本发明涉及一种以聚丙烯无纺布固定琥珀酸放线杆菌发酵生产丁二酸的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术：
丁二酸也称琥珀酸，是一种重要的c4平台化合物，在食品、医疗以及化学化工等行业应用广泛。随着原油价格的上涨、生物发酵和产物提取技术的提高，生物基丁二酸已成为世界各国优先研究的战略性产品之一。
通过琥珀酸放线杆菌发酵生产丁二酸，可利用糖质原料和二氧化碳，具有良好的发展前景。然而，对于微生物发酵法，产物的生成与菌体的生长相偶联，微生物的生长速率极大地影响着产物的生产能力。利用琥珀酸放线杆菌厌氧发酵生产丁二酸存在发酵过程中微生物浓度低，且高浓度底物与高浓度产物对发酵产生抑制，不能同时获得理想的生产强度与转化率的问题。因此，如何设计新型发酵装置使其兼具菌体填装密度高和菌体可从发酵液中分离并重复使用的特点成为生物基丁二酸的研究热点。
2004年urbance等人在发酵罐中分别添置管状聚丙烯以及聚丙烯和大豆壳经共混、高温挤出的管状复合材料以固定琥珀酸放线杆菌，产物浓度可达34g/l，但生产强度仅为0.9g/l/h；2009年韩国kim等人将菌体固定在生物膜系统中进行循环连续发酵，丁二酸最高生产强度为6.63g/l/h但丁二酸浓度仅为13.26g/l。2013年nicol团队对琥珀酸放线杆菌以四氟乙烯筛作为菌体固定载体，最高实现6.35g/l/h的丁二酸生产强度，但转化率仅为65％；2014年他们以市售的poraver多孔玻璃珠填充制成柱状反应器，丁二酸转化率高达90％，但难以重复利用菌体。尽管以上的方法有的可以有效提高丁二酸的最终浓度，有的提高了丁二酸的生产强度，但是同时获得高产酸浓度、高转化率、高生产强度且能反复利用菌体的方法很少。原因可能是厌氧条件下，微生物细胞的浓度不高、菌体活力不高。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种利用固定化琥珀酸放线杆菌反复生产丁二酸的方法，以获得高的细胞浓度，提高丁二酸的浓度、转化率和生产强度。具体地，是将琥珀酸放线杆菌固定于聚丙烯无纺布载体上，通过反复分批、反复补料分批的方式实现菌体的重复利用和丁二酸的高效生产。
所述载体是纤维直径在微米级别的聚丙烯无纺布，无纺布克重为15—50g/m2、纤维外径为2.5—10.8μm、微孔孔径约0.05—1.9μm、孔隙率约30—80％，发酵液体积与无纺布表面积之比为0.5—2.5cm3/cm2。
所述将琥珀酸放线杆菌固定于聚丙烯无纺布载体上，或琥珀酸放线杆菌的吸附培养，是以1—5％的接种量在种子培养基中接入琥珀酸放线杆菌摇瓶种子，于35—40℃，在通co2的厌氧条件下培养2—4h之后，放入卷成筒状的制备成无纺布-铁丝网复合基质并使其浸没在种子培养基中，继续吸附培养2—6h；所述种子培养基含葡萄糖5—15g/l，酵母膏10—20g/l，k2hpo415—20g/l，nah2po45—10g/l，ph自然，115—121℃灭菌20min。
所述利用固定化琥珀酸放线杆菌生产丁二酸：
琥珀酸放线杆菌吸附培养后，将固定有琥珀酸放线杆菌的无纺布投入装有新鲜的25ml发酵培养基的摇瓶中。通入co2维持厌氧环境，控制发酵温度35—40℃，用碳酸镁控制ph5.8—7.2。所用的碳酸盐为碳酸镁固体或者50—80％(w/v)的碳酸镁水溶液。所述发酵培养基组成为：葡萄糖15—20g/l，玉米浆10—30g/l，k2hpo41.5—3g/l，nah2po41.5—5g/l，谷氨酸钠0.05—2g/l，蛋氨酸0.05—0.5g/l，na2s1.5g/l，ph调至6.0—6.5，115—121℃灭菌30min。
所述用固定化琥珀酸放线杆菌反复分批发酵时，发酵培养基的葡萄糖浓度为15—20g/l，发酵时间4—30h，当发酵液中葡萄糖浓度低于3g/l时，放料并更换新鲜发酵培养基，重复进行下一批次发酵，反复发酵批次5—18次，总运行时间40—200h，期间保持无菌操作，并维持发酵罐中的厌氧环境。
所述用固定化琥珀酸放线杆菌生物反应器反复补料分批发酵时，发酵培养基的葡萄糖浓度为15—20g/l，发酵时间8—15h，当发酵液中葡萄糖浓度低于10g/l时，一次性补加100g/l的葡萄糖，至反应器中葡萄糖浓度为20—50g/l，当发酵液中葡萄糖浓度低于5g/l时，重复补料过程，可补1次或者多次料，当发酵液中葡萄糖浓度再次低于5g/l时，放料并更换新鲜培养基。重复上述过程，进行下一批次发酵。总运行时间50—180h，期间保持无菌操作，并维持发酵罐中的厌氧环境。
本发明以聚丙烯熔喷无纺布为载体固定琥珀酸放线杆菌用于丁二酸的生产，相比采用其他载体(例如棉纤维)，达到相同的发酵结果所需要的载体用量更少，利于底物向微生物和产物向反应区域以外扩散。可实现菌体的反复利用并同时得到高转化率、高产酸浓度以及高生产强度。反复分批发酵过程中菌体可重复利用12次，且丁二酸产量呈现升高趋势，转化率最高87.6％，产酸浓度最高为41.5g/l，生产强度最高为2.84g/l/h。
附图说明
图1琥珀酸放线杆菌在载体表面形貌。(a)刚吸附完二级种子时；(b)第1次发酵结束；(c)第6次发酵结束；(d)第12次发酵结束。电镜放大倍数为5000倍。
具体实施方式
产物分析方法：采用高效液相色谱法分析液相色谱中产物的成分，详见cn103436561a专利。采用生物传感分析仪(如山东省科学院生物研究所sba-40c)检测菌体生长情况。
实施例1分批发酵
取克重为15g/m2的聚丙烯熔喷无纺布，121℃灭菌20min。琥珀酸放线杆菌a.succinogenescctccno:m2012036摇瓶种子在co2气氛中培养12h，培养温度为38℃，按照3％的接种量在25ml种子培养基中接入琥珀酸放线杆菌摇瓶种子，于35℃，通co2的厌氧条件下培养3h之后放入无纺布并使其浸没在种子培养基中，继续吸附培养3h。种子培养基含葡萄糖8—12g/l，酵母膏10—14g/l，k2hpo415—17g/l，nah2po45—7g/l，ph自然，115℃灭菌20min。
琥珀酸放线杆菌吸附培养后，将固定有琥珀酸放线杆菌的无纺布投入装有新鲜发酵培养基的摇瓶中，发酵液体积与无纺布表面之比为0.5、1.0、1.5、2.0cm3/cm2。发酵培养基：葡萄糖20g/l，玉米浆20—30g/l，k2hpo42—2.8g/l，nah2po42.0—3.5g/l，谷氨酸钠1—2g/l，蛋氨酸0.09—0.2g/l，na2s0.08—1.5g/l，ph调至6.0，115℃灭菌30min。通入co2维持厌氧环境，控制发酵温度35℃，用碳酸镁固体控制ph5.8—7.2，结果见表1。
表1不同发酵液体积与无纺布表面之比下反应器生产丁二酸
实施例2反复分批发酵
参照实施例1的方法进行反复分批发酵实验。发酵液体积与无纺布表面之比为1.0cm3/cm2，初始糖浓度为20g/l，每隔3h取样测定产酸情况，当发酵液中葡萄糖浓度低于5g/l时，发酵时间平均为15h。更换新鲜发酵培养基，重复进行下一批次发酵，反复发酵批次11次，总运行时间120h，结果见表2。根据表中结果，发现随着发酵批次的增加，丁二酸产量有增加趋势。
表2反应器反复分批发酵产丁二酸
通过扫描电镜观察重复利用过程中琥珀酸放线杆菌在载体表面的形貌，如图1所示。从(a)可知，初始菌体在载体上的覆盖量不大；随着第1次发酵的完成，菌体在载体上迅速生长；到了第6次发酵结束，肉眼可见载体表面覆盖较多菌体；第12次发酵结束后，载体表面覆盖一层致密的菌体。这一结果说明经过反复分批发酵，聚丙烯无纺布能有效吸附琥珀酸放线杆菌且菌体在无纺布上生长增殖，从而有利于丁二酸的生产。
实施例3发酵液葡萄糖浓度对发酵产琥珀酸的影响
参照实施例1的方法进行分批发酵实验。发酵液体积与无纺布表面之比为1.0cm3/cm2，初始糖浓度为10—30g/l，每隔3h取样测定产酸情况，当发酵液中葡萄糖消耗完时，结束发酵，结果见表3。
表3发酵液葡萄糖浓度对发酵产琥珀酸的影响
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。