一种肿瘤酸度响应自噬诱导多肽及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物技术制药领域，具体涉及一种肿瘤酸度响应自噬诱导多肽及其制备方法和该多肽在制备靶向抗癌药物中的应用。

背景技术：

beclin1通过对自噬的调节，在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用。目前，beclin1已被确定为一个新的抑癌基因。然而据报道：75％的卵巢癌、50％的乳腺癌和40％的前列腺癌中存在beclin1基因的缺失性突变，beclin1蛋白表达量下降，自噬功能降低。因此，若能增强这些肿瘤患者中beclin1的表达，进而启动自噬过程，肿瘤细胞就会因为过度自噬而死亡，达到抑制肿瘤生长的目的。然而，beclin1本身不能进入细胞，缺乏组织特异性而且体内稳定性差，这就大大限制了其在肿瘤治疗中的应用。

快速增殖的肿瘤细胞具有异常的营养需求与代谢特征(warburg效应)，使得肿瘤微环境具有一些独特的特征，可将几乎所有的恶性实体瘤与周围的正常组织区分开来。与健康组织相比(ph7.2-7.4)，肿瘤组织具有更低的细胞外ph(ph6.5-7.0)。酸中毒是肿瘤从早期向晚期进展的一个重要标志，可以为肿瘤检测和靶向治疗提供新的思路。肿瘤酸性微环境靶向不依赖于肿瘤组织的病理生理学特征及生物标志物，可以弥补主动靶向与被动靶向方式存在的不足。

低ph插入肽(phlowinsertionpeptide,phlip)是来源于细菌视紫红质c螺旋的一种水溶性多肽，由36个氨基酸组成，其在酸性条件下可通过形成稳定的跨膜α螺旋将c端插入细胞膜中。因此，phlip可作为肿瘤酸性微环境靶向输送载体将目的药物或基因递送至肿瘤细胞内。

技术实现要素：

本发明的目的在于提出一种肿瘤酸度响应自噬诱导多肽及其制备方法和该多肽在制备靶向抗癌药物中的应用。

本发明的肿瘤酸度响应自噬诱导多肽从n端到c端依次包含：pet-32a表达载体上标签蛋白trx氨基酸序列、肿瘤酸度响应靶向分子phlip序列和自噬起始因子beclin1活性片段的氨基酸序列。

本发明提供一种肿瘤酸度响应自噬诱导多肽，其氨基酸序列为sdqidno：1，由221个氨基酸组成。

编码所述肿瘤酸度响应自噬诱导多肽的基因，其核苷酸序列为sdqidno：2，由672个核苷酸组成。

一种载体，含有上述所述的核苷酸序列。它是将编码phlip-beclin1的核苷酸片段克隆至原核表达载体后获得的重组质粒pet-32a-trx-phlip-beclin1。所述载体是一种质粒。

一种工程菌，含有上述所述载体。是将重组质粒pet-32a-trx-phlip-beclin1转化至一种菌，例如大肠杆菌bl21(de3)中，构建成工程菌pet-32a-trx-phlip-beclin1/bl21(de3)。

一种肿瘤酸度响应自噬诱导多肽的制备方法，包括如下步骤：化学合成phlip和beclin1活性片段的基因序列，通过限制性酶切位点将其连接到pet-32a表达载体上，获得重组质粒。将重组质粒转化到大肠杆菌bl21(de3)中，筛选获得工程菌pet-32a-trx-phlip-beclin1/bl21(de3)。将该工程菌接种到含氨苄青霉素的lb培养液中，37℃振荡培养至a600nm为0.6-0.8时，加入iptg使其终浓度为1mm，16℃过夜诱导，收集菌体，超声破碎离心收集上清，经亲和层析纯化获得目的蛋白。

肿瘤酸度响应自噬诱导多肽在制备抗癌药物中的应用。选用人乳腺癌细胞系mcf-7通过结晶紫染色法、ad-mcherry-gfp-lc3b和westernblot等手段来验证目的蛋白trx-phlip-beclin1的生物学活性，实验结果表明：在弱酸性(ph＝6.5)条件下，trx-phlip-beclin1可显著抑制mcf-7的生长和增殖，其抗肿瘤活性显著优于单独的beclin1活性片段。westernblot检测自噬相关蛋白p62、lc3i及lc3ii表达水平的变化，结果显示使用trx-phlip-beclin1处理细胞后p62含量显著降低、lc3ii含量显著增加，表明trx-phlip-beclin1可诱导肿瘤细胞发生自噬。

与现有技术相比，本发明的有益效果：本发明提供的肿瘤酸度响应自噬诱导多肽具有制备简便、产率高、抗肿瘤活性强等优点。该多肽可通过大肠杆菌原核表达快速获得，产率可达21.8mg/l，在弱酸性条件下其抗肿瘤活性显著优于单独的beclin1活性片段，因此可在制备靶向抗癌药物中应用。

附图说明

图1phlip-beclin1目的基因pcr扩增图(泳道1为标准分子量，泳道2是目的基因)

图2pet-32a-trx-phlip-beclin1重组质粒阳性克隆鉴定图(泳道1为标准分子量，泳道2至10为目的基因)

图312％sds-page蛋白凝胶电泳检测目的蛋白和标签蛋白表达结果。(m：标准分子量；泳道1表示含有空质粒菌体在16℃条件下经1mmiptg过夜诱导，超声破碎后，离心得到的上清蛋白样；泳道2、3和4表示含有重组质粒菌体在16℃条件下经1mmiptg过夜诱导，超声破碎后得到的全菌蛋白样品和离心得到的上清和沉淀蛋白样品；泳道5表示未经诱导的菌体经超声破碎后，离心得到的上清蛋白样品)

图412％sds-page蛋白凝胶电泳检测目的蛋白和标签蛋白表达纯化结果(m：标准分子量；泳道1、2分别为标签蛋白纯化前后蛋白样；泳道3、4分别为融合蛋白纯化前后蛋白样)

图5结晶紫法研究不同浓度融合蛋白对肿瘤细胞生长抑制结果及统计图(图中a表示在ph＝7.4/6.5条件下使用10μm融合蛋白处理mcf-7细胞24h经结晶紫染色后，细胞增殖情况。图中b表示在ph＝7.4条件下使用10μm融合蛋白处理mcf-7细胞24h经结晶紫染色后，甲醇溶解使用酶标仪测定吸光值。图中c表示在ph＝6.5条件下使用10μm融合蛋白处理mcf-7细胞24h经结晶紫染色后，甲醇溶解使用酶标仪测定吸光值)

图6westernblot法检测融合蛋白处理mcf-7细胞后自噬标记蛋白lc3ii及p62蛋白表达水平(图中a表示在ph＝7.4/6.5条件下使用10μm融合蛋白处理mcf-7细胞24h后，用westernblot法检测p62、lc3i和lc3ii蛋白表达水平。图中b来源于图中a的lc3-ii/lc3-i和p62/gapdh灰度值分析结果)

图7ad-mcherry-gfp-lc3b法观察自噬体数量及统计图(图中a表示在ph＝7.4条件下使用10μm融合蛋白处理mcf-7细胞24h后，通过荧光斑点数判定自噬情况。图中b表示在ph＝6.5条件下使用10μm融合蛋白处理mcf-7细胞24h后，通过荧光斑点数判定自噬情况。图中c来源于对图中a和b的荧光斑点数统计结果。

具体实施方式

实施例1：融合蛋白质粒的构建

化学合成phlip-beclin1基因序列

ggatccgcggcggaacagaacccgatttattgggcgcgctatgcggattggctgtttaccaccccgctgctgctgctggatctggcgctgctggtggatgcggatgaaggcacctgcggcaccaacgtgtttaacgcgacctttcatatttggcatagcggccagtttggcacctaactcgag，并在该目的蛋白基因序列的两端分别设计bamhi和xhoi酶切位点。然后，将目的蛋白基因通过上述酶切位点连接入pet-32a载体中，从而得到目的蛋白表达载体。(见图1和2)

实施例2：融合蛋白的表达和纯化

(1)融合蛋白的表达

将上述融合蛋白表达载体转化入bl21(de3)大肠杆菌中，先接50μl菌液到5mllb液体培养基中，37℃，200rpm，摇床培养8h。将菌液转接到500mllb液体培养基中，37℃，200rpm，培养至od＝0.6-0.8，用iptg(1mm)16℃，200rpm，过夜诱导表达。(见图3)

(2)融合蛋白的纯化

将上述iptg诱导表达的菌液离心(8000rpm，10min)，弃上清，收菌。沉淀用10mmpbs(ph＝7.4)溶液吹散，超声破菌，13000rpm，离心20min，收集上清。采用ni离子亲和层析法纯化上清，待总蛋白充分吸附后，用10mmpbs(ph＝7.4)缓冲液清洗亲和柱，洗至考马斯亮蓝检测液不变色。60mm咪唑缓冲液洗杂，300mm咪唑缓冲液洗脱，收集洗脱液，即获得肿瘤酸度响应自噬诱导多肽，其氨基酸序列为sdqidno：1，12％sds聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。(见图4)

实施例3：结晶紫染色法检测自噬诱导多肽对细胞增殖影响

指数生长期的mcf-7细胞以5×10³个/孔传入96孔培养板，37℃含5％的co2培养箱孵育24h后，分别在ph＝7.4/6.5新鲜培养液中加入不同浓度的标签蛋白trx、beclin1、融合蛋白至终浓度依次为0μm、10μm、50μm、100μm，每个浓度设五个复孔。孵育24h后吸净孔内液体，pbs缓冲液清洗两次，每孔加入50μl，0.5％结晶紫溶液，室温染色20min后吸净孔内液体，pbs缓冲液轻洗两次，使用biotekcytation5全孔成像仪，4倍镜下观察。观察后每孔加入200μl甲醇溶液，室温振荡20min。利用酶标仪检测各孔在570nm波长处的吸光度值。(见图5)

实施例4：westernblot法检测细胞自噬

指数生长期的mcf-7细胞以1×10⁶个/孔传入细胞培养皿中，37℃含5％的co2培养箱孵育24h后，分别在ph＝7.4/6.5新鲜培养液中加入trx、beclin1、融合蛋白至终浓度为10μm，对照组加入新鲜培养液。孵育24h后吸净培养液，pbs缓冲液清洗两次，使用细胞刮将细胞收集于15ml离心管中，1100rpm离心5min，弃上清。每管加1mlpbs重悬转移到1.5ml离心管中，1100rpm离心5min，弃上清。将pmsf与细胞裂解液以1：100比例混合，每管加入30μl混合液，重悬后放置于冰上30min，13000rpm离心10min，将上清转移到200μl离心管中，放入冰中。使用bca蛋白检测试剂盒，将每组蛋白取2μl加入96孔板，加200μl显色液放入37℃培养箱30min，酶标仪检测各孔在570nm波长处的吸光度值，计算每微升上清所含蛋白量，取40μg蛋白，100℃煮沸8min。制备15％sds聚丙烯酰胺凝胶，上样，60v跑胶，样品进入分离胶后调整电压为90v跑胶至胶板1cm处。转膜(72v，45min)，丽春红染色5min观察，tbst溶液洗涤三次，每次7min，5％脱脂牛奶封闭1h，接一抗，4℃孵育过夜，tbst溶液洗涤三次，每次7min，接二抗，室温孵育2h，tbst溶液洗涤三次，每次7min，使用ecl发光液暗室曝光。(见图6)

实施例5：ad-mcherry-gfp-lc3b法观察自噬体数量

指数生长期的mcf-7细胞以1×10⁶个/孔传入铺有盖玻片的24孔培养板中，在37℃含5％的co2培养箱孵育24h后加入10moi含有mcherry-gfp-lc3b质粒的腺病毒，孵育24h后分别在ph＝7.4/6.5新鲜培养液中加入trx、beclin1、融合蛋白至终浓度为10μm，对照组加入新鲜培养液，培养12h后吸净孔中培养液，pbs缓冲液清洗3次，加入固定液，4℃固定30min后取出盖玻片放到滴有防荧光猝灭液的载玻片上封片，通过deltavision高分辨率活细胞成像系统观察。(见图7)。

序列表

<120>一种肿瘤酸度响应自噬诱导多肽及其制备方法和应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>221

<212>prt

<213>大肠杆菌(escherichiacoli)

<400>1

metserasplysileilehisleuthraspaspserpheaspthrasp

151015

valleulysalaaspglyalaileleuvalaspphetrpalaglutrp

202530

cysglyprocyslysmetilealaproileleuaspgluilealaasp

354045

glutyrglnglylysleuthrvalalalysleuasnileaspglnasn

505560

proglythralaprolystyrglyileargglyileprothrleuleu

65707580

leuphelysasnglygluvalalaalathrlysvalglyalaleuser

859095

lysglyglnleulysglupheleuaspalaasnleualaglysergly

100105110

serglyhismethishishishishishisserserglyleuvalpro

115120125

argglyserglymetlysgluthralaalaalalysphegluarggln

130135140

hismetaspserproaspleuglythraspaspaspasplysalamet

145150155160

alaaspileglyseralaalagluglnasnproiletyrtrpalaarg

165170175

tyralaasptrpleuphethrthrproleuleuleuleuaspleuala

180185190

leuleuvalaspalaaspgluglythrcysglythrasnvalpheasn

195200205

alathrphehisiletrphisserglyglnpheglythr

210215220

<210>2

<211>672

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcg60

gacggggcgatcctcgtcgatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgcc120

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ctgtttaccaccccgctgctgctgctggatctggcgctgctggtggatgcggatgaaggc600

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acctaactcgag672