利用巴豆酸激活Zscan4等二细胞期基因并延长端粒，提高化学诱导重编程效率的方法与流程

本发明属于生物医学技术领域，涉及提高化学诱导重编程效率的方法。具体而言，本发明涉及在化学诱导中期加入化学物质巴豆酸，通过激活包括zscan4在内的一系列二细胞期基因的表达，迅速延长端粒，从而减少端粒区域的基因组损伤，提高最终的化学诱导重编程效率。

背景技术：

近年来，小鼠和人诱导多能干细胞(下文称为ips)已相继建立，这类细胞的建立需要依靠强制表达一系列外源转录因子组合，如oct4，sox2，klf4等。但是介导外源基因表达的逆转录病毒或慢病毒有潜在的安全问题，不管是逆转录病毒,还是慢病毒,都会把外源基因整合到基因组dna中,这就有可能引起插入突变，造成潜在的致癌风险，不利于ips的临床应用。因此，降低基因整合风险和致癌性的方法之一就是减少外源转录因子，而这同时伴随着诱导效率的降低。加入一些化学小分子，如vpa,bix,vc等，可以显著提高重编程的效率，但是潜在的致癌风险依然使得ips距离临床应用非常遥远。

通过不断的努力和尝试，邓宏魁课题组首次利用小分子化合物将小鼠成纤维细胞成功诱导为化学诱导多能干细胞(下文称为cips)，这就避免了外源基因整合进基因组的风险。但是过低的诱导效率和过长的诱导时间仍然大大地限制了cips的临床应用。

技术实现要素：

本发明目的是解决因外源基因整合到基因组dna中可能造成潜在的致癌风险以及减少外源转录因子而伴随着诱导效率降低的问题，提供一种利用巴豆酸激活zscan4等二细胞期基因表达，延长端粒，以提高化学诱导重编程效率的方法。

本发明试图通过筛选其他化学小分子以提高化学诱导重编程的效率，并提高cips的质量。具体而言，利用一种小分子化合物巴豆酸，在化学诱导过程中第二阶段加入后，可以显著提高最终的化学诱导效率，并且这种方法得到的cips具备与正常胚胎干细胞更接近的基因表达谱，其安全性与有效性可转化于未来临床应用。

通过不断的尝试，我们发现7mm的巴豆酸(crotonicacid，以下简称ca)在化学诱导中期加入，可以使化学诱导效率提高3倍左右。

本发明技术方案

利用巴豆酸激活zscan4等二细胞期基因表达并延长端粒，以提高化学诱导重编程效率的方法，包括如下步骤：

第1.mef细胞的分离和原代培养；

通过贴壁培养，从处死的孕鼠组织获得原代mef细胞；

第2.加入巴豆酸获得化学诱导多能干细胞；

将第1步中获得的原代mef细胞，培养至多3代作为前体细胞用于化学诱导重编程，以提高化学诱导重编程效率。

其中，第2步所述加入巴豆酸获得化学诱导多能干细胞的方法如下：

首先在六孔板中接种50000个原代mef细胞，转天待细胞贴壁后换上化学诱导培养液a，记为第0天，0-12天每隔3天换液；在第12天时，细胞用胰酶消化后，以每个六孔100000-200000个细胞重新接种，培养至第16天，此时诱导培养液改为诱导培养液aa；所述诱导培养液a包括以下成分：100ng/mlbfgf,0.5mmvpa,20μmchir99021,10μmrepsox,5μmtranylcypromine,50μmforskolin,0.05μmam580和5μmepz004777；所述诱导培养液aa是将诱导培养液a中的bfgf、chir99021和forskolin分别减量至25ng/ml、10μm和10μm，其他成分不变。

在第16天时，细胞换上另外诱导培养液b，培养至第28天，每隔3天换液；所述诱导培养液b的成分如下：25ng/mlbfgf,0.5mmvpa,10μmchir99021,10μmrepsox,5μmtranylcypromine,10μmforskolin,0.05μmam580,0.05μmdznep,0.5μm5-aza-dc，5μmsgc0946和7mm巴豆酸；

在第28天时，细胞换上n2b27+2ilif培养液，再经过8-12天的培养，原代cips克隆出现，挑出后进行增扩和进一步鉴定。所述n2b27+2ilif培养液成分为：f12和neurobasal的1：1混合液，并添加n2,b27,3μmchir99021,1μmpd0325901和1000u/mlmlif。

所述原代cips进行增扩时使用的cips传代培养液为knock-outdmem添加20％血清,1000u/mlmlif，3μmchir99021和1μmpd0325901。

本发明的优点和有益效果：

本发明方法是一种非侵入式的简单低成本的方法，得到的cips具备多能性和产生高嵌合体小鼠的发育潜能。因此，本方法高效诱导的cips具备了大量应用于临床的潜力。

本发明中巴豆酸不仅使化学诱导效率得到了提高，我们还进一步对ca作用于提高重编程效率的机制做出了阐明。我们的结果表明，ca的加入在重编程中期可以激活包括zscan4在内的一系列二细胞期基因，从而保护端粒区域的dna，使之损伤减少，同时可以部分挽救端粒缩短，维持基因组的稳定性。而且由ca诱导得到的cips基因表达谱上与胚胎干细胞更为接近，因此具备更高的临床应用价值。

图注说明：

图1为巴豆酸(crotonicacid)的化学结构。

图2为诱导过程中加入巴豆酸(crotonicacid，以下简称ca)在第40天时的克隆形态图。可以看出40天时ca诱导而来的gfp荧光克隆数明显多于对照组。

图3为诱导过程中加入ca在第40天时流式细胞仪分析结果。结果证实加入ca对诱导效率有3倍左右的提高。

图4为端粒酶活性检测结果。结果显示加入ca后对端粒酶活性无明显影响。

图5为westernblot结果，证实在16天时加入ca后在28天时可以显著提高二细胞期基因zscan4蛋白水平的表达，对于多能性基因无明显效果。

图6为免疫荧光和定量结果。结果显示在加入ca后，28天时zscan4阳性细胞数明显增多。

图7为根据rna-sequencing结果做出的热图。结果显示在16天加入ca后在28天时可以显著激活一系列二细胞期基因的表达。

图8为southernblot实验，结果显示过程中加入ca在第30天左右对端粒有明显的延长作用，并且在第40天左右与对照组存在显著性差异。

图9为加入ca后第28天时trf1和γh2ax免疫荧光和其共定位定量统计的结果。结果显示加入ca后在第28天时可以显著降低在端粒区域的dna损伤。

图10为ca诱导得到的cips免疫荧光检测多能性maker的表达情况。结果显示加入ca后得到的cips与对照组都具备很好的多能性，无明显差别。

图11为加入ca诱导得到的cipscs形成的嵌合体小鼠。证实了cips具备很好的体内发育潜能。

图12为根据rna-sequencing结果做出的热图。聚类分析结果显示，加入ca诱导得到的cipscs能更好地与胚胎干细胞聚类，即二者拥有更相似的基因表达谱。

图13为ca作用于化学诱导重编程的模式图，常规的化学诱导重编程需要40天左右的诱导时间，而且在诱导的最后一个阶段，即30天至40天时，伴随着端粒缩短和基因组损伤等过程。我们在诱导重编程第二阶段，即16天至28天持续加入7mm的巴豆酸，可在28天左右激活包括zscan4在内的一系列二细胞期基因，迅速延长端粒，减少端粒区域的dna损伤，最终提高化学诱导重编程效率。

具体实施方式

实施例1：检测化学诱导过程中加入巴豆酸后诱导效率的提高(图2，3)

利用巴豆酸激活二细胞期基因表达以提高化学诱导重编程效率的方法，包括如下步骤：

第1.mef细胞的分离和原代培养

将13.5天的孕鼠处死，去除四肢、头尾和内脏，剪碎组织，0.05mm胰酶37℃消化10分钟后进行贴壁培养。贴壁获得的梭形细胞为原代mef细胞。

第2.加入巴豆酸获得化学诱导多能干细胞

将第1步中获得的原代mef细胞，培养至多3代可作为前体细胞用于化学诱导重编程。首先在六孔板中接种50000个原代mef细胞，转天待细胞贴壁后换上化学诱导培养液a，记为第0天。0-12天每隔3天换液，诱导培养液a包括以下成分：100ng/mlbfgf,0.5mmvpa,20μmchir99021,10μmrepsox,5μmtranylcypromine,50μmforskolin,0.05μmam580和5μmepz004777。在第12天时，细胞用胰酶消化后，以每个六孔100000-200000个细胞重新接种，培养至第16天，此时诱导培养液改为诱导培养液aa。所述诱导培养液aa是将诱导培养液a中bfgf,chir99021和forskolin分别减量至25ng/ml,10μm和10μm，其他成分不变。

在第16天时，细胞换上另外诱导培养液b，成分如下：25ng/mlbfgf,0.5mmvpa,10μmchir99021,10μmrepsox,5μmtranylcypromine,10μmforskolin,0.05μmam580,0.05μmdznep,0.5μm5-aza-dc，5μmsgc0946和7mm巴豆酸，每隔3天换液。在第28天时，细胞换上n2b27+2ilif培养液，培养液成分为f12和neurobasal1：1混合液，并添加n2,b27,3μmchir99021,1μmpd0325901和1000u/mlmlif。再经过8-12天的培养，原代cips克隆出现，挑出后可进行增扩和进一步鉴定。cips传代培养液为knock-outdmem添加20％血清,1000u/mlmlif，3μmchir99021和1μmpd0325901。

通过显微镜观察第40天时gfp阳性克隆数(以未加入巴豆酸作为对照组)和流式细胞仪分析gfp阳性细胞数目(图2，3)结果显示，加入巴豆酸后能提高3倍左右的诱导效率。

实施例2：检测加入巴豆酸后对化学诱导重编程的影响和作用机制(图4，5，6，7，8，9)

1.通过trap(端粒酶活性检测)实验证实巴豆酸的加入对端粒酶活性没有明显影响。

2.通过westernblot实验证明，在加入巴豆酸后第28天时zscan4蛋白明显上调，而对于其他多能性蛋白oct4，nanog和lin28无明显效果。

3.免疫荧光染色结果显示，加入巴豆酸后第28天时zscan4阳性细胞明显增多，统计后结果存在显著性差异。

4.rna-seq测序结果同样证实了包括zscan4在内的一系列二细胞期基因在巴豆酸加入后明显被激活，与westernblot和免疫荧光结果相一致。

5.souternblot实验结果表明，化学诱导过程中加入ca在第30天左右对端粒有明显的延长作用，并且在第40天左右端粒长度与对照组存在显著性差异。

6.免疫荧光通过共染trf1蛋白和γh2ax蛋白证实在加入巴豆酸后，总体上γh2ax蛋白指示的整体基因组损伤没有明显变化，但是与trf1共定位在第28天时有明显减少，这进一步证明了巴豆酸可以在28天左右减少端粒区域的基因组损伤。

实施例3：对加入巴豆酸诱导得到的cips进行鉴定(图10，11，12)

我们通过对加入巴豆酸诱导得到的cips进行免疫荧光染色多能性markernanog，sox2和ssea1，显示这种方法得到的cips具有很好的多能性。通过4-8细胞注射进行的嵌合体实验也证实，这种方法得到的cips具备了形成高嵌合体的体内发育潜能，这对于未来的再生医学和临床应用具有重要意义。而与未加入巴豆酸的cips相比较，巴豆酸诱导得到的cips与正常的胚胎干细胞系og4享有更接近的基因表达谱。