专利名称：用于提高斑贝链霉菌黄霉素产量的方法及菌株的制作方法
技术领域：
本发明属于工业微生物分子育种领域，具体涉及大肠杆菌-斑贝链霉菌接合转移系统的优 化，高产斑贝链霉菌菌株的选育，中间载体的构建和利用筛选得到的斑贝链霉菌菌株提高黄 霉素产量的方法。本发明利用基因工程手段破坏一个基因来达到提高斑贝链霉菌产生黄霉素
水平的方法，该基因为基因的同源基因，wW基因在天蓝色链霉菌(&^pto;n_ycM coe"co/or)和阿维链霉菌(&^ptom_yces averw/rifc)中是一个抗生素产生的负调节基因。本 发明建立在斑贝链霉菌中将"^i4同源基因破坏，利用改造的菌株提高黄霉素的产量。
背景技术：
链霉菌属于一类极具商业价值的工业微生物。自然界中有近70%的抗生素是由链霉菌及 其近缘放线菌产生的，它们分别在抗肿瘤、抗真菌、抗细菌、抗寄生虫等方面具有功效。例 如用于抗家畜寄生虫和杀螨虫的阿维菌素，防治水稻纹枯病的井岗霉素，用于医疗和和兽药 的红霉素、泰乐菌素、金霉素，用于动物生长促进剂的黄霉素，用于植物保护的春日霉素、 多氧霉素、庆大霉素，用于抗肿瘤的柔毛霉素，用于免疫抑制剂的FK506和雷帕霉素等。
由于链霉菌具有如此大的商业价值，人们想出了很多方法来提高链霉菌的抗生素产量， 这些方法主要包括两大类 一类是通过物理化学的方法对链霉菌进行诱变，然后在诱变后代 中筛选高产菌株，这类方法具有很大的盲目性，筛选工作量很大；另一类就是通过遗传学方 法对菌株进行直接的改造，如原生质体融合再生法，基因工程手段来提高抗生素产量。随着 分子生物学技术的不断发展，链霉菌基因组研究的不断深入，人们对链霉菌基因功能认识在 不断深化，通过基因工程手段对菌株进行改造已经成为可能。
对链霉菌进行遗传操作，首先要建立方便快捷的操作方法，其中原生质体转化和大肠杆 菌一链霉菌属间接合转移是两种最常用的方法。原生质体转化法由于步骤复杂，原生质体再 生容易发生突变及再生困难等难题己经逐渐被接合转移法所代替。接合转移方法受体链霉菌 状态分为两种， 一种是孢子热激法，另一种是菌丝体法。对于接合转移，受体菌状态是影响 因素之一，另一种就是接合转移用的培养基。合适的培养基可以显著提高接合转移效率。
通过基因工程手段对链霉菌进行改造，提高抗生素的产量，主要是通过改造抗生素产生 的调节基因和关键限速酶基因来实现的。这些调节基因，有的是起正调节作用的，有的是起 负调节作用的，有的是多效性的，有的是专一性的。对于正调节基因，可以通过增加基因剂 量的方法实现抗生素的增产；对于负调节基因，则可通过破坏该基因来提高抗生素的产量。
而破坏负调节基因的方法主要是通过基因中断或置换来实现的。其基本原理是基于染色体的
同源重组，即用作基因置换的质粒上蘀带有旃个苌'度合'造而且天然方向一致的染色体片段， 片段之间插入能在链霉菌中表达的抗性标记(如安普霉素)，同时载体部分也含有在链霉菌中 表达的抗性标记(如卡那霉素和硫链丝菌素)。基因置换是在抗生素的选择压力下，以单拷贝 或低拷贝的形式发生的，因此质粒在受体菌中一般是不复制的。质粒通常采用的形式有几种， 如只在大肠杆菌中复制的单功能载体，温敏型质粒或复制及稳定功能有缺陷的质粒。当质粒 转入受体菌时，可通过单抗或双抗筛选获得发生单交换的转化子，质粒这时通过与染色体上 同源片段之间的重组而整合到染色体上。将上述转化子在松弛条件下生长一代或几代，可大 大提高二次交换发生的频率，然后通过影印或者点种在两种不同抗生素平板上，挑取只对插 入抗性标记敏感的转化子即可能为发生基因置换的菌株。
"5ti4^^ (negative regulator of S^eptomycas differentiation)是一个首先在天蓝色链霉菌 中发现的全局性负调控基因，对天蓝色链霉菌的产孢、形态分化与抗生素的合成均有负调控 作用。后来又相继在多种链霉菌中发现了"^^同源基因的存在。目前文献中，还没有利用该 基因来提高斑贝链霉菌黄霉素产量的报道。
本发明的工作是黄霉素生产菌株斑贝链霉菌ZM2006中进行的。对于黄霉素生物合成基因 簇的研究现在还是空白，但是通过"^^通用引物PCR扩增斑贝链霉菌基因组DNA，发现在斑 贝链霉菌染色体上存在"Wv4的同源基因。
发明内容
本发明的目的在于通过基因工程手段来提高斑贝链霉菌黄霉素产量，该方法是分子生物 学方法的一种，通过破坏斑贝链霉菌染色体上的MdL4同源基因，达到提高黄霉素产量的目的。
本发明进一步提供了对斑贝链霉菌进行遗传操作的培养基，通过该培养基可以快速对斑 贝链霉菌进行遗传操作。
本发明提供的提高斑贝链霉菌黄霉素产量的方法如图l所示，首先，通过通用引物P1和P2 从斑贝链霉菌基因组DNA中PCR扩增包括似c^同源基因在内的基因片段，得到含有"^i4同源 基因片段的重组载体。第二步，通过保守引物P3和P4从所构建的重组载体中PCR扩增"^i4同 源基因保守区段；对所得到的《 ^同源基因保守区段进行测序、比较，确定斑贝链霉菌中"^4 同源基因的存在；构建n^W基因被破坏了的重组载体。在本发明的实施例中构建了一个这样 的重组载体，S卩pZMOOl。第三步，通过接合转移将第二步得到的重组载体转移到斑贝链霉菌 ZM2006中。第四步，通过抗性筛选得到"sdL4基因被破坏了的斑贝链霉菌菌株。第五步，通过 PCR验证第四步得到的斑贝链霉菌菌株。本发明的实施例得到了四株这样的斑贝链霉菌菌株， 分别是ZM2007-1、 ZM2007-2、 ZM2007-3和ZM2007-4。第六步，对第五步所得的斑贝链霉菌 菌株进行发酵分析，得到黄霉素高产菌株ZM2007-2 (学名为Str印to/B!Kces 6a/^e/^i'e/7sis)，
于2007年8月24日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC;地
址北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所；邮政编码100101)，保藏号为CGMCC No. 2140。对该方法的具体说明请参见本发明的实施例。
本发明的优点是，建立了斑贝链霉菌方便快捷的遗传操作方法，克服了物理化学诱变的 肓目性和工程浩大的筛选丁作，利用破坏一个在链霉菌中广泛存在的负调节基因，提高黄霉 素生产菌株的产量。
附图l:利用破坏"^L4同源基因提高斑贝链霉菌黄霉素产量的流程附图2:本发明实例中斑贝链霉菌"^^同源基因与天蓝色链霉菌"^i4基因序列同源性比较； 附图3:本发明实例中"^i4基因破坏后黄霉素产量提高的效果图。 附图4:本发明实例中用于斑贝链霉菌的中间载体pZM001的物理构建图谱。
具体实施例方式
实施例利用中断斑贝链霉菌菌株中的;m^基因来提高黄霉素产量 (1)从斑贝链霉菌的基因组DNA中PCR克隆包含肌dL4基因的片段
(a)在30mLTSB培养基(如后面所述)中接种斑贝链霉菌ZM2006,在37。C培养36hr，收 集菌丝体，抽提基因组DNA; (b)以斑贝链霉菌ZM2006的基因组DNA为模板，用生物信息学分 析得到的通用引物P,: GAAGATCTCATGGACGAGCTGGGCAA和P2: GAAGATCTCCTTGATCTCGTCGAGCCG进 行PCR扩增，PCR反应程序为:95'C预变性5min; 95'C变性45秒，58。C复性lmin， 72。C延伸5min， 30循环；72'C延伸5min。琼脂糖凝胶电泳检测，得到4.7kb左右的带。(c)将(b)得到的4. 7kb 的条带进行琼脂糖凝胶回收，与载体pMD18-T (购于TaKaRa公司的AT克隆试剂盒)进行酶连反 应；(d)将(c)得到的酶连产物转化DH5a感受态细胞，得到质粒pBIBOOl。
在本实例中以下是应用到的一些培养基的组成(包含一些单项的制备方法)； TSB培养基(用于培养斑贝链霉菌，液体)
BD胰胨豆汤粉30g，蒸馏水1000mL, 121。C灭菌15min。 斑贝链霉菌基因组DNA抽提方法
用TSB培养基培养斑贝链霉菌菌丝体，吸取一定量的菌液于1.5mL离心管中，3000rpm 离心15min收集菌体，加入lmL 10.3%蔗糖溶液洗涤菌体两次后用500 u L溶菌酶溶液重新 悬浮50mg菌丝体，于37'C温育约30min至细胞成为半透明状。加入500 u L 2% SDS,混合 振荡约lmin直到溶液的粘度显著下降，55'C温育15min，然后加入1/10体积3M醋酸钠 (unbuffered)和200 uL中性苯酚/氯仿，混合振荡均匀后，12000rpm离心5min，小心地吸 取上清液，弃去白色中间层。用中性苯酚/氯仿重复四五次抽提直至看不见(或非常少)中
间层为止，最后加入l倍体积的异丙醇(或2.2倍体积的无水乙醇)，反复颠倒至絮状DNA 沉淀出现。用枪头挑取沉淀块置于一新离心管中，加入75。/。乙醇洗涤DNA两次，最后弃去 所有上清液，待乙醇挥发后，溶解于一定量TE缓冲液中。 LB培养基配方
胰蛋白胨10g,酵母抽提物5g， NaC15g，蒸馏水1000mL， pH7.0 LA培养基配方
胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g， NaC15g，琼脂16g，蒸馏水1000mL, pH7.0 大肠杆菌培养方法
在LB培养基中37t:振荡培养过夜。 大肠杆菌质粒抽提方法-
大肠杆菌在加入合适抗生素的LB培养基中37'C培养过夜，用1.5mL离心管收集菌液， 12000rpm离心30s去上清收集菌体，加入200 u L预冷的溶液I (50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl， 10mMEDTA，pH8.0)悬浮菌体，振荡均匀后加入400 u L溶液II (0.2M NaOH, 1% SDS)，快速颠倒10次左右混合均匀(动作要轻柔)，然后再加入300iiL溶液ni (3.0M乙酸 钾，pH4.8)混合均匀，12000rpm离心5min，吸取上清，用1/4体积苯酚氯仿溶液振荡抽提， 12000rpm离心5 min后吸取上清，加入1倍体积异丙醇沉淀质粒DNA,离心5min后去上清收 集沉淀物，用70%乙醇洗涤两次，置工作台吹干后加一定量的TE缓冲液或ddH20溶解。 限制性内切酶的酶切反应方法
限制性内切酶酶切反应的体系为质粒DNA 0.5-2 y g, 10X酶切缓冲液2.5uL,限制性 内切酶5单位，双蒸水加至25ul，总体系为25uL。反应条件为37'C水浴3 5hr。 DNA的琼脂糖凝胶回收方法
将无石蜡油的PCR反应液或酶切反应液(50 100y L反应体系)在1%的普通琼脂糖凝胶 上电泳，染色。在长波紫外灯卜迅速切下含有目标DNA片段的琼脂糖凝胶，并装入2mL离心 管屮。尽量切掉不含DNA的琼脂糖凝胶，这样可简化操作,提高回收量及DNA片段的质量。 200—400mg琼脂糖凝胶中加入0.4mL纯化树脂(使用前充分混匀)，7(TC保温5—10min，每 2min颠倒混匀1次，使琼脂糖凝胶完全融化。对于高浓度的琼脂糖凝胶(2.0%)，每200mg 的琼脂糖凝胶中加入500 y L纯化树脂，加热时间延长到15min将混和液装入离心纯化柱， 13000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。加入500u L 80%异丙醇(或乙醇)，13000rpm 离心30秒，倒掉收集管中的废液。重复上步一次，此步骤13000rpm离心2min，务必将异丙 醇(或乙醇)，再离心lmin。将纯化柱套入干净的1.5mL或2mL离心管中，加入40uL超纯 水或TE缓冲液于纯化树脂上，不能粘在管壁上。放置2min后，13000卬m离心30秒。离心
管中的液体即是纯化的PCR产物，取4u L电泳检测。 酶连反应方法
一般采用10pL反应体系T4连接酶1 nL ,连接酶缓冲液l nL ，外源片段与载体按 DNA摩尔含量3:1或外源更多。 大肠杆茵感受态的制备(CaCl2法)及转化方法
用牙签接种一JM109菌株(或DH5oc菌株)单菌落于5mLLB中37。C振荡培养过夜，然 后按50 100: 1转接于5mL LB中37'C培养至OD60(H).5~0.8左右停止培养。吸取1.0 mL菌 液于1.5mL离心管中,冰中放置10min， 4'C 3500 rpm离心4min，吸取上清，加入500yL预 冷的0.1MCaCl2,溶液悬浮菌体，于冰中继续放置30min， 3500 rpm离心4min，吸取上清，加 入100uL预冷的0.1MCaCl2悬浮菌体，置冰上48hr内用于转化。大肠杆菌感受态细胞也可 以长期保存，制备方法同短期使用的感受态细胞，最后一步菌体悬浮釆用15%甘油(V/V) 配制的0.1MCaCl2,于-20'C预冻lhr后转移至-70'C低温冷藏。
转化时每管加入1 u L质粒DNA (酶连产物视具体情况而定)，于冰上放置30min， 42。C 热激90秒后继续放置冰上2mm,加入150ii LLB于37匸振荡培养45min，然后按每平皿100 WL的量涂布于LA平板上。对于用蓝白斑筛选重组质粒，事先应在平板中分别涂布9txL和 40uL的IPTG (20%， W/V)禾B X-Gal (2%， W/V)， 37。C避光放置2 3hr待完全吸收后备 用。
(2)包含被破坏了wsrf^基因的重组载体pZM001、 pZM002和pZM003的构建
2.1 ( a )以质粒pBIBOOl DNA为模板，P3: CCCTGGACGGGCCCGCAGAC和P4 : CAGCTCGGCCTCGGAGAAGA为引物进行PCR扩增，PCR反应程序为95。C预变性5min; 95。C变性45 秒，58。C复性lmin， 72。C延伸5min, 30循环;72。C延伸5min。琼脂糖凝胶电泳检测，得到O. 8kb 左右的带。(b)将(a)得到的0.8kb左右的条带进行琼脂糖凝胶回收，与载体pMD18-T (购于 TaKaRa公司的AT克隆试剂盒)进行酶连反应；(c)将(b)得到的酶连产物转化DH5 a感受态 细胞，得到质粒pBIB002。将pBIB002送生工测序，软件分析发现与天蓝色链霉菌/ ^Z4基因序 列高度相似，同源性高达89.2% (见附图2)。
2. 2(a)plj773用和〃i7 c/[11双酶切，然后通过琼脂糖凝胶电泳回收1. 4kb的片段， 作为PCR反应的模板。根据质粒pBIB002测序结果设计两条引物，P-SaF: CGGTA-
CTGTTC，用PCR的方法扩增。PCR反应程序为95。C预变性5min; 95。C变性45秒，63°C 复性lmin， 72。C延伸2min， 30循环;72。C延伸5min。琼脂糖凝胶电泳检测，得到1. 4kb左
右的带。将此扩增带通过琼脂糖凝胶电泳回收。(b)将pBIBOOl转化含有质粒plj790的大肠 杆菌BW25113感受态细胞，得到含有pBIBOOl和plj790两个质粒的BW25113菌株，用 BW25113/pIJ790/pBIB001表示。(c)制作由(b)得到的BW25113/pIJ790/pBIB001的电转化感 受态细胞，用(a)得到的1.4kb的回收片段通过电转化的方法导入BW25113/pIJ790/pBIB001 细胞中，用含安普霉素(50ug/mL)的LA平板作为选择培养基进行筛选，挑取转化子。(d) 将转化子抽提质粒，然后转化大肠杆菌DH5 a ，用含安普霉素(50ug/mL)的LA平板作为选 择培养基进行筛选，得到转化子，将转化子命名为pBIB003。 (e)将由(d)得来的pBIB003 用5^11酶切，回收5. 6kb的片段，与用BamHI酶切的SuperCosl连接，将连接产物转化大 肠杆菌DH5a感受态细胞，用含安普霉素(50yg/mL)的LA平板作为选择培养基进行筛选， 得到转化子，将转化子命名为pZMOOl， pZMOOl的物理构建图如图4所示。 SOB培养基配方
胰蛋白胨20g，酵母抽提物5个，NaC10.5g，蒸馏水定容到1L， 12rC灭菌30rain，用前
加入lMol/L MgS04 20mL。
BW25113/PIJ7卯/pBIB001的电转化感受态细胞的制作方法
(a) 挑取BW25113/pIJ790/pBIB001大肠杆菌单菌落，接入5mL含25ug/mL氯霉素，100yg/mL 氨苄青霉素的SOB-MgS(UMgS04终浓度20mMolv/L)中，30。C振荡培养过夜；
(b) 取200y L过夜培养物至10mL新鲜的S0B-MgS04 (含25ug/mL氯霉素，100ug/mL氨苄青 霉素)中，添加100uLlMol/L的阿拉伯糖诱导入-red重组系统，于30。C,振荡培养3 4hr至0D6,麵等于0. 4 0. 6;
(c) 将培养物转入Universal瓶中，冰上放置10min (以下步骤细胞温度要保持在0 4。C);
(d) 3500rpm 4'C离心5min，弃去上清；
(e) 加入10mL预冷的10X甘油，摇匀。3500rpm 4。C离心5min，弃去上清；
(f) 加入5mL预冷的10X甘油，摇匀。3500rpm 4。C离心5min，尽量弃去上清，用残留液将 细胞打散。
将1.4kb的回收片段电转化BW25113/PIJ790/pBIB001细胞的方法
(a) 在预冷的0.2cm的电转化杯中混合50uL电转化感受态细胞与l 2uL 1.4kb的回收 片段，混匀后立即电击，电击条件200 Q， 25uF, 2.5kv;
(b) 立即在电转化杯中加入lmL预冷的LB,冰上放置lmin，转入1.5mLEP管中，37。C振 荡培养lhr;
(c) 将培养的菌体于4000rpm离心4min，去掉900yL上清，将剩余的菌体沉淀打散，涂
布含有50ug/mL安普霉素的LA平板，37'C培养过夜，得到转化子。(3) 将重组载体pZM001通过接合转移的方法导入斑贝链霉菌ZM2006中
实验过程中发现，由于斑贝链霉菌生产菌产孢能力不强，已报道的大肠杆菌与斑贝链霉 菌的接合转移方法(凌华云论文)已不适合斑贝链霉菌"^^基因中断菌株的筛选，通过摸索 确定斑贝链霉菌接合转移方法如下
(d) 将重组载体pZM001转化含有pUZ8002质粒的大肠杆菌ET12567感受态细胞中，得 至lj含有pZMOOl和pUZ8002两个质粒的大肠杆菌ET12567菌株，用 ET12567/pUZ8002/pZM001表示。
(e) 接种lmL斑贝链霉菌液体培养物于15mLTSB培养基中，37'C培养18hr。
(f) 转接2mL (b)中得到的斑贝链霉菌液体培养物于18mL新鲜TSB培养基中，37'C培 养16hr。同时挑取大肠杆菌ET12567/pUZ8002/pZM001单菌落于5mL LB (含有50y g/mL卡那霉素、25ug/mL氯霉素和50^g/mL安普霉素)中，37'C培养16hr。
(g) 转接2mL(c)中得到的斑贝链霉菌液体培养物于18mL新鲜TSB培养基中，37'C培 养3 4hr。同时挑取大肠杆菌ET12567/pUZ8002/pZM001单菌落于5mL LB (含有50 ug/mL卡那霉素、25yg/mL氯霉素和50ug/mL安普霉素)中，37。C培养3 4hr。
(h) 同时收集斑贝链霉菌菌丝体和大肠杆菌培养物，3500rpm离心10min去上清，收集 菌体，用新鲜TSB悬浮菌体。3500rpm再离心10min去上清，用1/10体积的TSB悬浮 菌体。
(i) 对斑贝链霉菌菌丝体进行适度的稀释，选择合适的稀释度，与大肠杆菌等体积混 合后涂布于AS- I和MS培养基，于37。C培养18 20hr。
(j)用含有500u g/mL萘啶酮酸和900u g/mL的安普霉素的lmL水溶液均匀覆盖平板表
面，在超静工作台上打开平板盖子吹30min使平板表面干燥。 (k)继续置37'C培养5 7天后可观测到接合转移子。
MS培养基(用于大肠杆菌与斑贝链霉菌的接合转移)配方
甘露醇20g,大豆粉20g琼脂粉20g，自来水1000mL， 115°C， 15min灭菌2次后备用。 AS-I培养基(用于大肠杆菌与斑贝链霉菌的接合转移)配方
可溶性淀粉5g， NaC12.5g， Na2SO410g， Yeast Extract lg，丙氨酸0.2g，精氨酸0.2g, 天冬酰胺0.5g， 20g琼脂粉，蒸馏水1000mL, pH 7.5
(4) 筛选ws^i4同源基因被破坏了的斑贝链霉菌 将得到的含有PMZ001质粒的斑贝链霉菌菌株接种到含有25 " §/11^萘啶酮酸的八5- I培养
基上，37'C培养5天待其长出基内菌丝，挖块接种于30mL含有30ug/mL安普霉素的TSB培养基 中，37'C培养48hr。将培养物超声波破碎后梯度稀释，选择1(T4， l(T5， 10—6这些不同的稀释
度涂布含有30ug/mL安普霉素的AS-I平板上，置于37'C培养5 7天，待长出菌落后点种到含 有25yg/mL卡那霉素的AS-I平板上，37'C培养5 7天后观察，选取在含有25 u g/mL卡那霉素 的AS- I平板上没有生长的菌落，这些具有安普霉素抗性但对卡那霉素敏感的菌落即为nsdA 基因被破坏的斑贝链霉菌，将其命名为ZM2007。重新接种到含有30yg/mL安普霉素的TSB培养 基中，37。C培养36 48hr，收集菌丝体备用。
(5) 斑贝链霉菌ZM2007的PCR验证 抽提斑贝链霉菌ZM2006和ZM2007的总DNA，用P3和P4进行PCR反应，PCR反应程序为
95。C预变性5min; 95。C变性45秒，58。C复性lmin， 72。C延伸2min， 30循环;72。C延伸5min。 琼脂糖凝胶电泳检测的结果为，ZM2006的总DNA能扩增出800bp的特征带；nsdA基因被破坏的 菌株ZM2007的总DNA能扩增出1. 6kb左右的特征带。
(6) 用HPLC测定ZM2007-2产生的黄霉素与出发菌株ZM2006的比较 首先接ZM2006和ZM2007-2单菌落于黄霉素种子培养基(淀粉30g，豆饼粉30g，
K2HP04 .3H20 0.2g， pH7.0-7.2，蒸馏水1L, 12rC灭菌30min )，于37。C 180rpm培养48hr，然 后将培养物1.5mL接种到50mL黄霉素发酵培养基(淀粉50g，豆饼粉20g，玉米浆9g， K2HP04.3H2O0.15g， pH 7.0-7.2， CaCO32,0g，蒸馏水1L， 121。C灭菌30min), 37。C培养7天， 得到发酵产物。
称2g发酵液，加入10mL萃取液(甲醇50%水溶液)，超声30min， 12000rpm离心5min，取 上清进行HPLC分析。HPLC泵K-501，紫外检测器K-2501，色谱柱，C18(5Wn, 250mm*4.6mm); 以0.2%甲酸铵溶液(用10。/。磷酸溶液调节pH值至4.9)-乙腈(55: 45)为流动相，流速为每 分钟0.5mL;检测波长为258nm。根据HPLC分析得到各组分面积，计算ZM2006和ZM2007-2 的积分面积，中断菌株ZM2007-2的黄霉素产量与出发菌株ZM2006相比，提高了20%。
权利要求
1. 一种提高斑贝链霉菌黄霉素产量的方法，其步骤是(a)建立高效的大肠杆菌-斑贝链霉菌接合转移系统；(b)利用通用引物从斑贝链霉菌基因组DNA中扩增nsdA同源基因片段，得到含有nsdA基因片段的重组载体；(c)构建nsdA基因被破坏了的重组载体；(d)通过接合转移将(c)步骤得到的重组载体转移到斑贝链霉菌中；(e)抗性筛选得到nsdA基因被破坏了的斑贝链霉菌菌株；(f)PCR验证(e)步骤得到的斑贝链霉菌菌株；(g)测定(f)步骤得到的斑贝链霉菌菌株的产抗生素的能力，得到黄霉素高产的斑贝链霉菌菌株。
2. —种斑贝链霉菌ZM2007 (5""邵to附yces 6am6e/^en^ ZM2007，保藏在CGMCC ，保藏 编号为CGMCC No.2140)。
3. 权利要求1所述的方法，其中所述大肠杆菌-斑贝链霉菌接合转移系统所用培养基为MS 和AS- I培养基。
4. 权利要求1所述的方法,其中(c)步骤中构建的基因被破坏了的重组载体是pZMOOl。
5. 权利要求2所述的菌株在提高黄霉素产量中的应用。
全文摘要
本发明属于工业微生物分子育种领域，具体地说属于利用分子生物学手段提高斑贝链霉菌黄霉素产量的方法及其高产菌株的选育。本发明的方法包括建立高效的大肠杆菌-斑贝链霉菌属间接合转移系统；利用通用引物从斑贝链霉菌基因组DNA中将含有nsdA同源基因的片段克隆下来，得到含有nsdA同源基因片段的重组载体；构建nsdA基因被破坏了的重组载体；将此载体转移到斑贝链霉菌中；通过抗性筛选得到nsdA同源基因被破坏的斑贝链霉菌菌株；对斑贝链霉菌菌株进行黄霉素发酵测定，得到黄霉素高产菌株。所述斑贝链霉菌保藏于CGMCC。本发明解决了现有技术存在的缺陷，提供了利用基因工程手段改造斑贝链霉菌及提高黄霉素产量的新途径。
文档编号C12R1/465GK101381722SQ200710146028
公开日2009年3月11日 申请日期2007年9月7日 优先权日2007年9月7日
发明者张国栋, 芹 曹, 郑应华, 勇 闵, 鹏 齐 申请人:中牧实业股份有限公司