专利名称：：一种哺乳动物胚胎的体外处理方法及在胚胎移植中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种哺乳动物胚胎的体外处理方法及在胚胎移植中的应用，本发明尤其是涉及一种牛的胚胎体外处理方法及在胚胎移植中的应用。技术背景胚胎是通过将一头良种母畜配种后的早期胚胎取出，或者通过体外受精及其它方式获得的胚胎。胚胎移植是指将胚胎移植到同种的、生理状态相同的母畜体内，使之继续发育成为新个体的繁殖技术。动物胚胎移植首次试验成功距今已有ioo余年，但长期以来并未用于畜牧生产，直到20世纪70年代中期才作为提高母畜繁殖的一种技术和家畜育种、胚胎工程的手段而得到实际应用。胚胎在发育早期的一段时间内(附植之前)，在输卵管和子宫内处于游离状态，和子宫还没有建立实质性的联系，因此可以脱离母体而被取出，在短时间内和适当的条件下仍能够存活，当放回到与供体相同的环境中，能够继续发育。所谓附植是指哺乳动物囊胚滋养层细胞与母体子宫上皮细胞之间逐步建立组织和生理上联系的过程，其作用是为胎儿以后的发育提供充足的营养。胚胎发育早期一直处在透明带中，除了保护早期胚胎，透明带在受精过程中起着十分重要的作用，精-卵的种属特异性识别及结合必须发生在透明带表面的受体上，倘若这些受体一旦被遮盖或改变了性质，则精-卵识别及结合便无法进行。胚胎发育到扩张囊胚后，透明带变薄，扩张囊胚进一步发育，逐渐从透明带中脱出来，此时的透明带就只是一个胚胎的附属物，如果胚胎不能突破透明带反而会阻碍胚胎着床，好多IVF(体外受精)胚胎因无法突破透明带，到发育后期就凋亡了。从透明带中脱出的囊胚称为孵化囊胚，这一阶段的胚胎细胞分化为两类，即外周的滋养层细胞和内层的内细胞团细胞。滋养层细胞能选择吸收外界的营养物质，供胚胎发育需要。滋养层细胞将来主要发育为胎盘的绒毛膜，内细胞团细胞进一步分化，最终形成胎儿。囊胚在孵化过程中或孵化以后发出妊娠信号，与母体子宫建立初步联系。胚胎移植可以充分发挥优良母畜的繁殖潜力，提高繁殖效率，代替种畜的引进，同时也是育种工作的有效手段。'另一个与现有胚胎移植技术相关联的问题是，由于常规胚胎移植技术的妊娠率仅为40%左右,所以使该方法的使用受到了限制
发明内容本发明的目的是提供一种牛的胚胎体外处理方法，此方法克服了常规方法的上述问题，此种方法可使牛的胚胎的移植妊娠率提高20%。在达到上述目的过程中，本发明提供了一种牛的胚胎的体外处理方法，此法包括(1)选择良种母牛作为供体，在发情周期的6~15天，每头牛注射PG0.4~0.6mg,进行同期发情处理，于发情后的9~12天注射FSH，每天早、晚各注射一次，逐次递减，总剂量为10mg，在第12天注射FSH的同时注射PG0.4~0.6mg,供体牛发情后进行人工授精，于供体牛发情配种后的68天，釆用常规非手术法冲胚。将获得的胚胎经冷冻-解冻后移植或直接移植鲜胚，胚胎移植前将透明带进行打口。(2)透明带打口处理胚胎移植前，在培养皿中用培养液(PBS+10穿BS或Holding)做成100nL的液滴，将待处理的胚胎放入培养液滴中，利用显微操作系统的Holding针固定住胚胎，在胚胎的透明带与内细胞团之间，用打口针沿内细胞团水平切线处穿入透明带，然后用打口针轻轻挑破透明带，使透明带上形成一个10士2nm-30土2]Lim的微口；或者在体视显微镜下，用微型刀片在胚胎的透明带上徒手切割一个10±2nm-30±2nm的微口。(3)将经过处理的胚胎移植到牛的子宫内。附图为胚胎透明带打口示意图。l为胚胎的透明带，位于胚胎的最外层，2为胚胎内细胞团，3为Holding针，利用其负压将胚胎固定，4为打口针，用于胚胎在透明带上打口。用Holding针3将胚胎固定后，在胚胎的透明带1与内细胞团2之间，用打口4针沿内细胞团2水平切线处穿入透明带1，然后用打口针4轻轻挑破透明带l。这样就在胚胎透明带l上形成了一个微口。具体实施方式从以下实施例将进一步理解本发明。实施例1:取30枚牛的胚胎，在培养皿中用培养液(PBS+10%FBS或Holding)做成100jaL的液滴，将待处理的胚胎放入培养液滴中，利用显微操作系统Holding针固定胚胎，在胚胎的透明带与内细胞团之间，用打口针沿内细胞团水平切线处穿入透明带，然后用打口针轻轻挑破透明带，使透明带上形成一个IO士2jam的微口；或者在体视显微镜下，用微型刀片在胚胎的透明带上徒手切割一个10±2|Lim的微口。经处理后的胚胎分别移植到30头受体牛的子宫内，60天后用兽用B超机观察受体牛的受孕情况。另取31枚牛的胚胎，分别直接移植到31头受体牛的子宫内，60天后用兽用B超机观察受体牛的受孕情况。两组对照妊娠结果见表l。<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>实施例2:重复实施例l,有以下不同点,试验组胚胎透明带微口大小为20±2nm。两组对照妊娠结果见表2。<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>实施例3:重复实施例l，有以下不同点,试验组胚胎透明带微口大小为30土2)im。两组对照妊娠结果见表3。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>有益效果以上结果表明，胚胎移植前，在胚胎的透明带上打一个微口,可使其移植妊娠率提高20.4%。权利要求1.一种哺乳动物胚胎的体外处理方法，包括(1)在培养皿中用培养液(PBS+10％FBS或Holding)做成100μL的液滴，将待处理的胚胎放入培养液滴中；(2)利用显微操作系统的Holding针固定住胚胎，在胚胎的透明带与内细胞团之间，用打口针沿内细胞团水平切线处穿入透明带，然后用打口针轻轻挑破透明带，使透明带上形成一个微口；(3)或者在体视显微镜下，用微型刀片在胚胎的透明带上徒手切割一个微口。2.权利要求1所述的哺乳动物胚胎体外处理方法为在胚胎移植中的应用。3.权利要求1所述的哺乳动物胚胎体外处理方法为牛的胚胎体外处理方法。4.权利要求2所述的胚胎移植中的应用为牛的胚胎移植中的应用。5.权利要求1所述的微口大小为10±2pm-30±2]um。全文摘要本发明涉及一种哺乳动物胚胎的体外处理方法及在胚胎移植中的应用，尤其是涉及一种牛的胚胎体外处理方法及在胚胎移植中的应用。该技术将哺乳动物的胚胎放在PBS+10％FBS或Holding培养液滴中，利用显微操作系统Holding针固定胚胎，用打口针在透明带上打一个10±2μm-30±2μm的口；或者在体视显微镜下，用微型刀片在透明带上打一个10±2μm-30±2μm的口，使其更容易着床，从而提高胚胎的移植妊娠率。文档编号C12N5/06GK101386838SQ20071014543公开日2009年3月18日申请日期2007年9月12日优先权日2007年9月12日发明者孟令会,李兆元,李叙浩,李雪松申请人:廊坊开发区圣隆生物科技有限公司