检测微小隐孢子虫的荧光定量PCR引物、探针、试剂盒及方法与流程

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及法一种检测微小隐孢子虫的荧光定量pcr引物、探针、试剂盒及方法。

背景技术：

微小隐孢子虫(学名：cryptosporidiumparvum)是引起隐孢子虫病的其中一种病原寄生虫，主要寄生在哺乳动物的肠道，尤其流行于反刍动物中，除了牛以外，能传播微小隐孢子虫的还有啮齿动物、羊和家养宠物等，除了动物传播外，还可能通过粪污染传染至人类。其感染的主要途径是饮用了含小隐孢子虫卵囊(oocysts)的水所引起。症状通常于感染后7天左右出现，包括腹痛、水泻、呕吐及发热。大部分患病后的病症持续6-10天，但也有可能会持续数星期。免疫功能低下患者病情可能非常严重，甚至威胁生命。目前认为已发现的隐孢子虫至少有6种，人和哺乳动物的隐孢子虫感染几乎都是由微小隐孢子虫所引起。临床表现包括急性胃肠炎型和慢性腹泻型。

微小隐孢子虫也是引起断奶前犊牛发生腹泻的主要病原之一，常规检测微小隐孢子虫方法包括形态学鉴定、酶联免疫吸附实验、巢式pcr等方法。随着荧光定量pcr技术在分子生物学领域的应用为病原检测带来了新的方法。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明实施例提供了一种检测微小隐孢子虫的荧光定量pcr引物、探针、试剂盒及方法，主要目的是提供一种操作方便、灵敏度和特异性高的新的检测方法。

为达到上述目的，本发明主要提供了如下技术方案：

一方面，本发明实施例提供了一种检测微小隐孢子虫的荧光定量pcr引物，所述引物的序列为：

上游引物：ttagacggtagggtcg；

下游引物：gcaaattacccaatcctaa。

另一方面，本发明实施例提供了一种检测微小隐孢子虫的荧光定量pcr探针，所述探针的序列为：cy5-taaggaaggcagcag-bhq1。

又一方面，本发明实施例提供了一种检测微小隐孢子虫的探针荧光定量pcr检测试剂盒，所述试剂盒包括上述pcr引物和上述pcr探针。

作为优选，所述试剂盒包括：tris-hcl缓冲液、kcl、mgcl2、dntp、dmso、甘油、udg酶、taq酶。

作为优选，所述试剂盒采用25μl体系；所述tris-hcl缓冲液的ph为8.3，浓度为1-10mmol/l；所述kcl的浓度为30-50mmol/l；所述mgcl2的浓度为0.1-2.5mmol/lmgcl2，所述dntp的浓度为0.1-0.2mmol/l；所述上游引物和所述下游引物的浓度均为0.1-10mmol/l，所述探针的浓度为0.1-5mmol/l；所述dmso的浓度为1-5％；所述甘油的浓度为2-5％；所述udg酶的酶活力为0.1-0.4u；所述taq酶的酶活力为0.1-1u；所述试剂盒可在100分钟内完成微小隐孢子虫检测。

作为优选，所述方法包括：将探针、上、下游引物、dntp、taq聚合酶制成干粉状加入到定量的检测管中；向检测管中加入已提取好的待检核酸，用水补齐至所述检测管的预设刻度线；盖上所述检测管的管盖并放入荧光pcr仪中进行反应。

作为优选，所述pcr的反应条件：第一阶段设计为95℃，5min；第二阶段设计为95℃，10s，60℃，45s，40个循环，并在60℃时采集荧光。

作为优选，所述检测方法的结果判定：

当检测结果呈现无ct值，无扩增曲线或反应曲线无明显对数期判定为阴性；

当检测结果出现ct值＜35，并且扩增曲线有明显的对数增长期，判定为荧光pcr阳性；

当检测结果出现ct值35＜ct值＜40，则需要样品重测；

当复测的ct值＜40，且扩增曲线有明显的对数增长期，则判定为阳性。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明针对微小隐孢子虫病，设计了一对引物、一个探针以及包括该引物对和探针的检测试剂盒，采用该试剂盒可以检测出微小隐孢子虫，该试剂盒的最低检出限度为5×10²个卵囊/ml；本发明从荧光定量pcr技术为微小隐孢子虫病原检测带来了新的方法，可用于实验室检测和牧场现场检测；采用上述试剂盒的检测方法操作简单，具有较好的灵敏性和特异性。

附图说明

图1是本发明对比例1提供的隐孢子虫种凝胶电泳图；

(m为mark，p为阳性对照，n为阴性对照)

图2是本发明实施例2提供的利用本试剂盒对1个c.bovis，2个c.andersoni，4个c.ryanae检测曲线图；

图3是本发明实施例2提供的采用本试剂盒检测c.parvum扩增曲线图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效,以下以较佳实施例，对依据本发明申请的具体实施方式、技术方案、特征及其功效，详细说明如后。下述说明中的多个实施例中的特定特征、结构、或特点可由任何合适形式组合。

实施例1

本实施例1利用引物设计软件，根据引物设计原理，针对微小隐孢子虫设计了pcr引物对和具有特异性的探针；

上游引物序列为：ttagacggtagggtcg；(seqidno.1)

下游引物序列为：gcaaattacccaatcctaa；(seqidno.2)

探针序列为：cy5-taaggaaggcagcag-bhq1；(seqidno.3)

根据上述引物对和探针设计了检测试剂盒，本试剂盒采用25μl体系，含有1～10mmol/ltris-hcl(ph＝8.3)、30～50mmol/lkcl、0.1～2.5mmol/lmgcl2、0.1～0.2mmol/ldntp、上下游引物各0.1～10mmol/l、探针0.1～5mmol/l、dmso为1～5％、甘油为2～5％、0.1～0.4uudg酶、0.1～1utaq酶。

本试剂盒采用八连管结构，将探针上、下游引物、dntp、taq聚合酶制成干粉状，在使用时只需加入一定量的模板，用水将体积补充到刻度线，按照本试剂盒给出的程序设定程序，即可得出结果；本产品适用于实验室检测和牧场现场检测；本试剂盒可在100分钟内完成微小隐孢子虫检测。

使用方法：将8连管瞬时离心，以离心掉管壁上附着的粉末。加入已提取好的待检核酸2μl，用水补齐至25μl刻度。盖上管盖放入荧光pcr仪中。

反应条件设置：第一阶段95℃、5min。第二阶段：95℃、10s，60℃、45s，40个循环，在60℃时采集荧光。荧光素设定：报告荧光设定为cy5，淬灭荧光设置为none。也可根据不同品牌仪器说明等效设置参数。

结果判定：

当检测结果呈现无ct值，无扩增曲线或反应曲线无明显对数期判定为阴性；

当检测结果出现ct值＜35，并且扩增曲线有明显的对数增长期，判定为荧光pcr阳性；

当检测结果出现ct值35＜ct值＜40，则需要样品重测；

当复测的ct值＜40，且扩增曲线有明显的对数增长期，则判定为阳性。

实施例2

采用本发明实施例1的方法检测犊牛的微小隐孢子虫，检测结果如图2和图3。图2利用本试剂盒对1个c.bovis，2个c.andersoni，4个c.ryanae进行检测，有扩增曲线的为阳性对照；如图2示c.bovis，c.andersoni，c.ryanae均未有明显的扩增曲线(ct值＝40)，表明该试剂盒有较好的特异性。图3用本试剂盒检测c.parvum扩增曲线图。

对比例1

常规方法：鉴定隐孢子虫种常用方法是利用巢式pcr方法，对18srrnassu基因片段进行扩增，得到目标片段后进行凝胶核酸回收纯化。将纯化后得到的核酸送往测序公司进行基因测序，将得到的基因序列与ncbi上的序列进行比对得出隐孢子虫的类型，这一方法不能针对性的检测出微小隐孢子虫。

①提取腹泻犊牛粪便dna，

②使用巢式pcr方法进行隐孢子虫种扩增，

③核酸凝胶电泳，观察目标条带(图1示)，

④凝胶核酸回收，

⑤基因测序，

⑥ncbiblast比对，确定隐孢子虫类型。

用对比例1的常规方法检出c.bovis1个(99％相似kt922232)5个c.parvum(2个与ah00657299％相似，1个与mf16758799％相似，3个与kt15154899％相似)，微小隐孢子虫参考株如图2示(与ku67936499％相似)。c.andersoni2个(与kf271469和kf27146599％相似)。c.ryanae4个(3个与kt92223399％相似，1个与kt9222399％相似)。

由以上对比试验数据可知，本试剂盒能直接鉴定出微小隐孢子虫。由于常规的隐孢子虫鉴定方法(巢式pcr)需要进行凝胶电泳、核酸纯化、碱基测序。所以耗费较长的时间(>1day)，而本试剂盒采用探针法，无需进行凝胶电泳、核酸纯化、碱基测序，将检测时间大大缩短(<100min)，在微小隐孢子虫检测率上从目前数据来看差异不显著(p>0.05)，因此，本发明的检测试剂盒在微小隐孢子虫快速检测领域具有一定的先进性，可提高检测效率。

本发明实施例中未尽之处，本领域技术人员均可从现有技术中选用。

以上公开的仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以上述权利要求的保护范围为准。

序列表

<110>河南省奶牛生产性能测定中心

<120>检测微小隐孢子虫的荧光定量pcr引物、探针、试剂盒及方法

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>16

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ttagacggtagggtcg16

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gcaaattacccaatcctaa19

<210>3

<211>15

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

taaggaaggcagcag15