一种牛早期胚胎滋养层组织的获得方法与流程

本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及一种牛早期胚胎滋养层组织的获得方法。

背景技术：

胚胎植入是哺乳动物生殖的关键环节。在母体-胚胎界面上，滋养层细胞与母体子宫内膜细胞在妊娠识别和胚胎植入过程中起着决定性作用，尤其是滋养层细胞，在胚胎植入过程中起主导作用，其侵袭与增殖以及功能调节的失常与多种妊娠相关疾病的发生、发展有密切关系。同时，滋养层细胞是胎盘屏障的重要组成部分，是母体血液进入胎儿的第一道屏障，对于母体妊娠识别与建立过程中的免疫耐受发挥了重要作用。利用一整套技术方法在特定妊娠阶段分离出滋养层组织后消化处理为单个细胞便可以进行体外培养，这种体外培养的滋养层细胞最接近体内真实的细胞生物学状态，是研究胚胎植入、子宫内膜变化、滋养层细胞自分泌调控等妊娠生物学现象的理想体外模型，也是进行着床失败、早期胎儿死亡等妊娠相关疾病预防和治疗研究的重要细胞素材和实验基础，可以为将来制定人工干预提高母畜受胎率的策略提供理论基础。另外，由于滋养层细胞可通过旁分泌启动母体妊娠识别，胚胎移植时可通过加入体外培养的滋养层细胞来提高移植成功率，对于改善胚胎移植成功率低的现状有重要的实践意义。

综上所述，滋养层组织的获得是牛滋养层细胞原代培养的关键前提。截至目前，有研究人员通过收集怀孕牛45-60天的子宫采集胚胎子叶来分离滋养层细胞，也有学者在牦牛中以妊娠8-10周龄(56-70天)的胎儿胎盘组织作为素材，通过消化、分离和纯化来获取滋养层细胞。但是，胎盘随着妊娠月份的增加而逐渐老化，同时滋养层细胞也随之老化，导致细胞数量少、活力低，而且容易混有较多成纤维细胞、间质细胞及其他细胞成分，难以保证能获得性状稳定且纯度高的滋养层细胞，这样做不仅会增加后续目标细胞纯化筛选的复杂性、影响工作效率，还会因繁琐的额外操作步骤严重影响滋养层细胞的活力和/或活率。

因此，亟需开发一种精准获得高质量牛滋养层(细胞)的方法。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种牛早期胚胎滋养层组织的获得方法。

本发明的发明人发现，根据奶牛早期胚胎的发育规律，人工授精(ai)后14-19天为母体妊娠识别时期，19-20天胚胎植入开始，一旦植入开始，胎儿绒毛膜伸向未孕子宫角，继而肉阜-胎盘母面绒毛小叶出现。虽然附植过程中，滋养层只在子宫阜处与子宫粘膜接触，但是胚泡滋养层细胞会侵入子宫粘膜上皮，使得胎儿与母体的联系更为紧密。因此，在胚胎植入之前，胎儿与母体尚未发生实质性接触，此时获取胚胎分离得到的滋养层细胞纯度高、活力强，且易培养。

根据本发明的第一方面，本发明提供一种牛早期胚胎滋养层组织的获得方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)妊娠牛子宫摘取、冲胚以及早期胚胎的获得

摘取妊娠18-44天的妊娠牛的子宫及其连带组织结构，对卵巢黄体发育良好一侧的子宫的子宫角进行冲胚，获得早期胚胎；

(2)早期胚胎组织的形态观察以及滋养层组织的分离

在显微镜下观察胚胎的组织结构，形态完整的孕体组织用4％的多聚甲醛固定后，进行he染色，确定滋养层组织并剥离滋养层组织。

优选地，可摘取18-19天的妊娠牛的子宫及其连带组织结构获取滋养层组织，以进一步缩减本发明方法的周期和成本。

根据本发明，优选采用屠宰的方式摘取子宫，目前情况下，该方法是最简捷、经济、高效的。

本发明旨在获得母牛妊娠18-44天优选18-19天的胚胎滋养层组织，对于母牛妊娠，可利用自然发情的牛，也可采用诱导发情与超数排卵技术以保证精准和高效，优选地，该步骤包括：

(1)牛的发情诱导与超数排卵(以下简称超排)处理

对发情周期正常的牛在发情后的第8-12天开始进行超数排卵处理，然后进行至少一次人工授精；

(2)牛的妊娠诊断

在人工授精后，判断牛是否为妊娠牛。

具体地，牛的发情诱导与超数排卵处理包括：连续4天肌肉注射促卵泡素，每天早晚各一次，具体为：第一天早晚各注射促卵泡素(fsh)68-72单位，第二天和第三天早晚各注射58-62单位，第四天早晚各注射48-52单位；其中，第三天晚上注射fsh的同时注射氯前列醇(pg)0.4-0.6mg，第五天晚上注射促性腺激素释放激素(gnrh)180-220μg，2-3小时之后人工授精一次；第六天早上再次进行人工授精一次。

根据本发明，所述判断牛是否为妊娠牛的方法可采用本领域的常规方法。例如可以为：在0-18天内，分多次采集牛外周血，检测孕酮含量，并根据孕酮含量变化判断牛是否为妊娠牛。

为提高判断的精准度，优选地，所述判断牛是否为妊娠牛的方法包括：

i.在人工授精后0天、15天、16天、17天和18天经尾静脉采集牛外周血，分离血清，检测血清中的孕酮含量；

ii.提取0天和18天牛外周血总rna，并反转录成cdna，利用荧光定量pcr试剂盒检测牛人工授精后18天时的妊娠状态；所述荧光定量pcr试剂盒包含牛isg15基因、内参基因β-actin特异性引物对和牛rsad2基因特异性引物对，其中，所述牛isg15基因的引物对是：seqidno：1和seqidno：2，β-actin的引物对是：seqidno：3和seqidno：4，牛rsad2基因特异性引物对是：seqidno：5和seqidno：6；

结合血清中孕酮含量变化和荧光定量pcr试剂盒检测结果对牛是否妊娠进行综合判断。

其中，综合判断的依据为：人工授精后0天血清中孕酮含量低于1ng/ml，15-18天孕酮含量持续增加且维持较高水平；同时，试剂盒检测结果为阳性。

本发明所采集的样本可以是血清也可以是血浆，同时检测不受具体实验方法的限制，即：可以使用除化学发光法以外的其他技术，只要能精确获得孕酮(p4)含量即可。

本发明中所述荧光定量pcr试剂盒为zl201410657206.1所公开的试剂盒，该专利在此全部引入本发明作为参考。

该试剂盒涉及基于荧光定量pcr技术的奶牛早期妊娠检测方法，包括如下步骤：

(1)血液标本的收集

采集奶牛发情后人工授精前0d和人工授精后18d的外周血1.5-2ml，抗凝，低温冷藏；

(2)标本rna的提取

标本采集后2h内用血液总rna提取试剂盒完成标本中总rna提取，之后利用nanodrop2000超微量分光光度计分析rna样本浓度与纯度，od260/280＝1.9-2.1，同时采用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测rna完整性，通过质检的样本分装后，于-80℃保存备用；

(3)逆转录反应

逆转录采用试剂盒进行，每个反应rna用量为500ng，根据rna的浓度计算得出每次反应所需的体积，按照试剂盒说明书进行；

(4)荧光定量pcr检测isg15和rsad2基因在奶牛外周血中的相对表达量

1)目的基因和内参基因引物的设计与合成

牛isg15基因的引物对为如seqidno：1和seqidno：2所示的序列；内参基因β-actin的引物对为如seqidno：3和seqidno：4所示的序列；牛rsad2基因引物对为如seqidno：5和seqidno：6所示的序列；

2)荧光定量pcr反应体系

牛isg15、rsad2基因和内参基因β-actin荧光定量pcr扩增体系均为：green10μl，上下游引物各0.5μl(10μmol/l)，cdna模板0.3μl，ddh2o8.7μl，体系共20μl；

3)荧光定量pcr反应条件

isg15基因反应条件：95℃预变性60s，95℃变性15s，62℃退火15s；72℃延伸30s，共40个循环；

rsad2基因反应条件：95℃预变性60s，95℃变性15s，58℃退火15s；72℃延伸30s，共40个循环；

β-actin基因反应条件：95℃预变性60s，95℃变性15s，60-62℃退火15s；72℃延伸30s，共40个循环；

(5)统计分析

1)isg15和rsad2基因表达量的分析

采用相对定量的方法检测目的基因的表达量：计算出检测标本中目的基因与内参基因的阈值差(△ct)，以表示样品中目的基因mrna相对表达量，将奶牛人工授精后0d各基因的相对表达量较正为1，人工授精后18d的表达量为0d时表达量的倍数；

2)利用牛isg15和rsad2基因的表达量进行奶牛早期妊娠诊断

人工授精后18d奶牛外周血中isg15的表达量为x1，rsad2的表达量为x2，将x1和x2带入公式p＝1/[1+e^{-(-6.53+2.830x1+0.866x2)}]中，如果p值大于0.680时，即为妊娠，即本发明所述的阳性。

根据本发明，关于荧光定量pcr法检测母牛人工授精后外周血中干扰素刺激基因的表达，检测方法不受具体试剂以及被检测基因探针标记不同染料类型的限制。

根据本发明，完整获取妊娠牛的子宫，所述妊娠牛的子宫包括子宫颈、子宫体与子宫角，所述连带组织结构包括生殖道。

根据本发明，所述冲胚的步骤优选包括：冲胚前，将无菌pbs溶液置于37℃水浴锅提前预热，并通过人工剪切将18号2路式冲胚管的孔径扩大一半以上；冲胚时，首先用子宫颈扩张棒进行适度疏通，然后插入冲胚导管，灌入预热的pbs多次冲洗，回收的冲胚液在集液杯中静置，把沉淀部分转入无菌玻璃培养皿内。

本发明的方法适用于奶牛、肉牛或水牛，优选为奶牛。

本发明中，所述组织形态观察为石蜡组织切片的组织形态观察方法，为实验室常规技术。

根据本发明一种优选实施方式，技术方案如下，流程如图1所示：

①奶牛的发情诱导与超数排卵处理

观察奶牛的发情周期，对发情周期正常的奶牛在发情后的第9天开始进行超数排卵处理，连续4天肌肉注射促卵泡素(fsh)，每天早晚各一次，具体为：第一天早晚各注射fsh70单位，第二天和第三天早晚各注射60单位，第四天早晚各注射50单位；其中，第三天晚上注射fsh的同时注射氯前列醇(pg)0.5mg，第五天晚上注射促性腺激素释放激素(gnrh)200μg，2小时之后人工授精一次；第六天早上再次进行人工授精一次。

②奶牛的妊娠诊断

i.在人工授精后0天、15天、16天、17天和18天经尾静脉采集奶牛外周血，分离血清，用化学发光法检测血清中的孕酮(p4)含量，据其含量变化规律初步判断奶牛早期胚胎发育状态。

ii.提取0天和18天外周血液总rna，并反转录成cdna。利用奶牛早期妊娠的荧光定量pcr试剂盒及检测方法(发明人之前授权专利：zl201410657206.1)检测奶牛人工授精后18天时的妊娠状态。

结合血清中孕酮(p4)含量变化和试剂盒检测结果对奶牛是否妊娠进行综合诊断。判断依据为：人工授精后0天血清中孕酮含量低于1ng/ml，15-18天孕酮含量持续增加且维持较高水平；同时，试剂盒检测结果也为阳性时，则被检个体判为妊娠牛，否则为空怀牛。

③妊娠牛屠宰、冲胚以及早期胚胎的获得

将妊娠牛于人工授精后18-19天送至屠宰场进行屠宰，屠宰后30分钟内完整摘取母牛子宫(包括子宫颈、子宫体与子宫角)及其连带组织结构(生殖道)，及时置于冰上，1小时内带回实验室。实验室中，对卵巢黄体发育良好一侧的子宫角进行冲胚，冲胚前，将无菌pbs溶液置于37℃水浴锅提前预热，并通过人工剪切将18号2路式冲胚管的孔径扩大一半以上。冲胚时首先用子宫颈扩张棒进行适度疏通，然后插入冲胚导管，每次灌入50-70ml的pbs冲洗，连续冲洗6-7次，回收的冲胚液在集液杯中静置10-15分钟，把沉淀部分转入直径为9cm的无菌玻璃培养皿内。

④早期胚胎组织的形态观察以及滋养层组织的分离

将玻璃培养皿置于立体显微镜下观察胚胎的组织结构，形态完整的孕体组织用4％的多聚甲醛固定后，进行he染色。使用无菌的移液器吸头剥离滋养层组织，pbs溶液清洗3次后用于奶牛滋养层细胞的原代培养。

针对已有技术中利用怀孕45天以上母牛采集滋养层组织所存在的诸多缺陷，本发明首先联合应用多种生殖激素对奶牛实施诱导发情以及超数排卵处理，通过妊娠诊断对妊娠母牛屠宰并摘取子宫后进行胚胎冲洗，结合细胞形态鉴定获得牛胚胎滋养层组织，为滋养层细胞的高效原代培养提供素材。因此，本发明方法旨在更加精准、有效和经济地获得来自奶牛人工授精后发育时间为18-19天胚胎的滋养层组织，围绕这一根本目的：①联合应用生殖激素fsh、pg以及gnrh，建立最佳使用剂量及优化组合策略，对母牛实施精准的诱导发情与超数排卵；创新性整合分子检测技术，配套建立精准的超早期奶牛妊娠诊断方法；此时胚胎活力高，滋养层细胞处于分化初期，后期更易培养。②着眼于母体妊娠识别时期(配种后18-19天)胚胎滋养层组织。此时胚胎尚未与母体发生紧密接触，滋养层组织的纯度高，用于培养滋养层细胞时混有的杂质细胞少；结合对冲胚管孔径大小的调节和组织形态鉴定，可以大大简化后期细胞培养的实验步骤，有效获得高质量的滋养层组织；③提高牛滋养层组织分离的经济性。本发明超速排卵获得的胚胎数量多、母体妊娠判断精准，可提高试验效率、节约试验成本。

具体地，本发明所具有的优点以及积极效果包括：

①精准性强。

本发明的关键技术之一是奶牛的诱导发情与超数排卵，这一步是获得较多胚胎和滋养层组织的关键。本发明通过联合应用fsh、pg以及gnrh并结合最佳使用剂量的优化组合所取得的诱导发情表现更加符合奶牛本身卵泡发育的实际生殖生理状态，保证了外部发情表现与实际卵泡发育的精准一致。

关键技术之二是人工授精后奶牛的早期妊娠诊断，只有超早期妊娠诊断鉴别得到的妊娠牛才能获得发育早期的胚胎。与他人利用传统的超声波诊断或人工直肠检查不同，这两种方法一方面更多地依靠检查人员的临床工作经验，误诊率高，另一方面由于其本身技术局限性，根本做不到超早期妊娠诊断。本方法做到了进一步优化改进：综合外周血中孕酮(p4)水平检测和荧光定量pcr法检测母牛人工授精后外周血中干扰素刺激基因的表达可以保证在配种后18天对奶牛妊娠做出更加精准的妊娠诊断，实现了人工授精后一个发情周期内(配种后21天内)100％的妊娠诊断阳性率，而其他妊娠诊断技术均很难做到这一点。

②更加有效。

本发明比较了两种诱导发情与超数排卵方案并确定了最优方法：第一种是联合应用pmsg、pg以及gnrh，第二种是联合应用fsh、pg以及gnrh。虽然两种方案均有明显的发情表现，但是方案一中pmsg的剂量难以把握，pmsg的使用剂量过大时，试验牛可能提前发情，虽然有爬跨和流粘液等典型发情表现，但受胎率差。本发明最终建立的方法在诱导发情与超数排卵方面效果更加显著。

本发明采用的是成功妊娠18-19天的母牛，此时因为正处于母体对胎儿的妊娠识别时期，二者之间并未建立非常紧密的物理联系，与45天及以上的妊娠牛相比，这个时期胚胎滋养层组织相对独立、易分离；更重要的是，此时滋养层组织活力高、没有过多其他组织类型杂质细胞的干扰，再结合he染色及早期胚胎的胚节和滋养层组织形态镜检可以保证目标组织的有效获得，用于原代培养时更能保证活细胞得率和纯度。

另外，本发明的关键技术之三即胚胎和滋养层组织的获得方面，本发明试验比较了直接冲胚和剪开子宫组织捡胚两种方法，确立了不同实验目的情况下的各自最佳策略。虽然剪开子宫后捡胚，胚胎组织不会因为冲胚而导致破碎(保证了胚胎主体组织的完整性)，但是由于胚胎外滋养层组织粘附在子宫壁上，因为非常之薄，肉眼难以区分导致获得的产量降低。但通过本方法的技术对比试验表明，直接冲胚时，可以通过人工剪切确保冲胚管孔径大小合适，并在操作期间保证冲胚液的导入以及导出过程轻柔缓慢，这样就也可减少对胚胎的损伤，保障胚胎的完整性，同时也保证了滋养层组织的产量。

③更加经济(节约成本)。

由于试验牛成本高、试验周期长，因此提高工作效率、节约操作时间、减少不必要动物损失是保证实验成本降低的根本途径。本发明做到了试验流程更加紧凑、耗时更少，另外也会大大降低试验的经济损失风险。利用这种综合妊娠诊断方案可以在人工授精后一个发情周期内(配种后21天内)及时排查出配种后的空怀母牛(未成功妊娠母牛)，从而不仅可以在第一时间按照本发明所述方法进行复配，还可以避免因诊断不准确造成试验牛只的屠宰浪费，根据目前奶牛业行情，错误地屠杀一头空怀母牛会使试验经济成本增加至少1.2万元人民币，这其中还不包括人力及试验耗材成本。此外，与已有技术中利用妊娠45天甚至8-10周龄妊娠母牛相比，本发明在妊娠的18-19天便可以更好地实现试验目的，因此试验周期缩短27-52天；试验牛一般为生殖能力正常的低产牛，产奶量按照5.5公斤/天左右，奶价按照4.2元/公斤，则每天产奶的收入为23.1元；而目前一头成母牛每天的实际饲养成本(合计43.3元/天)计算：饲料平均30元/天，人工费约8元/天，设备折旧5元/天，兽药费用0.3元/天。因此，对于一头试验母牛本发明便可以节约饲养管理成本20.2元/天，整个试验周期可节约饲养管理成本545.4-1050.4元/头。

本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。

图1为本发明一种优选实施方式的方法流程图。

图2示出了试验牛早期妊娠的荧光定量检测结果；a:1208-1扩增曲线图；b:1127扩增曲线图；c:1208-2扩增曲线图；d:1089扩增曲线图。

图3为妊娠19天的奶牛胚胎组织的he染色图。

具体实施方式

下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。

(1)试验动物：

3头试验牛来自武汉市某标准化奶牛示范养殖基地，体况健康、产奶性能低、生殖能力正常。

(2)主要试剂及仪器：

促卵泡素(fsh)、氯前列醇(pg)、注射用促性腺激素释放激素(gnrh)以及孕马血清促性腺激素(pmsg)购自于宁波市三生药业有限公司。冲胚导管购自于北京市潭河科技开发中心，rna提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，反转录试剂盒购自thermofisherscientific公司，实时定量pcr扩增的预混和溶液购自东洋纺(上海)生物科技有限公司，其它pcr相关试剂均购自takara公司。主要仪器平台为：maglumi800化学发光仪(snibe)、bioradcfxconnecttm实时荧光定量pcr仪。

(3)试验方法：

①发情诱导与超数排卵处理

方案1：第一天下午肌肉注射孕马血清促性腺激素(pmsg)2000iu，第三天下午注射氯前列醇(pg)0.5mg，第五天下午注射促性腺激素释放激素(gnrh)200μg，2h后人工授精一次，次日上午再次进行人工授精。

方案2：在试验奶牛发情周期的第九天开始进行超排处理，连续四天肌肉注射促卵泡素(fsh)，每天早晚各一次。第一天早晚各注射fsh70单位，第二天和第三天早晚各注射60单位，第四天早晚各注射50单位。其中，第三天晚上另外注射氯前列醇(pg)0.5mg，第五天晚上注射促性腺激素释放激素(gnrh)200μg。第五天晚上和第六天早上各进行人工授精一次。

②妊娠诊断

分别于配种后0天、7天、15天、16天、17天和18天经尾静脉采集奶牛外周血并分离血清，用化学发光法检测血清中的孕酮含量。同时提取0天和18天外周血液总rna并反转录成cdna，具体方法参照所购商业试剂盒说明书中操作步骤。利用前期自主研发的奶牛早期妊娠的荧光定量pcr试剂盒及检测方法(发明人之前授权专利：zl201410657206.1)检测奶牛的妊娠状态：检测人工授精后0天和18天奶牛外周血中isg15和rsad2基因的表达量，将奶牛人工授精后0天各基因的相对表达量校正为1，基因相对表达量为：人工授精后18天的表达量相对于0天时表达量，用倍数表示。若人工授精后18天奶牛外周血中isg15的表达量为x1，rsad2的表达量为x2，将x1和x2分别带入公式p＝1/[1+e^{-(-6.53+2.830x1+0.866x2)}]中，p值大于0.680时判为阳性结果(即妊娠)。综合试验牛血清中的孕酮含量变化对奶牛是否妊娠进行判定。

③滋养层组织的采集与鉴定

将妊娠牛于人工授精后19天运送至武汉市武丰屠宰场进行屠宰，屠宰后30分钟内完整摘取母牛子宫(包括子宫颈、子宫体与子宫角)及其连带组织结构(生殖道)子宫并及时置于冰上，将所采集样本1小时内带回实验室。实验室中，在卵巢黄体发育良好的子宫角一侧插入冲胚导管，每次用70mlpbs溶液(pbs体积根据子宫的大小具体调整，37℃提前预热)冲洗，连续冲洗6-7次，收集的孕体在立体显微镜下观察并分离滋养层组织。将孕体组织用用4％的多聚甲醛固定后进行he染色，用于进一步组织形态的鉴定。

(4)试验结果

①试验牛发情效果

试验牛1208(牛只编号，下同)以及1127按照前述方案1进行诱导发情以及超排处理。1208在第三天早上出现爬跨征状，依据直肠检查及卵泡发育情况于第四天早上配种。根据试验牛1208的发情表现进一步对试验牛1127诱导发情的激素剂量进行了调整，pmsg使用剂量减半，在所有发情药物注射完之后，即试验的第六天1127号奶牛开始出现爬跨征状，晚上配种。

由于试验牛1208配种后第19天返情(妊娠失败)，待其进入下一个情期之后(距离上次配种19天)对1208与另外一头1089号新增试验母牛按照前述方案2进行诱导发情及超排处理。两头牛在试验第五天上午均观察到明显的发情征状(爬跨和流粘液)，在注射完gnrh后2小时配种并于次日再次配种。

②试验牛血清中孕酮含量

表1试验牛配种后血清中孕酮含量(ng/ml)

由表1可见，试验牛1208-1第一次诱导发情和人工授精后17天和18天孕酮含量急剧下降，降至1ng/ml以下(是发生返情的预兆)。1127号试验牛人工授精后15天血清中孕酮含量最高，15-18天孕酮含量持续下降，但与配种后发生返情的1208-1不同，仍维持在较高的水平。采用方案2，试验牛1208-2第二次诱导发情和人工授精后15-18天血清中的孕酮含量呈上升趋势，且远远高于1127号奶牛的孕酮水平。试验牛1089血清中孕酮的表达规律与1208-2的情况类似。

③奶牛早期妊娠的荧光定量检测结果

如图2所示，利用奶牛早期妊娠的荧光定量pcr检测结果表明，1208-1为阴性(p＝0.005)，1127为阳性(p＝1.00)，1208-2(p＝1.00)为阳性，1089(p＝0.99)为阳性。由于本次试验为诱导发情牛，可能会影响利用荧光定量pcr技术通过检测干扰素刺激基因表达进行妊娠诊断的准确性，因此，方案进一步结合孕酮检测结果，综合判定1208-2以及1089号奶牛为妊娠牛，1127被判为疑似妊娠牛。

④滋养层组织的采集

i.试验牛的妊娠诊断与屠宰

利用基因检测与孕酮含量进行综合妊娠诊断。确定妊娠后，在屠宰场中利用220v电压短暂电击5秒，致昏倒地后放血，剖开腹腔采集目标样本即完整子宫及其附属组织。

ii.奶牛早期胚胎组织的收集与观察

iii.试验牛1208早期胚胎组织的获得

1208号奶牛采取导入冲胚管，用pbs溶液冲洗子宫的方式获得奶牛早期胚胎的滋养层组织，该方法获得胚胎组织较多，滋养层组织与胚节部分易分离，并且，能够保证滋养层组织的质量。而1089号奶牛则采取的是直接剖开一侧的子宫，通过肉眼观察，用眼科镊挑出胚胎组织，该方法获得的胚胎组织形态结构较完整，但是滋养层组织相对较少。

⑤奶牛胚胎组织形态结构

图3为妊娠19天的奶牛胚胎组织的he染色图。

以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

序列表

<110>武汉轻工大学

<120>一种牛早期胚胎滋养层组织的获得方法

<130>1700581

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

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