本发明属于生物医学领域，涉及用于诊断儿童i型糖尿病的分子标志物。
背景技术：
：i型糖尿病(t1dm)为在遗传基础上由环境因素激发的、自身免疫介导的以胰腺β细胞受损为特征的自身免疫性疾病，是一种由于胰岛素缺乏或作用不足引起的能量代谢疾病。通常在儿童、少年、青年时期被诊断，发病风险最高的年龄段是10-14岁，青少年以后，发病率下降。儿童i型糖尿病以往多指小于15岁发生的糖尿病，由于who(世界卫生组织)已经儿童定义为0-18岁，因此儿童糖尿病应指小于18岁发生的糖尿病。儿童1型糖尿病的临床表现为多尿、多饮、多食及消瘦。儿童1型糖尿病比成人糖尿病重，起病较急，不易早期发现，胰岛β细胞的功能可出现明显下降甚至发展为衰竭，早期并发症即可出现，如糖尿病酮症甚至酸中毒，如处理不及时或不当，可能危及生命。i型糖尿病确切发病机制尚未完全阐明，目前认为是遗传、免疫和环境因素共同作用所致。高通量测序技术(high-throughputsequencing)是指能够一次并行对几十万到几百万条dna分子进行序列测定，每一次序列测定的读长一般较短的测序技术。高通量测序技术是对传统测序一次革命性变革，随着2005年罗氏的454测序仪及2006年solexa测序仪出现后飞速发展，2009年左右高通量测序技术在国内兴起。高通量测序类型分为多种，基因芯片、基因深度测序(genomere-sequencing)、转录组深度测序(transcriptomere-sequencing又称rna-seq)等。细胞的功能是从基因的表达开始的，转录组是指某一时间细胞内所有基因转录而来的rna总称。通过高通量测序技术可获得基因表达的rna水平有关信息，可以揭示基因表达与一些生命现象之间的内在联系。高通量测序技术的快速发展和应用，为儿童i型糖尿病发病机理的研究提供了更加全面和快速的分析手段，也为儿童i型糖尿病的进一步治疗方案提供崭新思路。深入研究儿童i型糖尿病相关基因的调控机制，有助于了解儿童i型糖尿病的遗传分子机制，为寻找新的药物提供理论依据。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种用于诊断儿童i型糖尿病或者预测儿童i型糖尿病预后的基因标志物。本发明利用芯片和qpcr实验证明了mon1b基因在儿童i型糖尿病患者的血液中的表达水平显著高于正常儿童，因此可将mon1b基因作为诊断儿童i型糖尿病或者预测儿童i型糖尿病预后的基因标志物。根据本发明的一个方面，本发明提供了检测mon1b基因表达的试剂在制备儿童i型糖尿病辅助诊断或预测预后产品中的应用。进一步，所述试剂包括检测mon1b基因mrna表达水平的试剂，和/或检测mon1b蛋白表达水平的试剂。检测mon1b基因mrna表达水平的试剂是如pcr、如southern杂交、northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(fish)、dna微阵列、aso法、高通量测序平台等定性地、定量地、或半定量地检测基因mrna表达水平的方法中使用的任何试剂。进一步，所述检测mon1b基因mrna表达水平的试剂包括qpcr中使用的引物，和/或探针。在本发明的具体实施方案中，所述检测mon1b基因mrna表达水平的试剂包括qpcr中使用的引物，所述引物序列如seqidno.1和seqidno.2所示。上面所述的引物可以通过化学合成来制备，使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。前面所述的探针可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。检测mon1b蛋白表达水平的试剂是如elisa、放射免疫测定法、免疫组织化学法、western印迹等能够检测蛋白表达水平的方法中使用的任何试剂。本发明可用于检测mon1b蛋白表达水平的试剂包括针对mon1b蛋白的抗体，所述抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)。前面所述的本发明的所述产品检测的样本不受特别限制，只要它适于本发明的测定；例如，它可以包括组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材料。在本发明的具体实施方案中，所述样本来自受试者的血液。根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种用于儿童i型糖尿病辅助诊断或预测预后的产品，所述产品包括前面所述的检测mon1b基因表达的试剂。进一步，本发明前面的所述产品包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断儿童i型糖尿病的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知mon1b基因的异常与儿童i型糖尿病相关也属于mon1b基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。本发明还提供了一种儿童i型糖尿病辅助诊断或预测预后的方法，所述方法包括如下步骤：(1)获取受试者含有mon1b基因表达产物的样本；(2)检测样本中mon1b基因或蛋白的表达水平；(3)将测得的mon1b基因或蛋白的表达水平与受试者的患病与否关联起来；(4)与正常儿童相比，如果mon1b基因或蛋白的表达水平升高，则该受试者被诊断为儿童i型糖尿病，或儿童i型糖尿病患者被确定为预后差。在本发明的上下文中，“诊断儿童i型糖尿病”既包括判断受试者是否已经患有儿童i型糖尿病、也包括判断受试者是否存在患有儿童i型糖尿病的风险。预测预后是指预测患者状况的过程或结果，并不意味着能以100％的准确度预测患者状况的过程或结果。预测预后是指确定某些过程或结果的可能性是否增加，而并不意味着通过与某些过程或结果不发生的情况比较来确定发生某些过程或结果的可能性。如本发明而言，本发明中mon1b基因或mon1b蛋白的水平升高的患者中，与不显示该特征的人相比，更有可能观察到特定过程或结果。如本文所用，术语”抗体”，意指特异性结合至特定抗原或与特定抗原相互作用的任意抗原-结合分子或分子复合体，其包含至少一个互补决定区(cdr)。术语”抗体”包括含有4个多肽链(即，通过双硫键相互连接的2个重(h)链以及2个轻(l)链)以及其多聚体(例如igm)。每个重链含有重链可变区以及重链恒定区。重链恒定区含有3个结构域ch1、ch2和ch3。每个轻链含有轻链可变区以及轻链恒定区。轻链恒定区含有一个结构域(cl1)。vh与vl区可进一步细分成高变区(称为互补决定区(cdr))，其中散布着较保守的称为框架区(fr)的区域。每个vh和vl均由三个cdr和四个fr组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3和fr4。如本文所用，术语“抗体”还包括整个抗体分子的抗原结合片段。抗体的抗原结合片段可以利用任何适宜的标准技术，例如蛋白水解消化或涉及编码抗体可变区和任选恒定区的dna的操纵和表达的重组基因改造技术，从例如完整的抗体分子衍生。这样的dna是已知的及/或很容易从例如市售来源、dna库(包括例如噬菌体-抗体库)获得，或可以被合成。该dna可以被测序且以化学方法或分子生物学技术加以操纵，从而例如将一个或多个可变区和/或恒定区排列成适宜的构型，或引入密码子、产生半胱氨酸残基、修饰、添加或删除氨基酸等。抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)fab片段；(ii)f(ab')2片段；(iii)fd片段；(iv)fv片段；(v)单链fv(scfv)分子；(vi)dab片段；以及(vii)由模拟抗体高变区(例如孤立的互补决定区(cdr)，如cdr3肽)的氨基酸残基组成的最小识别单元或约束型fr3-cdr3-fr4肽。抗原结合片段还包括其它工程化的分子，如结构域特异性抗体、单域抗体、结构域缺失的抗体、嵌合抗体、cdr移植的抗体、双抗体、三抗体、四抗体、微抗体、纳米抗体(例如单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小模块免疫药物(smallmodularimmunopharmaceuticals)(smip)，以及鲨鱼可变ignar域。“单克隆抗体”是由单克隆的b-淋巴细胞或由已经将编码单个抗体(或其抗原结合片段)的抗体轻链和重链可变区的核酸转染至其中的细胞或其后代产生的抗体。单克隆抗体通过本领域技术人员已知的方法产生，例如通过从骨髓瘤细胞与免疫脾细胞的融合制造杂合抗体形成细胞来进行。这些融合细胞和它们的后代被称为“杂交瘤”。“多特异性抗体”可以是对一个标的多肽的不同表位具有特异性或者可能含有对超过一个标的多肽具有特异性的抗原-结合域。参见例如tutt等,1991,j.immunol.147:60-69；kufer等,2004,trendsbiotechnol.22:238-244。抗体或其片段在功能上可以链接(例如，通过化学偶合、遗传融合、非共价缔合或其他方式)至一或多个其他分子实体，诸如另一个抗体或抗体片段，以产生带有第二种结合特异性的双特异性或多特异性抗体。具体的实施方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1筛选儿童i型糖尿病患者和正常儿童中差异表达的基因1、临床对象：内分泌科初次就诊的儿童i型糖尿病(按who1999年糖尿病诊断标准)住院患者10例，其中男5例，女5例，年龄5-16岁；正常对照组8例，其中男3例，女5例皆为健康体检者，无糖尿病家族史，并排除内分泌疾患及其他慢性疾病，年龄5-16岁，与糖尿病患儿性别、年龄无统计学差异。本研究经医学伦理委员会备案并批准，入选患儿及健康对照儿童合法监护人均签署临床研究同意书。2、样本采集与样本rna提取(1)采血：抽取外周静脉血3～5ml，注入含肝素钠的洁净试管中；(2)准备离心：取步骤(1)所得的肝素抗凝静脉血与hank氏液等量混匀，分别在两支试管中加入2～4ml的淋巴细胞分离液，再将上述混合液5～10ml叠加于淋巴细胞分离液的液面上；(3)获取血液中的单核细胞：将步骤(2)中的试管经2000～2500g水平离心15～20min后溶液分为3层，上层为血浆和hank氏液，中层为淋巴细胞分离液，下层主要为红细胞和粒细胞，在上、中层界面处有一以单核细胞为主的白色狭窄带，用干净毛细管插到该白色狭窄带层，吸出单核细胞，并移入试管中，加入1～5mlhank氏液，洗涤细胞，1500～2000g水平离心10～15min，弃上清液；(4)提取总rna：在已经洗涤过的单核细胞沉淀中加入trizol试剂1～5ml，消化3～5min；将细胞裂解液吸到ep管中，加氯仿0.2～1.0ml，轻摇15～60s，室温静置5～10min，10000～12000g离心10～15min，取上清无色水相液到ep管中，加异丙醇0.5～1.5ml，静置10～20min，10000～12000g离心10～15min，弃上清，在管底见微量白色总rna沉淀；(5)rna检测：用无水乙醇洗涤rna沉淀后，10000～12000g离心5～10min，吸尽上清液，在超净台中以无菌风吹干残余乙醇，加入无菌双蒸水10～20μl，打匀，55～60℃水浴10-20min溶解总rna，测od260和od280值，检测其纯度，在琼脂糖凝胶中电泳，鉴定所提取rna的完整性；(6)若od260/od280比值＞1.8，说明rna的纯度较高，则进入后续实验；若od260/od280比值＜1.8，说明rna的纯度不够，应重复步骤(4)，直至符合要求即od260/od280比值＞1.8为止；若在琼脂糖凝胶电泳中至少能见到两条界限分明的rna带，说明rna质量较高，降解较少，否则应重新提取总rna。3、高通量转录组测序(1)rna-seq读段定位首先将低质量的读段去除得到清洁读段，然后利用tophatv1.3.1将清洁片段与ucsch.sapiens参考基因组(hg19)进行匹配，h.sapiensucschg19版的预先构建的索引从tophat主页下载，并作为参考基因组，利用tophat与基因组匹配时，允许每个读段(默认到20)有多个匹配位点，最多2次错配。tophat根据外显子区域和gt-ag剪切信号建立可能的剪切位点库，根据这些剪切位点库将没有定位到基因组的读段定位到基因组上。我们使用tophat方法的系统默认参数。(2)转录丰度评估匹配上的读段文件通过cufflinksv1.0.3处理，cufflinksv1.0.3将rna-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。fpkm值指的是每一百万测序片段中匹配到特定基因1kb长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算fpkm估计值的置信区间。cufflinks使用的参考的gtf注释文件从ensembl数据库下载(homo_sapiens.grch37.63.gtf)。(3)差异表达基因的检测将下载的ensemblgtf文件和通过tophat匹配的原始文件传输到cuffdiff，cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算gtf文件中列出的转录本的表达丰度，检测差异表达。在cuffidff输出中只有q值＜0.01，测试显示成功的比较才被认为是差异表达。6、结果rna-seq结果显示，与正常儿童与儿童i型糖尿病患者血液中存在差异表达基因共443个，其中，在儿童i型糖尿病患者血液中表达上调的基因有251个，表达下调的基因是192个。实施例2实时荧光定量pcr实验验证儿童i型糖尿病患者和正常儿童中差异表达的基因1、临床对象：内分泌科初次就诊的儿童i型糖尿病(按who1999年糖尿病诊断标准)住院患者120例，其中男64例，女59例，年龄5-16岁(9.99士3.28)岁；正常对照组78例，其中男38例，女40例皆为健康体检者，无糖尿病家族史，并排除内分泌疾患及其他慢性疾病，年龄5-16(10.51士3.25)岁，与糖尿病患儿性别、年龄无统计学差异。本研究经医学伦理委员会备案并批准，入选患儿及健康对照儿童合法监护人均签署临床研究同意书。2、血液总rna提取(1)采血：抽取外周静脉血3～5ml，注入含肝素钠的洁净试管中；(2)准备离心：取步骤(1)所得的肝素抗凝静脉血与hank氏液等量混匀，分别在两支试管中加入2～4ml的淋巴细胞分离液，再将上述混合液5～10ml叠加于淋巴细胞分离液的液面上；(3)获取血液中的单核细胞：将步骤(2)中的试管经2000～2500g水平离心15～20min后溶液分为3层，上层为血浆和hank氏液，中层为淋巴细胞分离液，下层主要为红细胞和粒细胞，在上、中层界面处有一以单核细胞为主的白色狭窄带，用干净毛细管插到该白色狭窄带层，吸出单核细胞，并移入试管中，加入1～5mlhank氏液，洗涤细胞，1500～2000g水平离心10～15min，弃上清液；(4)提取总rna：在已经洗涤过的单核细胞沉淀中加入trizol试剂1～5ml，消化3～5min；将细胞裂解液吸到ep管中，加氯仿0.2～1.0ml，轻摇15～60s，室温静置5～10min，10000～12000g离心10～15min，取上清无色水相液到ep管中，加异丙醇0.5～1.5ml，静置10～20min，10000～12000g离心10～15min，弃上清，在管底见微量白色总rna沉淀；(5)rna检测：用无水乙醇洗涤rna沉淀后，10000～12000g离心5～10min，吸尽上清液，在超净台中以无菌风吹干残余乙醇，加入无菌双蒸水10～20μl，打匀，55～60℃水浴10-20min溶解总rna，测od260和od280值，检测其纯度，在琼脂糖凝胶中电泳，鉴定所提取rna的完整性；(6)若od260/od280比值＞1.8，说明rna的纯度较高，则进入后续实验；若od260/od280比值＜1.8，说明rna的纯度不够，应重复步骤(4)，直至符合要求即od260/od280比值＞1.8为止；若在琼脂糖凝胶电泳中至少能见到两条界限分明的rna带，说明rna质量较高，降解较少，否则应重新提取总rna。3、逆转录使用invitrigen公司的m-mlv逆转录试剂盒(invitrogen，carlsbad，ca.c28025-032)，按说明书用oligo(dt)为逆转录引物，取0.5μg总rna进行逆转录，逆转录体系共10μl冰上操作，配置体系如表1所示。表1逆转录反应体系试剂体积0.5μgrna0.5μgrna对应的μl数oligo(dt)20(50μm)1μl10mmdntpmix1μldepch2o至10μl共10μl体系，在pcr仪中完成变性过程，65℃5min，4℃至少1min；取出反应体系立即置于冰上，立即配置如表2的反应体系。表2逆转录反应体系加入标记好的ep管中各10μl，在pcr仪中完成如下步骤：25℃退火10min37℃延伸50min；70℃终止反应15min；4℃forever将上述逆转录好的cdna分装保存-20℃备用。4、实时荧光定量pcr取10ng的cdna与greenqpcrsupermixwithrox(invitrogen，carlsbad，ca)进行实时荧光定量pcr反应，10μl反应体系如表3所示。表3pcr反应体系引物序列如下：mon1b基因的正向引物序列为5’-acacaagcagaactatga-3’(seqidno.1)，反向引物序列为5’-ctccatactgtccagaag-3’(seqidno.2)；扩增gapdh基因的正向引物序列为5’-ctcctcctgttcgacagtcagc-3’(seqidno.3)，反向引物序列为5’-cccaatacgaccaaatccgtt-3’(seqidno.4)。实时荧光定量pcr仪(7900htfastreal-timepcrsystem，appliedbiosystems，usa)中完成如下pcr过程：第一步，50℃2min；第二步，95℃预变性10min；第三步，95℃变性15sec，60℃退火与延伸1min，次步骤重复40个循环。溶解曲线阶段反应过程：95℃15sec，60℃15sec，95℃15sec。利用溶解曲线观察有无二聚体出现以及引物是否特异，利用扩增曲线观察产物扩增的情况。5、real-timepcr结果分析基因表达值用deltact的方法计算，假设目的和参照基因扩增效率都接近100％且相对偏差不超过1ct；δct＝目的基因ct均数-参照基因gapdhct均数。6、结果采用2-△△ct相对定量法，以正常儿童组的mrna相对表达水平为1，儿童i型糖尿病组mon1b基因mrna水平为10.23±3.94，显著升高，差异具有统计学意义(p<0.05)。实施例3免疫印迹实验验证儿童i型糖尿病患者和正常儿童中差异表达基因的表达产物1、临床对象：同实施例2。2、单核细胞蛋白分离儿童i型糖尿病患者和正常儿童取静脉血10ml，注入盛肝素的无菌小瓶中，加盖后立即轻轻摇匀。肝素化的血液用pbs按1∶1比例稀释。将两倍体积的稀释后血液置于一倍体积的密度为1.080的ficoll-hypaque之上(boyum,seand.j.clin.lab.invest.97:1-109,1968)，于20℃以1000g离心30分钟。取出外周血单核细胞层，用5倍体积的pbs洗一次。将分离后的外周血单核细胞重悬于5ml的红细胞裂解缓冲液中(155mmnh4cl，10mmnahco3，ph7.4，0.1mmedta)，冰浴中放置5分钟，用pbs洗两遍。分离后的外周血单核细胞重悬于0.1或0.2ml(大约10倍于细胞体积)的缓冲液(20mmhepes，ph7.5，5mmmgcl2，120mmkci，10％甘油，1mm二硫苏糖醇)中，该缓冲液还包含0.5％nonidetp-40，继续冰浴10分钟裂解细胞。在25℃以8000g离心6分钟，获得上清物质-胞浆提取物。取上清用brandford法定量蛋白，分装成2.5μg/μl，-80℃冰箱保存备用。3、westernblot检测(1)根据测定的蛋白浓度，按试验所需确定最小上样蛋白量，加入上样蛋白质量体积比5倍的蛋白上样缓冲液，用双蒸水补充上样总体积至15μl，然后将上样漩涡振荡，5000g离心5min，95℃恒温金属浴变性5-10min，得离心变性样品，备用；(2)将(1)制备好的样品进行sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳，待溴酚蓝跑至玻璃板底部前，停止电泳；(3)将(2)完成电泳后的另一块凝胶用于做转膜，按滤纸-胶-nc膜-滤纸从下至上的顺序叠放，置于装有转膜缓冲液的槽中，冰上，100伏恒压转移1h-2h；(4)将(3)转膜结束的nc膜用tbst洗3次，每次5min，然后用5％脱脂奶粉封闭液封闭90min，将封闭好的nc膜放入用tbst稀释好的一抗中，室温摇床上孵育1h-2h，然后4℃保存，备用；(5)取(4)制备的膜，室温孵育1h后用tbst洗膜3次，每次10min，然后将膜放入用tbst稀释好的二抗中，室温孵育90min，用tbst洗膜3次，每次10min，采用ecl化学曝光法，将洗脱后的nc膜用图像扫描仪扫描，即得wb图谱。蛋白上样缓冲液由下列原料配置而成：32％0.5mol/ltris.hclph6.8，7.8％二硫苏糖醇，10％sds，0.2％溴酚蓝，50％甘油，混匀后分装，-20℃保存，使用前解冻。sds-聚丙烯酰胺凝胶由8％分离胶和4％浓缩胶组成；8％分离胶配置成分如下：2.7ml30％acr/bic(acr/bic比例为29.2:0.8)，2.5ml1.5mol/ltris.hclph8.8，0.1ml10％sds，0.1ml10％过硫酸铵，0.006mltemed，4.6mlddh2o，总体积10ml；4％浓缩胶配置成分如下：0.067ml30％acr/bic(acr/bic比例为29.2:0.8)，1.25ml0.5mol/ltris.hclph6.8，0.05ml10％sds，0.05ml10％过硫酸铵，0.005mltemed，3.581mlddh2o，总体积5ml。转膜缓冲液由下列原料的百分比配置而成：0.29％甘氨酸，0.58％tris碱，0.037％sds，甲醇20％，蒸馏水79％，溶解后室温保存。tbst由下列原料的百分比配置而成：0.1％tween-20，99.9％tbs，混匀后使用，现配现用，tbs配置方法：由3gtris-baseph7.5，8gnacl，0.2gkcl，ddh2o800ml，浓盐酸调节ph值到7.4，定容至1000ml，4℃贮存备用。5、统计学处理将蛋白条带的灰度值使用imagej软件进行分析，以β-actin为内参，将目的白条带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用spss13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当p<0.05时具有统计学意义。6、结果结果显示，以正常儿童组的蛋白相对表达水平为1，儿童i型糖尿病组mon1b蛋白水平为4.15±0.78，显著升高，差异具有统计学意义(p<0.05)。上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。sequencelisting<110>北京泱深生物信息技术有限公司<120>mon1b在诊断儿童i型糖尿病中的新用途<160>4<170>patentinversion3.5<210>1<211>18<212>dna<213>人工序列<400>1acacaagcagaactatga18<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列<400>2ctccatactgtccagaag18<210>3<211>22<212>dna<213>人工序列<400>3ctcctcctgttcgacagtcagc22<210>4<211>21<212>dna<213>人工序列<400>4cccaatacgaccaaatccgtt21当前第1页12