.6(c-2)，157.8(c-9)，161.7(c-5)，164.3(c-7)，177.1(c-4)。以上数据与文献报道的数据基本一致[7]，确定化合物4为3,5,7-三羟基色原酮。
化合物5白色簇状结晶，[α]25d+10.2(c0.1,meoh)；esi-msm/z：317.0667[m-h]-，分子式c16h14o7。1h-nmr(600mhz,dmso-d6)d：3.78(3h,s,3'-ome)，4.66(1h,dd,j=11.4,6.0hz,h-3)，5.04(1h,d,j=11.4hz,h-2)，5.74(1h,d,j=6.0hz,3-oh)，5.86(1h,d,j=1.8hz,h-6)，5.91(1h,d,j=1.8hz,h-8)，6.79(1h,d,j=7.8hz,h-5')，6.90(1h,dd,j=7.8,1.8hz,h-6')，7.10(1h,d,j=1.8hz,h-2')，9.11(1h,s,4'-oh)，10.83(1h,s,7-oh)，11.92(1h,s,5-oh)；13c-nmr(150mhz,dmso-d6)d：56.2(3'-ome)，71.8(c-3)，83.6(c-2)，95.5(c-8)，96.5(c-6)，100.9(c-10)，112.7(c-2')，115.4(c-5')，121.6(c-6')，128.5(c-l')，147.5(c-3')，147.8(c-4')，163.0(c-9)，163.8(c-5)，167.3(c-7)，198.4(c-4)。以上数据与文献报道的3'-o-甲基花旗松素数据基本一致[8]，根据其h2,3的耦合常数j=11.4hz，以及cd谱中290nm显示负cotton效应，330nm显示正cotton效应，确定化合物5为(2r,3r)-3'-o-甲基花旗松素。
实施例6(2r,3r)-3'-o-甲基花旗松素对脂多糖诱导的巨噬细胞分泌炎症因子的影响
1.对raw264.7细胞存活率影响
mtt结果显示，(2r,3r)-3'-o-甲基花旗松素的三个浓度干预细胞24h后，三个剂量均与空白对照组相比差异均无统计学意义（p>0.05），说明(2r,3r)-3'-o-甲基花旗松素对细胞的活性没有显著影响（见附图）。
2.no检测
no生成的影响，结果所示，模型组与空白对照组相比no的生成量显著增加，差异具有统计学意义(p<0.01)。不同剂量的(2r,3r)-3'-o-甲基花旗松素处理组与模型组比较，no的生成量显著减少，差异均具有统计学意义(p<0.01)，(2r,3r)-3'-o-甲基花旗松素低、中、高三个剂量与模型组相比较，no的含量逐渐降低，其低、中、高三个剂量的抑制率分别为22.2%、30.3%和50.6%（见附图）。
3.il-1β、il-6的检测
结果见表1。模型组与空白对照组相比，il-1β和il-6都有显著地增加(p<0.01)，而经(2r,3r)-3'-o-甲基花旗松素处理后的il-1β和il-6的分泌量与模型组相比较，都显著地降低(p<0.01)，其中，经(2r,3r)-3'-o-甲基花旗松素的低剂量和中剂量处理后的il-1β分泌量，与阳性对照组相比差异无统计学意义（p>0.05）；(2r,3r)-3'-o-甲基花旗松素的高剂量处理后的il-1β分泌量与阳性对照组相比差异具有统计学意义（p<0.01）。
表1(2r,3r)-3'-o-甲基花旗松素三个剂量对lps诱导小鼠细胞il-1β、il-6的生成情况
与空白组相比##p<0.01；与模型组相比**p<0.01；与阳性组相比δp<0.05，δδp<0.01
4.tnf-α、pge2的检测
tnf-α和pge2的生成情况如表2所示，模型对照组与空白组比较，tnf-α和pge2的生成均显著增加(p<0.01)，(2r,3r)-3'-o-甲基花旗松素给药组三个剂量与模型组比较，tnf-α和pge2的生成均显著性降低(p<0.01)。其中，在tnf-α的生成量中，(2r,3r)-3'-o-甲基花旗松素的低、中、高三个剂量呈逐渐降低趋势，(2r,3r)-3'-o-甲基花旗松素的20mg/l剂量最有效。经(2r,3r)-3'-o-甲基花旗松素的中剂量和高剂量处理后的pge2分泌量比(2r,3r)-3'-o-甲基花旗松素低剂量组分泌量低，与阳性对照组无明显差异（p>0.05）。
表2.(2r,3r)-3'-o-甲基花旗松素三个剂量对lps诱导小鼠细胞tnf-α、pge2的生成情况
与空白组相比##p<0.01；与模型组相比**p<0.01；与阳性组相比δp<0.05，δδp<0.01
文献
[1]taxifolinfromdahurianlarch-applicationfortheapprovalasnovelwww.food.gov.uk/multimedia/pdfs/taxappdos.pdf
[2]xianghh,seongsh,jish,etal.monoamineoxidaseinhibitorycomponentsfromcayratiajaponica[j].arch.pharm.res.,2007,30(1):13-17.
[3]namck,tylern.g,charlesm.s,etal.completeisolationandcharacterizationofsilybinsandisosilybinsfrommilkthistle(silybummarianum)[j].org.biomol.chem.,2003,1(10):1684-1689.
[4]eunhl,hyoungjk,yunss,etal.constituentsofthestemsandfruitsofopuntiaficus-indicavar.saboten[j].arch.pharm.res.,2003,26(12):1018-1023.
[5]chinyw,chaihb,kellerwj,etal.lignansandotherconstituentsofthefruitsofeuterpeoleracea(ac¸ai)withantioxidantandcytoprotectiveactivities[j].j.agric.foodchem.,2008,56(17):7759–7764.
[6]mitsuom,masayoshih.antimutagenicactivityofflavonoidsfromchrysanthemummorifolium[j].bioscience.biotechnologyandbiochemistry,2003,67(10):2091-2099.
[7]李勇军,何迅,刘志宝,等.荭草花水溶性化学成分的研究[j].时珍国医国药,2010,21(1):14-15.
[8]wangx,zhouh,zengs.identificationandassayof3'-o-methyltaxifolinbyuplc−msinratplasma[j].chromatogr,b2012,911c:34-42.