本发明属于生物工程下游的提取纯化技术领域，尤其是涉及一种从发酵液中提取黄霉素精品的提取工艺。
背景技术：
黄霉素(flavomycin)又称莫诺霉素(moenomycin)、斑驳霉素(bambermycin)、黄磷脂素(flavophospholipol)，是一种多组分的动物用抗生素，有五个主要组分a、a12、c1、c3、c4，商品黄霉素中a组分含量比例最大，一般在60-80％之间。
黄霉素a的经验分子式为：c69h107n4o35p，分子量为1582g/mol。黄霉素的化学结构式：
目前黄霉素的生产企业都是生产含黄霉素20-250u/mg(相当于含量2-25％)的粗品，然后再添加辅料配成含量为4％、8％、12％的兽用预混剂使用。由于粗品中含有微生物长期培养发酵产生的大量代谢副产物，杂质成分复杂，稳定性差，人在生产过程中接触黄霉素粗品易产生咳嗽、高烧、腹泻等不良过敏反应，但机理不明。黄霉素精品本身的毒性小，精品配制成的预混剂，给动物饲用可改善口感，更会显著减少毒副作用，促生长效率更高，是以后兽用预混剂的发展趋势。专利us6077830报道，黄霉素的锚盐可以治疗和预防胃病，提示黄霉素精品将来也可以用于人类用药；而黄霉素精品大规模生产的工艺尚未见报道。
国内专利cn1683549a公开了一种莫诺霉素(即黄霉素)的提取方法即从发酵菌丝体中用甲醇等极性溶剂提取后，再用硅胶柱和硅酸镁及rp-18柱层析进行三步色谱分离纯化的在实验室中制备标准品的方法，该方法中大量使用甲醇、石油醚、丁醇、乙腈等溶剂或其混合物进行除盐、脱色、梯度洗脱或洗涤、层析等纯化方式，不适合进行大规模工业化生产。国内外其他专利则主要是关于默诺霉素a或默诺霉醇从多组分混合物中分离纯化的方法，工艺也都是采用极性溶剂进行固液提取和多种色谱柱或离子交换树脂或大孔树脂等联合使用进行分离纯化的方式，也只能在实验室少量制备，分离的效率和收率更低，生产成本更高，不适合大规模工业化生产。
技术实现要素：
为了克服现有技术的不足，本发明提供一种可以连续化大生产，生产过程简单，提取收率高，产品纯度高的黄霉素的提取工艺。
本发明解决技术问题所采用的技术方案是：一种黄霉素的提取工艺，包括以下步骤：
1)预处理：取黄霉素发酵液，碱化至ph值为8-12，过滤发酵液后收集获得富含黄霉素的滤液a；
2)溶媒萃取：向滤液a中加入有机溶剂，调节至ph值为1-4，间歇搅拌萃取，静置分层，将下层水相分离获得萃取液b；
3)反萃取、洗涤：向萃取液b中加入水或氯化钠溶液搅拌混合洗涤，静置分层，除去含有色素和杂质的水层，加入等体积无盐水，调节至ph值为6-12，继续间歇搅拌12-18分钟进行反萃取，静置分层，获得富含黄霉素的水层提取液，向水层提取液中添加有机溶媒，搅拌洗涤除杂，静置分层，获得下层的富含黄霉素的水层提取液c；
4)纳滤、喷干：水层提取液c用纳滤膜纳滤截留获得富含黄霉素的浓缩液，浓缩液喷雾干燥获得白色或类白色的黄霉素。
作为优选，所述步骤1)发酵液经碱化至ph值为8.5-9.5，采用固体氢氧化钠，或采用固体氢氧化钠配成的溶液，或采用工业液碱，或采用工业液碱配成的稀溶液。
进一步的，氢氧化钠溶液的浓度为20-30％。
作为优选，向所述步骤1)中碱化后的发酵液添加助滤剂，使用板框过滤，助滤剂为硅藻土、珍珠岩、有机絮凝剂或无机絮凝剂中的一种或几种。
进一步的，助滤剂为0.5-2％；用压榨板框过滤发酵液，过滤后顶少量水进一步将残留在菌丝体中的黄霉素顶出并过滤到滤液中。
作为优选，在所述步骤1)中碱化后的发酵液使用陶瓷膜过滤。若用陶瓷膜过滤，不用添加硅藻土或珍珠岩等固体助滤剂；用陶瓷膜过滤滤液质量好，萃取时不宜乳化。
所述步骤1)中所有的利用搅拌混合萃取或洗涤，静止分层的步骤，在生产规模放大后，都可以用碟片式高速离心萃取机替代，替代后所有料液都可以连续进出和自动化控制，分离效果更好，效率更高。
作为优选，所述步骤2)向滤液a中加入的有机溶剂为与水混合后可分层的弱极性或非极性溶剂。
作为优选，所述步骤2)向滤液a中加入的有机溶剂为乙酸丁酯或乙酸乙酯或两者的组合。
作为优选，所述步骤2)中萃取方式为少量多次，其ph值为1-3。
作为优选，所述步骤2)和步骤3)中利用10-25％的硫酸溶液调节ph值。当然也可以使用盐酸、醋酸、磷酸等酸或其稀溶液。
进一步的，所述步骤2)中间歇搅拌萃取时间为15分钟；若萃取收率低，可以再萃取一次或少量多次萃取。
步骤2)和步骤3)中分出的废水，残留有少量有机溶媒，可以通过蒸馏回收有机溶媒后再排放，也可以使用成本更低效果更好的新技术-渗透汽化膜回收废水中的有机溶媒。这样即可更彻底回收溶媒降低成本，也可减少废溶媒的排放，有利于环境保护并减少环保治理费用。
作为优选，所述步骤2)向滤液a中加入破乳剂。破乳剂可以是食盐。
作为优选，所述步骤2)中滤液a和有机溶剂的体积比为1:0.5-2。
作为优选，所述步骤3)向萃取液b中加入的水的ph值为2；向萃取液b中加入的氯化钠溶液的ph值为2；所述步骤3)中在ph值为7-8的条件下进行反萃取。步骤3)中有机萃取液加水洗涤目的是洗去残留的无机、有机杂质和色素等，加入的水或食盐水可加少量酸调节ph值2左右，以防止黄霉素溶解到水层流失。
反萃取剩下的上层有机萃余液和水提液洗涤分出的上层有机洗涤液合并，可用于下批滤液的萃取，反复使用。
进一步的，所述步骤3)中氯化钠溶液的质量分数为10-30％；间歇搅拌时间为15分钟。
作为优选，在纳滤、喷干步骤之前增加脱色，向水层提取液c中加入活性炭搅拌脱色0.8-1.5h，压滤获得脱色液。
作为优选，所述脱色用炭可以用药用或糖用的粉状碳，也可用颗粒炭，其中，优选粉状药用碳脱色。脱色后的废碳，还有一定的脱色能力，也可以选择回用，加到下批发酵液中，兼做脱色和过滤助剂。
作为优选，所述活性炭的加入量为水层提取液c体积的0.2-0.5％。
进一步的，活性炭为药用732#，搅拌脱色时间为1小时，抽滤，抽干后加入少量无盐水顶洗活性炭，抽滤出的顶洗水合并到脱色液d后备用。
作为优选，所述步骤4)中获得的纳滤浓缩液可以直接喷雾干燥获得成品，也可以选择进一步减压浓缩干燥或冷冻干燥,大生产首选喷雾干燥。
步骤4)中使用纳滤，一方面可以浓缩，浓缩倍数可以尽量高些，以达到节能的目的，特别是后续采用浓缩干燥和冷冻干燥时，另一方面纳滤也可以滤除脱色液中部分色素和杂质，纳滤透过液基本不含黄霉素，只含有小分子量的有机和无机杂质，可部分套用于下批发酵液过滤中的顶水，以减少废水的排放。
作为优选，所述步骤4)中利用压力式喷雾干燥塔进行喷雾干燥时，控制进风温度为150-165℃，出风温度为65-75℃。
本发明公布了一种从黄霉素的发酵液中，通过预处理和过滤，获取黄霉素滤液，再采用滤液-非极性有机溶剂-水的液-液萃取、反萃取的方式生产黄霉素精品的工艺。
本发明通过调整黄霉素发酵液的ph值呈碱性，将黄霉素从菌丝体中充分释放到滤液中，再过滤发酵液除掉菌丝体，收集到富含黄霉素的滤液，滤液采用有机溶剂萃取和水反萃取两步液-液萃取工艺使黄霉素与滤液中大量杂质分离，获得高纯度的黄霉素水提液，水提液再通过活性炭脱色及纳滤进一步除杂和浓缩，获得纳滤浓缩液，浓缩液喷干即可获得白色或类白色黄霉素精品，总收率80％以上，精品效价用国家标准品和国家法定的生物检测方法检测1200-1600u/mg。如表1、表2所示，产品中的五个主要组分的比例恒定且和发酵液各组分的比例相似。
表1黄霉素发酵液五个组分的相对含量
表2黄霉素成品五个组分的相对含量
本发明利用实验得出的黄霉素具有在碱性条件下易溶于水，酸性条件下易溶于有机溶剂的特点；将黄霉素先转入滤液，再用乙酸丁酯等有机溶剂萃取和水反萃取两步液-液萃取简单的工艺分离获得了高纯度的黄霉素水提液。使用乙酸丁酯等萃取，萃取收率高，提纯效果好。经过一次反萃取即可除掉绝大部分色素和蛋白等杂质。乙酸丁酯等是一个廉价的大众化工业原料，与水的互溶度低，消耗少，易回收。工艺中的有机萃取剂、洗涤剂、纳滤透过液等都可回收循环套用，外排废水少，有利于环保，生产成本低。
脱色后的水提取液采用纳滤浓缩，除可以减少惯用的升温浓缩导致的黄霉素长期高温破坏和易生成色素杂质及浓缩过程易起泡沫造成的浓缩困难和易跑料外，还可以兼顾进一步除掉水提液残留的小分子无机和有机色素杂质等。
本发明的有益效果是：不采用其他专利普遍使用的耗时长，成本高、不宜放大生产的离子交换、多级硅胶色谱等复杂工艺，不大量使用多种无机、有机溶剂或其混合液进行除杂、吸附、洗脱、梯度洗脱等耗时长成本高难以放大生产的步骤，工艺简单、环保，易于连续化大生产；设备投资少、环保治理投资和生产过程中的环保治理费用低。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好的理解本发明方案，下面将对发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1
1)发酵液的预处理：取1.5吨发酵罐培养的周期为200小时的黄霉素发酵液1000升，效价15300u/ml，搅拌下慢慢加入浓度为30％的工业液碱溶液，碱化发酵液ph值9.5,再搅拌30分钟以上，使黄霉素从菌丝体内充分溶解到培养液中，在搅拌过程中，ph值会缓慢降低，当ph值降到8以下时，补加液碱使ph值保持在8以上。
2)发酵液的过滤：向罐中加入珍珠岩15kg,搅拌下，将发酵液缓慢打入1台15m2的隔膜式压滤机中过滤，打完发酵液，再打入约200升自来水顶洗菌丝体，打开挤压空气阀门使隔膜板框升压到4-8kg/cm2挤压，保持40-60分钟，进一步挤干残留在菌丝体中的液体到滤液中。拆板框，收集板框中的湿菌丝体约200-300kg(闪蒸干燥后可用于制备4％或8％黄霉素预混剂)。收集富含黄霉素的滤液a1000升，效价14570u/ml,用于制备黄霉素精品，发酵液过滤收率95.23％
3)溶媒萃取：获得的黄霉素滤液a按照滤液：乙酸丁酯体积比1：1的比例，加入等体积的乙酸丁酯1000升，搅拌下，通入20％的硫酸溶液，逐步调整到滤液ph值为1.5-2.0，继续间歇搅拌15分钟萃取，静止40分钟分层，分除下层的废滤液(萃取分出的废滤液蒸馏回收溶媒后外排，回收的乙酸丁酯可作为新鲜丁酯补充使用)。收集获得富含黄霉素的上层乙酸丁酯萃取液b为970升。
4)洗涤：向乙酸丁酯萃取液b中加入100升用硫酸调ph值1.5-2.0含2％的氯化钠溶液，间歇搅拌混合15分钟洗涤，静止30分钟，分层后分掉含有色素和杂质的废水层(可以和废滤液一起回收溶媒后外排)。
5)反萃取：向洗后乙酸丁酯提取液中加入无盐水970升，搅拌下再慢慢加入20-30％的氢氧化钠溶液调节水相ph值7.5后,再间歇搅拌混合15分钟萃取，静止45分钟，分层后分出下层的富含黄霉素的水提取液c为980升。
6)洗涤：向水提取液c中加入100升新鲜乙酸丁酯间歇搅拌10-15分钟洗涤除杂，分层后分出下层的富含黄霉素的洗后水提液待用。剩下的上层乙酸丁酯洗涤液和上步萃余的上层乙酸丁酯有机相合并，可用于下批滤液的萃取，反复使用。
7)脱色：向上步获得的洗后水提液中加入药用732#活性炭3kg搅拌脱色1小时，打入压滤器滤压滤，压干后继续打入60升无盐水顶洗活性炭，继续压干至无洗水流出，获得脱色液d为975升，效价13376u/ml；从滤液到脱色液收率89.5％。
8)纳滤：将脱色液d用泵打入纳滤的料液储罐，进入储罐前先通过一个100目的y型管道过滤器过滤，开启纳滤装置进行纳滤，纳滤约2小时，收集纳滤膜截留的富含黄霉素的浓缩液425升，效价29960u/ml，纳滤收率97.6％。
9)喷干：上述纳滤截留的425升黄霉素浓缩液，用蒸发能力为40升/h的压力喷干塔喷雾干燥，进风温度150-165℃；出风温度65-75℃，收集获得类白色的黄霉素精品共9480g，效价1305u/mg.喷干收率97.16％；从发酵液到精品的总收率80.8％。
实施例2
1)发酵液的预处理：取1.5吨发酵罐培养的周期为207小时的黄霉素发酵液900升，效价15700u/ml，搅拌下慢慢加入浓度为30％的工业液碱溶液，碱化发酵液ph值10.5,再搅拌30分钟以上，使黄霉素从菌丝体内充分溶解到培养液中，在搅拌过程中，ph值会缓慢降低，当ph值降到9以下时，补加液碱使ph值保持在9以上。
2)发酵液的过滤：向罐中加入珍珠岩12kg,搅拌下，将发酵液缓慢打入1台15m2的隔膜式压滤机中过滤，过滤到基本不出滤液时，再打入约200升自来水顶洗菌丝体，打开挤压空气阀门使隔膜板框升压到4-8kg/cm2挤压，保持40-60分钟，进一步挤干残留在菌丝体中的液体到滤液中。拆板框，收集板框中的湿菌丝体约200-300kg(闪蒸干燥后可用于制备4％或8％黄霉素预混剂)。收集富含黄霉素的滤液a为1050升，效价13300u/ml,用于制备黄霉素精品，发酵液过滤收率98.83％
3)溶媒萃取：获得的黄霉素滤液a按照滤液：乙酸乙酯体积比1：0.5的比例，加入等体积的乙酸乙酯525升，搅拌下，通入25％的硫酸溶液，逐步调整到滤液ph值为2.0，继续间歇搅拌15分钟萃取，静止40分钟分层，收集分出的下层的滤液，再按照滤液：乙酸乙酯体积比1：0.5的比例入乙酸乙酯525升，搅拌通入10-25％的硫酸溶液，调整滤液ph值为1.5，间歇搅拌15分钟进行第二次萃取，分层后分除下层滤液。收集获得富含黄霉素的上层乙酸乙酯萃取液和第一次的萃取液合并，获得乙酸乙酯萃取液b为990升。
4)洗涤：向乙酸乙酯萃取液b中加入100升用硫酸调ph值1.5-2.0含2％的氯化钠溶液，间歇搅拌混合15分钟洗涤，静止30分钟，分层后分掉含有色素和杂质的废水层。
5)反萃取：向洗后乙酸乙酯提取液中加入无盐水990升，搅拌下再慢慢加入30-30％的氢氧化钠溶液调节水相ph值8.5后,再间歇搅拌混合15分钟萃取，静置45分钟，分层后分出下层的富含黄霉素的水提取液c为1000升。
6)洗涤：向水提取液c中加入100升新鲜乙酸乙酯间歇搅拌10-15分钟洗涤除杂，分层后分出下层的富含黄霉素的洗后水提液待用。剩下的上层乙酸乙酯洗涤液和上步萃余的上层乙酸乙酯有机相合并，可用于下批滤液的萃取，反复使用。
7)脱色：向洗后水提液中加入糖用活性炭2.5kg搅拌脱色1小时，打入压滤器滤压滤，压干后继续打入60升无盐水顶洗活性炭，继续压干至无洗水流出，获得脱色液d为980升，效价13560u/ml；从滤液到脱色液收率95.16％。
8)纳滤：将脱色液d用泵打入纳滤的料液储罐，进入储罐前先通过一个100目的y型管道过滤器过滤，开启纳滤装置进行纳滤，纳滤约2小时，收集纳滤膜截留的富含黄霉素的浓缩液530升，效价24790u/ml，纳滤收率98.87％。
9)喷干：上述纳滤截留的530升黄霉素浓缩液，用蒸发能力为40升/h的压力喷干塔喷雾干燥，进风温度155-165℃；出风温度55-70℃，收集获得类白色的黄霉素精品共9433g，效价1266u/mg.喷干收率90.89％；从发酵液到精品的总收率84.5％。
实施例3
1)发酵液的预处理：取1.5吨发酵罐培养的周期为210小时的黄霉素发酵液1100升，效价16030u/ml，搅拌下慢慢加入浓度为20％的工业液碱溶液，碱化发酵液ph值10,再搅拌30分钟以上，使黄霉素从菌丝体内充分溶解到培养液中，在搅拌过程中，ph值会缓慢降低，当ph值降到8.5以下时，补加液碱使ph值保持在8.5以上。
2)发酵液的过滤：向罐中加入硅藻土15kg,搅拌下，将发酵液缓慢打入1台15m2的隔膜式压滤机中过滤，打完发酵液，再打入约300升自来水顶洗菌丝体，打开挤压空气阀门使隔膜板框升压到4-8kg/cm2挤压，保持40-60分钟，进一步挤干残留在菌丝体中的液体到滤液中。拆板框，收集板框中的湿菌丝体约200-300kg(闪蒸干燥后可用于制备4％或8％黄霉素预混剂)。收集富含黄霉素的滤液a为1350升，效价12450u/ml,用于制备黄霉素精品，发酵液过滤收率95.32％
3)溶媒萃取：获得的黄霉素滤液a按照滤液：乙酸乙酯：丁醇体积比1：1：0.5的比例，加入乙酸乙酯1350升，丁醇620升，搅拌下，通入10-25％的硫酸溶液，逐步调整到滤液ph值为1.7，继续间歇搅拌15分钟萃取，静止40分钟分层，分出下层的废滤液(萃取后的废滤液回收溶媒后外排，回收的乙酸乙酯和丁醇的混合物可套用到下批使用)。收集获得富含黄霉素的上层有机萃取液b为1750升。
4)洗涤：向萃取液b中加入150升用硫酸调ph值2.0含2％的氯化钠溶液，间歇搅拌混合15分钟洗涤，静止30分钟，分层后分掉含有色素和杂质的废水层(可以和废滤液一起回收溶媒后外排)。
5)反萃取：向洗后溶媒提取液中加入无盐水1500升，搅拌下再慢慢加入20-30％的氢氧化钠溶液调节水相ph值8.0后,再间歇搅拌混合15分钟萃取，静置45分钟，分层后分出下层的富含黄霉素的水提取液c为1550升。
6)洗涤：向水提取液c中加入100升新鲜乙酸乙酯间歇搅拌10-15分钟洗涤除杂，分层后分出下层的富含黄霉素的洗后水提液待用。剩下的上层乙酸乙酯洗涤液和上步萃余的上层有机相合并，可用于下批滤液的萃取，反复使用。
7)脱色：向洗后水提液中加入药用732#活性炭2kg搅拌脱色1小时，打入压滤器滤压滤，压干后继续打入100升无盐水顶洗活性炭，继续压干至无洗水流出，获得脱色液d为1600升，效价10050u/ml；从滤液到脱色液收率95.67％。
8)纳滤：将脱色液d用泵打入纳滤的料液储罐，进入储罐前先通过一个100目的y型管道过滤器过滤，开启纳滤装置进行纳滤，纳滤约2.5小时，收集纳滤膜截留的富含黄霉素的浓缩液500升，效价30550u/ml，纳滤收率95.0％。
9)喷干：上述纳滤截留的500升黄霉素浓缩液，用蒸发能力为40升/h的压力喷干塔喷雾干燥，进风温度150-165℃；出风温度65-75℃，收集获得类白色的黄霉素精品共9690g，效价1497u/mg.喷干收率94.96％；从发酵液到精品的总收率82.3％。
实施例4
1)发酵液的预处理：取15吨发酵罐培养的周期为207小时的黄霉素发酵液12000升，效价14010u/ml，搅拌下慢慢加入浓度为30％的工业液碱溶液，碱化发酵液ph值10.5.再搅拌30分钟以上，使黄霉素从菌丝体内充分溶解到培养液中，在搅拌过程中，ph值会缓慢降低，当ph值降到8.0以下时，补加液碱使ph值保持在8.0以上。
2)发酵液的过滤：将发酵液打入1台过滤面积为36m2的陶瓷膜系统循环过滤，当发酵液体积降为3-4吨时，补充自来水维持体积3-4吨继续过滤，直到滤液出口效价降为700u/ml时停止过滤，收集富含黄霉素的陶瓷膜透过滤液a19000升，效价8600u/ml,用于制备黄霉素精品，发酵液过滤收率97.19％
3)溶媒萃取：获得的黄霉素滤液a按照滤液：乙酸丁酯体积比1：0.5的比例，加入乙酸丁酯9500升，搅拌下，通入20％的硫酸溶液，逐步调整到滤液ph值为1.5-2.0，继续间歇搅拌15分钟萃取，静止40分钟分层，分出下层的废滤液再按照滤液：乙酸丁酯体积比1：0.5的比例，加入乙酸丁酯9500升同方法进行再次提取，分掉下层的废滤液(萃取分出的废滤液蒸馏回收溶媒后外排，回收的乙酸丁酯可作为新鲜丁酯补充使用)。合并两次富含黄霉素的上层乙酸丁酯萃取液b为18200升。
4)洗涤：向乙酸丁酯萃取液b中加入1200升用硫酸调ph值1.5-2.0含2％的氯化钠溶液，间歇搅拌混合15分钟洗涤，静止30分钟，分层后分掉含有色素和杂质的废水层(可以和废滤液一起回收溶媒后外排)。
5)反萃取：向洗后乙酸丁酯提取液中加入无盐水18000升，搅拌下再慢慢加入20-30％的氢氧化钠溶液调节水相ph值8.0后,再间歇搅拌混合15分钟萃取，静止45分钟，分层后分出下层的富含黄霉素的水提取液c为18300升。
6)洗涤：向水提取液c中加入2000升新鲜乙酸丁酯间歇搅拌10-15分钟洗涤除杂，分层后分出下层的富含黄霉素的洗后水提液待用。剩下的上层乙酸丁酯洗涤液和上步萃余的上层乙酸丁酯有机相合并，可用于下批滤液的萃取，反复使用。
7)脱色：向上步获得的洗后水提液中加入药用732#活性炭35kg搅拌脱色1小时，打入板框压滤器滤压滤，打完料后继续打入500升无盐水顶洗活性炭，继续过滤至无洗水流出，获得脱色液d为18700升，效价8370u/ml；从滤液到脱色液收率95.79％。
8)纳滤：将脱色液d用泵打入纳滤的料液储罐，进入储罐前先通过一个100目的y型管道过滤器过滤，开启纳滤装置进行纳滤，纳滤约24小时，收集纳滤膜截留的富含黄霉素的浓缩液4900升，效价31050u/ml，纳滤收率97.2％。
9)喷干：上述纳滤截留的4900升黄霉素浓缩液，用蒸发能力为200升/h的压力喷干塔喷雾干燥，进风温度150-165℃；出风温度65-75℃，收集获得类白色的黄霉素精品共103.8kg，效价1365u/mg.喷干收率93.13％；从发酵液到精品的总收率84.28％。
上述具体实施方式用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。