一种基于预测模型快速定量分析黄瓜中乙型副伤寒沙门氏菌的方法与流程

本发明属于食品微生物鉴定与应用技术领域，具体涉及一种基于预测模型快速定量分析黄瓜中乙型副伤寒沙门氏菌的方法，该方法以传统微生物学培养为基础，结合数学、统计学等学科模拟黄瓜中乙型副伤寒沙门氏菌在10、l5、20、25、30和35℃不同温度条件下的生长曲线，构建一级和二级预测模型，应用该模型可对市售黄瓜样品在任意环境温度下的初始带菌量进行风险预测，以确保黄瓜在生产、加工、运输、销售、贮藏等一系列环节的安全和品质，为黄瓜的安全监管提供技术支撑。

背景技术：

沙门氏菌属(salmonellaspp.)是最常见的食源性致病菌之一，其危害范围大，可引起各类农产品污染。据估计，美国每年源于沙门氏菌属细菌感染的病例约140万，且连续10年被美国cdc作为导致食源性疾病爆发的6类病原微生物监测对象之一。我国每年发生的细菌性食物中毒事件中，由沙门氏菌引起的食物中毒也屡居首位。近年来，欧美国家不断爆发即食果蔬和鲜切果蔬被沙门氏菌污染事件，并逐年增长。生菜、黄瓜、番茄、瓜类、菠菜、豆芽和果蔬沙拉等都曾分离出沙门氏菌。

由于我国食品消费方式与欧美国家相差较大，大多蔬菜均经过热加工处理后才食用，所以致病菌污染问题一直未受到重视。但是，随着人们饮食观念的转变，蔬菜沙拉、生食蔬菜等逐渐受到人们的喜爱。此类蔬菜一般不经过处理，清洗切碎后直接食用。特别是鲜切果蔬在加工过程中会破坏果蔬的表皮等结构，使得鲜切果蔬存在被致病菌污染的风险，加上鲜切果蔬表面较高的水分活度和营养物质的渗出，致病菌很容易在其表面生长。鲜切果蔬即食性的特点使其具有较高的安全风险，据估计，美国在1998-2008年因食用果蔬(包括新鲜果蔬和加工果蔬)引起的食源性疾病占到了食源性疾病总数的46％。

目前，我国关于新鲜蔬菜上致病菌爆发事件的报道较少，为了控制沙门氏菌污染事件的发生，大量学者研究了不同沙门氏菌血清型在各类蔬菜上的存活和生长情况，并开发了多种沙门氏菌防控措施。因而，果蔬中致病菌的研究成为农产品质量安全领域的研究热点之一。应用微生物预测模型可以快速有效地对重要微生物的生长、存活和死亡进行预测，从而确保食品在生产、运输、贮存等过程中的安全和稳定，是一种防止病原微生物对食品污染的有效的预警工具。从而为农产品微生物定量风险评估提供基础数据，也是保障农产品质量安全的重要方面。

本实验选取市售黄瓜为实验对象，通过ipmp软件，研究不同温度下沙门氏菌在鲜切黄瓜中的生长情况，并构建生长模型。本研究将为鲜切黄瓜中沙门氏菌的污染防控提供科学依据。

技术实现要素：

本发明的目的在于公开了一种基于预测模型快速定量分析黄瓜中乙型副伤寒沙门氏菌的方法，该方法可对市售黄瓜样品在任意环境温度下的初始带菌量进行风险预测，以确保黄瓜在生产、加工、运输、销售、贮藏等一系列环节的安全和品质，为黄瓜的安全监管提供技术支撑。

为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：

一种基于预测模型快速定量分析黄瓜中乙型副伤寒沙门氏菌的方法，其特征在于，模型的建立按如下步骤进行：

(1)新鲜黄瓜在无菌室用灭菌刀具去皮后切成1cm³左右的小丁，将其平摊于无菌超净台内，紫外线下灭菌30min，再关闭紫外灯于超净台内排风30min，去除紫外残留，无菌操作分装为20g每份于无菌均质袋中，共分装110袋，置于4℃冰箱中备用；

(2)随机抽取上述分装样品2份，分别加入180ml缓冲蛋白胨水，拍击式均质器均质1min，取0.2ml涂布于亚硫酸铋(bs)琼脂平板表面，36℃培养48h，进行黄瓜的本底检测，本底要求无沙门氏菌生长；

(3)用无菌吸管吸取1ml浓度为2χ10⁴cfu/ml的沙门氏菌菌液接种至20g/袋的经紫外线下灭菌的黄瓜丁，尽量使其混合均匀，使黄瓜丁的初始带菌浓度为1χ10³cfu/g；

(4)模拟不同温度(10、15、20、25、30、35℃)进行恒温培养，每隔一段时间，取出样品，放入180ml缓冲蛋白胨水中，拍击式均质器均质1min，用移液器吸取0.2ml稀释液涂布于亚硫酸铋(bs)琼脂平板，于36℃倒置培养48h后，进行菌落计数；

(5)应用usdaintegratedpredictivemodelingprogramtools(ipmp2014)工具中fullgrowthmodels中的huangmodel、baranyimodel、gompertzmodel分别对试验数据进行生长曲线的拟合，建立初级模型，获得最大比生长速率；

(6)应用usdaintegratedpredictivemodelingprogramtools(ipmp2014)工具中secondarymodels-temperatureeffect中的ratkowsky、huangrate、cardinal、arrhenius-type这4个模型，拟合鲜切黄瓜中乙型副伤寒沙门氏菌最大比生长速率与温度的函数关系，建立二级模型。

本发明所建立的模型，可按照如下步骤应用：

(1)测定或设定黄瓜样品中乙型副伤寒沙门氏菌的初始带菌量，并记录环境温度；

(2)通过二级模型拟合得到该温度下的最大比生长速率；

(3)通过最大比生长速率及初始带菌量，拟合得到该温度条件下感染乙型副伤寒沙门氏菌的黄瓜样品的最长货架期；

本发明所述的乙型副伤寒沙门氏菌，菌株编号为cmcc(b)50094。

为了能更加清楚的说明本发明的定量预测分析方法，下面以黄瓜为样本实例，对本发明预测模型的构建方法加以说明。

一、材料和试剂

(1)样品：黄瓜，由农贸市场购置。

(2)主要仪器：高压灭菌锅，生物安全柜，恒温培养箱，恒温冰箱。

(3)主要试剂：乙型副伤寒沙门氏菌cmcc(b)50094，为本室保藏标准菌株，购

于中国工业微生物菌种保藏管理中心；亚硫酸铋(bs)琼脂培养基、营养肉汤、缓冲蛋白胨水(bpw)培养基、生化鉴定试剂盒等均购自北京陆桥技术有限责任公司

二、预测模型的构建

(1)新鲜黄瓜在无菌室用灭菌刀具去皮后切成1cm³左右的小丁，将其平摊于无菌超净台内，紫外线下灭菌30min，再关闭紫外灯于超净台内排风30min，去除紫外残留，无菌操作分装为20g每份于无菌均质袋中，共分装110袋，置于4℃冰箱中备用；

(2)随机抽取上述分装样品2份，分别加入180ml缓冲蛋白胨水，拍击式均质器均质1min，取0.2ml涂布于亚硫酸铋(bs)琼脂平板表面，36℃培养48h，进行黄瓜的本底检测，本底要求无沙门氏菌生长；

(3)用无菌吸管吸取1ml浓度为2χ10⁴cfu/ml的沙门氏菌菌液接种至20g/袋的经紫外线下灭菌的黄瓜丁，尽量使其混合均匀，使黄瓜丁的初始带菌浓度为1χ10³cfu/g；

(4)模拟不同温度(10、15、20、25、30、35℃)进行恒温培养，每隔一段时间，取出样品，放入180ml缓冲蛋白胨水中，拍击式均质器均质1min，用移液器吸取0.2ml稀释液涂布于亚硫酸铋(bs)琼脂平板，于36℃倒置培养48h后，进行菌落计数；

(5)应用usdaintegratedpredictivemodelingprogramtools(ipmp2014)工具中fullgrowthmodels中的huangmodel、baranyimodel、gompertzmodel分别对试验数据进行生长曲线的拟合，建立初级模型，获得最大比生长速率，结果如图1所示。

(6)应用usdaintegratedpredictivemodelingprogramtools(ipmp2014)工具中secondarymodels-temperatureeffect中的ratkowsky、huangrate、cardinal、arrhenius-type这4个模型，拟合鲜切黄瓜中乙型副伤寒沙门氏菌最大比生长速率与温度的函数关系，建立二级模型，结果如图2所示。

三、预测模型的应用

(1)测定或设定黄瓜样品中乙型副伤寒沙门氏菌的初始带菌量，并记录环境温度；

(2)通过二级模型拟合得到该温度下的最大比生长速率；

(3)通过最大比生长速率及初始带菌量，拟合得到该温度条件下感染乙型副伤寒沙门氏菌的黄瓜样品的最长货架期，应用建立的生长动力学模型求得30℃贮藏时的预测值，与鲜切黄瓜中30℃贮藏实验中实际样品的沙门氏菌生长数值进行比较，结果见表1。

表1

本发明具有的积极效果在于：

(1)采用预测模型可将食源性病原菌的被动检测转变为主动监测，将风险与疾病的暴发控制在预期的范围。

(2)本方法是数量化描述黄瓜中乙型副伤寒沙门氏菌的生长、残存和死亡情况，它可对黄瓜的货架期做出合理预测，准确估算商品的剩余货架期，从而成为监测储藏、流通、零售过程安全性做出合理的评估。

(3)采用本发明方法通过一次模型构建，省去了后续大量的食源性致病菌培养及检测工作，省时、省力、操作简便。

附图说明:

图1为huang模型拟合的10、15、20、25、30、35℃条件下测定的黄瓜中乙型副伤寒沙门氏菌的生长数据；如图标注分别为10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃；

图2为huang模型不同温度条件下乙型副伤寒沙门氏菌的最大比生长速率拟合的ratkowsky、huangrate、cardinal、arrhenius-type模型；

图3为baranyi模型拟合的10、15、20、25、30、35℃条件下测定的黄瓜中乙型副伤寒沙门氏菌的生长数据；如图标注分别为10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃；

图4为baranyi模型不同温度条件下乙型副伤寒沙门氏菌的最大比生长速率拟合的ratkowsky、huangrate、cardinal、arrhenius-type模型；

具体实施方式

为了能更加清楚的说明本发明的方法，下面结合实施例对本发明做进一步的描述。

实施例1

(1)新鲜黄瓜在无菌室用灭菌刀具去皮后切成1cm³左右的小丁，将其平摊于无菌超净台内，紫外线下灭菌30min，再关闭紫外灯于超净台内排风30min，去除紫外残留，无菌操作分装为20g每份于无菌均质袋中，共分装110袋，置于4℃冰箱中备用；

(2)随机抽取上述分装样品2份，分别加入180ml缓冲蛋白胨水，拍击式均质器均质1min，取0.2ml涂布于亚硫酸铋(bs)琼脂平板表面，36℃培养48h，进行黄瓜的本底检测，本底要求无沙门氏菌生长；

(3)用无菌吸管吸取1ml浓度为2χ10⁴cfu/ml的沙门氏菌菌液接种至20g/袋的经紫外线下灭菌的黄瓜丁，尽量使其混合均匀，使黄瓜丁的初始带菌浓度为1χ10³cfu/g；

(4)模拟不同温度(10、15、20、25、30、35℃)进行恒温培养，每隔一段时间，取出样品，放入180ml缓冲蛋白胨水中，拍击式均质器均质1min，用移液器吸取0.2ml稀释液涂布于亚硫酸铋(bs)琼脂平板，于36℃倒置培养48h后，进行菌落计数；

(5)应用usdaintegratedpredictivemodelingprogramtools(ipmp2014)工具中fullgrowthmodels中的huangmodel、baranyimodel、gompertzmodel分别对试验数据进行生长曲线的拟合，建立初级模型，获得最大比生长速率，结果如图3所示。

(6)应用usdaintegratedpredictivemodelingprogramtools(ipmp2014)工具中secondarymodels-temperatureeffect中的ratkowsky、huangrate、cardinal、arrhenius-type这4个模型，拟合鲜切黄瓜中乙型副伤寒沙门氏菌最大比生长速率与温度的函数关系，建立二级模型，结果如图4所示。

实施例2

(1)用途：用于市场监督，农贸市场黄瓜样品中乙型副伤寒沙门氏菌阳性样品的货架期预测；

(2)预测方法：通过市场抽检，测得某黄瓜样品中乙型副伤寒沙门氏菌为阳性，记录初始带菌量及当时样品在农贸市场摊位销售的环境温度，应用以建立的预测模型获得该温度条件下的最大比生长速率，通过最大比生长速率、初始带菌量、环境温度即可预测得到该黄瓜样品的安全货架期时间，应用建立的生长动力学模型求得35℃贮藏时的预测值，与鲜切黄瓜中35℃贮藏实验中实际样品的沙门氏菌生长数值进行比较，结果见表2。

表2