一种与番茄耐盐性紧密连锁的分子标记及应用的制作方法

本发明属于番茄育种和分子生物学领域，更具体地涉及一种与番茄耐盐性紧密相关的分子标记，同时还涉及一种与番茄耐盐性紧密相关的分子标记在番茄耐盐育种中的应用。

背景技术：

土壤盐渍化是对植物影响最严重的非生物胁迫之一，影响了100多个国家共10亿公顷土地，严重影响农作物及蔬菜产量和品质。当前，全球气候变化进一步导致干旱和盐土面积不断扩大，同时设施农业的发展导致土壤次生盐渍化现象逐年加重。目前，全球土壤盐渍化面积每年以10％的速度递增。据统计，中国约有3690万公顷盐渍化土地，约占可利用土地面积的4.9％。番茄是露地和保护地种植的最重要农作物之一，而土壤盐渍化已经成为制约番茄产业持续健康发展的重要因素。

盐胁迫影响番茄的整个生长发育过程，包括种子萌发、芽和根的发育、幼苗生长、花的发育、果实发育与成熟、植株的衰老，严重时导致植株死亡。研究发现，受盐胁迫后，番茄的发芽率降低、发芽时间延长，植株对k⁺、ca²⁺的吸收受到影响。

盐胁迫对植物的伤害可归纳为四个方面：一是渗透胁迫。水是植物体重要组成部分，参与植物整个生命过程，同时还起到维持细胞膨压、促进生长、保持植物生物学形态的作用。土壤中高浓度的盐降低土壤水势，使得植物根部细胞吸水困难甚至脱水，造成植物生理性干旱，影响生长发育。植物在受到渗透胁迫时，自身也会产生防御反应，通过合成渗透调节物质来增大细胞质浓度，提高细胞渗透压，降低水势，减少细胞失水。二是离子毒害。土壤中大量盐分累积，一方面导致na⁺过量吸收造成毒害，另一方面阻碍对k⁺、ca²⁺等其他离子的吸收，使植物离子吸收不平衡，引起离子毒害。三是盐胁迫对酶活性的抑制。植物体内的生理代谢活动是复杂而又相互影响的，由盐胁迫直接造成的影响又会造成更加复杂的生理变化。研究发现，盐胁迫后，番茄在各个时期的净光合速率、气孔导度、胞间二氧化碳浓度和蒸腾速率显著降低，而且随着胁迫增强加重，各指标进一步降低。四是氧化胁迫。植物在正常条件下活性氧含量很低，在体内保持动态平衡，参与植物的细胞信号转导等过程。当植物受到非生物胁迫时，植物体内活性氧代谢失衡，活性氧积累，由于其具备极强的氧化能力，会对细胞结构和生理代谢活动造成氧化胁迫，包括脂膜过氧化、生成mda、膜结构破坏，最终导致许多代谢反应紊乱。

目前番茄耐盐育种处于起步阶段，而且主要采用常规手段。传统的育种手段存在耗时、费力、准确性差、易受环境因素影响等弊端。而基于分子标记辅助选择(markerassistedselection，mas)技术的分子标记辅助育种，是作物分子育种的重要手段。它能够快速高效的获得含有目标基因的个体，因而得到广大育种家的青睐。

番茄耐盐性是栽培番茄重要的育种目标之一。目前耐盐方面的标记还很少见，更重要的是没有通用性。申请人首次发明了可用于番茄耐盐性鉴定的通用性分子标记。利用该标记可以有效筛选当前番茄资源中的耐盐资源，同时可以结合常规育种手段将番茄耐盐主效控制基因快速准确地导入到优良番茄亲本中，创建新的抗逆种质资源，选育抗逆新品种，促进番茄产业的持续健康发展。同时，该发明也为克隆番茄耐盐主效基因，进而解析番茄耐盐分子机理奠定了重要基础。可以预见，该通用性标记具有重要应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种与番茄耐盐性紧密相关snp位点在番茄耐盐性育种中的应用，所述的snp位点为番茄基因solyc04g078840编码序列的第1275位碱基。

本发明的另一个目的在于提供针对番茄solyc04g078840编码序列的第1275位碱基变异所设计的分型引物在番茄耐盐性育种中的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

与番茄耐盐性紧密相关snp位点的获得：

1)以不耐盐栽培番茄ts-3为母本，耐盐野生醋栗番茄ts-21为父本，构建ril群体。

2)ril群体的第6代种植于玻璃温室，两叶一心时保存各个植株的少量样品。

3)番茄幼苗五叶一心时，对幼苗进行500mmnacl溶液浸泡2小时的盐胁迫处理。5天后，统计植株生长状态，记录最先死亡的植株(敏感)和最后存活的植株(耐盐)各30株。

4)利用ctab法提取先死亡的30株和后死亡的30株的dna，分别等摩尔量混合成盐敏感池和耐盐池。利用truseqdnaltsampleprepkit(illumina公司)对盐敏感池和耐盐池dna分别建库，通过illuminahiseq2000平台测序。获得的数据利用自主开发的perl脚本提取多态性snp，并且计算snp指数(snp-index)。进一步计算两个池snp-index的差值(即δsnp-index)并作图。

5)耐盐主效qtl的精细定位。通过步骤4)获得耐盐qtl的染色体区域。进一步分析目的区段内的dna序列变异，设置indel和snp标记，对目标区域的重组ril系进行分析，结合耐盐性鉴定结果进一步缩小定位区域至210kb。深入分析精细定位区域的dna变异，候选耐盐基因，最终发现番茄基因solyc04g078840编码序列的第1275位碱基变异与耐盐性显著相关。

因此，通过利用本领域的常规技术，对番茄基因solyc04g0788400编码序列的第1275位碱基进行检测，可用于番茄耐盐性育种。

针对番茄solyc04g078840编码序列的第1275位碱基变异设计的分型引物在番茄耐盐性育种中的应用，所述的应用包括，与该定位区段序列匹配且末端为检测该snp变异的引物用于番茄耐盐性育种；或是针对该snp变异并根据该定位区段序列设计的各类引物和/或探针用于番茄耐盐性育种。

具体的，本发明提供的与该定位区段序列匹配且末端为检测该snp变异的引物为优选方案，例如下述引物：

stq4-f:5′-catttttgtgacacaggtttcg-3′

stq4-r:5′-tttagacagcatactgaaaatcg-3′。

利用stq4-f和stq4-r对待测植株dna进行pcr检测和pcr产物电泳分析，当出现522bp特异条带时，可判定番茄植株为耐盐植株；当没有特异条带出现时，预测植株为盐敏感植株，可用于番茄耐盐性的早期辅助选择。

与现有技术相比，本发明具备以下优点：

本发明的积极效果是有效解决了常规育种方法中存在的耐盐性鉴定困难、周期长、选择效率低、易受环境影响等缺点，从而做到准确高效地进行番茄耐盐性的早期鉴定和辅助选择，极大降低了育种材料的田间种植规模和后期鉴定工作量，从而大幅度节省人力、物力和财力成本，有效提高了选择效率和准确性，加快育种进程。更为重要的是，该分子标记为通用性分子标记，受遗传材料的限制小，应用面广泛。

附图说明

图1δ(snp-index)分析盐敏感池和耐盐池；

其中a：1-12号染色体，b：4号染色体。黑色箭头所指为耐盐主效qtl位置。

图2利用stq4标记对番茄种质的耐盐性分析。

其中522bp带型表示能够利用stq4通过pcr扩增得到522bp的特异条带，0bp带型表示不能扩增得到条带。

具体实施方式

本发明实施例的举例不构成对本发明的任何限制。在下面的实验步骤中，除非特别说明，否则所有操作均按照《分子克隆实验指南》(第三版)(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002)所提供的方法进行。

实施例1：

一种番茄耐盐分子标记stq4，通过以下方法获得：

1.群体构建

盐敏感型栽培番茄ts-3，耐盐野生醋栗番茄ts-21，均为重测序番茄种质资源(linetal.naturegenetics2014,46:1220-1226)，以ts-3为母本，ts-21为父本杂交得到f1，再自交得到f2，利用单子传代法构建ril群体。

2.耐盐性鉴定

(1)把ril6群体种植于7×7cm含有等量营养土的黑色方钵中，2个重复。植株生长于温室中，温度为25±2℃，16h光照/8h黑暗的光周期，光照强度为3500lux，正常肥水管理。

(2)幼苗2叶1心时，取各系植株的少量样品冻存于2.0ml离心管中保存备用。

(3)幼苗5叶1心时，将幼苗置于含有500mmnacl的溶液中浸泡2小时，使营养土充分吸水。5天后，统计植株生长状态，记录最先死亡的植株与最后存活的植株。选取2个重复表型一致的先死亡的30个植株与最后存活的30个植株。

3.耐盐主效qtl分析

利用ctab法提取先死亡的30株和后死亡的30株的dna，分别等摩尔量混合成盐敏感池和耐盐池。利用truseqdnaltsampleprepkit(illumina公司)对盐敏感池和耐盐池dna建库，通过illuminahiseq2000平台测序。获得的数据利用自主开发的perl脚本提取多态性snp，并且计算snp指数(snp-index)。进一步计算两个池snp-index的差值(即δsnp-index)并作图(图1)。

4.耐盐主效qtl的精细定位

通过步骤3获得耐盐qtl的染色体区域。进一步分析目的区段内的dna序列变异，设计indel和snp标记，对目标区域的重组ril系进行分析，结合耐盐性鉴定进一步缩小定位区域至210kb。

5.分子标记开发

深入分析精细定位区域的dna变异，候选耐盐基因，最终发现番茄基因solyc04g078840编码序列的第1275位碱基变异与耐盐性显著相关，针对该位点设计引物，并将序列变异转化为功能标记stq4，所述的引物序列为：stq4-f:5′-catttttgtgacacaggtttcg-3′，stq4-r:5′-tttagacagcatactgaaaatcg-3′。

实施例2：

番茄耐盐分子标记stq4的验证：

利用获得的耐盐分子标记引物，对实施例1步骤2筛选到的盐敏感的30份材料和耐盐的30份材料进行耐盐性鉴定，其步骤如下：

(1)以番茄基因组dna为模板，浓度为80-120ng/μl；采用分子标记stq4进行pcr扩增，其正向引物序列为seqidno.1，反向引物序列为seqidno.2。pcr反应体系：总体积为15μl，具体成分如下：ddh2o10.4μl，10×pcrbuffer1.5μl，1.2μldntps(2mmol/l)，0.08μltaqdna聚合酶(5u/μl)，0.4μl正向引物(10ng/μl)(序列seqidno.1)，0.4μl反向引物(10ng/μl)(序列seqidno.2)以及1.0μldna模板(100ng/μl)。

(2)pcr反应在美国bio-rad公司生产的s1000型pcr仪上进行。pcr扩增程序：95.0℃预变性2min；94.0℃变性30s，52.0℃复性30s，72.0℃延伸30s，30个循环；72.0℃延伸5min，4℃保存。

(3)扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，若出现522bp(seqidno.3所示)的特异性条带，则判定为耐盐材料；若无条带出现，则为非耐盐性材料。

结果为：在30份盐敏感材料中，没有特异带型的材料共28份，占93.3％；在耐盐的30份材料中，出现522bp条带的材料共29份，占96.7％。

上述鉴定结果表明，在育种中通过分子标记鉴定筛选，保留出现522bp特异带型的材料，淘汰没有特异条带的材料，即可显著增强番茄耐盐性，提高选择效率，减少后期筛选鉴定的工作量，加速育种进程。

实施例3：

番茄耐盐分子标记stq4在番茄耐盐育种中的应用：

1)利用实施例2中的方法，对204份番茄种质(包括栽培番茄、野生番茄)进行pcr鉴定，选取能扩增得到522bp特异条带的材料19份(ts-7、ts-8、ts-13、ts-17、ts-18、ts-19、ts-20、ts-22、ts-56、ts-79、ts-80、ts-87、ts-116、ts-123、ts-144、ts-164、ts-208、ts-226、ts-295)。

2)对上述获得的材料进行耐盐性鉴定，同时以没有扩增出条带的5份栽培番茄(ts-131、ts-165、ts-166、ts-195、ts-201)和4份醋栗番茄(ts-16、ts-24、ts-77、ts-92)为对照。具体步骤为：

(1)把分子标记筛选出的各耐盐材料植株种植于芽苗盘中，每个材料8株，随机分布，3个重复。植株生长于温室中，温度为25±2℃，16h光照/8h黑暗的光周期，光照强度为3500lux，正常肥水管理。

(2)幼苗5叶1心时，置于含有500mmnacl的溶液中处理2小时，使营养土充分吸水。

(3)7天后，记录各系植株生长状态，分级统计并计算耐盐指数。结果表明，能扩增得到522bp特异条带的19份材料中，有18份其耐盐指数远高于没有特异扩增条带的栽培番茄和醋栗番茄材料，符合率达到94.7％(图2)。

以上结果充分说明，该标记同时具有通用性和准确性，可以应用于番茄耐盐性的预测、鉴定和筛选。

sequencelisting

<110>华中农业大学

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