一种仔猪源解淀粉芽孢杆菌及其应用的制作方法

本发明涉及一种仔猪肠道来源的解淀粉芽孢杆菌，可抑制多种肠道致病菌及植物致病真菌。

背景技术：

抗生素可降低动物患病机率，提高动物生长性能，提高养殖业的经济效益，但随着抗生素的广泛和过量使用，出现了如病原菌耐药、动物胃肠道微生态系统紊乱、畜产品抗生素残留、动物排泄物污染环境等问题。因此，为了使畜牧业中动物生产效益不受较大影响，同时减少抗生素的使用，就需要寻找能够代替或减少抗生素使用的有效物质。越来越多的益生菌被报道可以在胃肠道调节动物体微生态平衡，实现预防疾病、提高动物生产性能的功效。同时，随着人们对动物产品的质量要求越来越高，使用安全、环保、高效的益生菌微生态制剂替代抗生素已成为一种趋势。益生菌中的芽孢杆菌因其具有较高的抗逆性，同时无毒无害、效果显著、成本低等优势而受到研究者和畜牧业生产者的关注。

解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)是一种革兰氏阳性菌，在自然界分布广泛。他们能产生孢子，具有较强的抗逆性，同时生长快，对人畜无毒害，不污染环境。了解解淀粉芽孢杆菌产生的生物活性物质，并且合理应用于动植物生产，对减少抗生素和农药的使用，提高农牧产品的品质及保护环境具有非常重要的意义。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一株解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefacienshcob1。

本发明提供的解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefacienshcob1的保藏编号为cgmccno.14599。

本发明的解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefacienshcob1分类命名为解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciens，该菌株已于2017年9月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为cgmccno.14599。

本发明的另一个目的是提供上述解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciens或其制剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液的新用途。

本发明提供了上述解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciens或其制剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液在抗菌和/或抑菌中的应用。

本发明还提供了上述解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciens或其制剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液在制备抗菌和/或抑菌的产品中的应用。

上述应用中，所述菌为细菌和/或真菌；所述细菌具体可为藤黄微球菌micrococcusluteus(藤黄微球菌micrococcusluteusncib8166)、产肠毒性大肠杆菌enterotoxigenicescherichiacoli(产肠毒性大肠杆菌enterotoxigenicescherichiacolik88)、鼠伤寒沙门氏菌salmonellaentericaserovartyphimurium(鼠伤寒沙门氏菌salmonellaentericaserovartyphimuriumg5787)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌methicillin-resistantstaphylococcusaureu(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌methicillin-resistantstaphylococcusaureus1-1)、柠檬酸杆菌citrobacterrodentium(柠檬酸杆菌citrobacterrodentiumdbs100)或奇异变形杆菌proteusmirabilis(atcc编号为29906)；

所述真菌具体可为禾谷镰刀菌fusariumgraminearum(禾谷镰刀菌fusariumgraminearumnrrl31084)或尖孢镰刀菌fusariumoxysporum(尖孢镰刀菌fusariumoxysporumsrrc1370)。

本发明还提供了上述解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciens或其制剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液在调节动物体微生态平衡中的应用。

本发明还提供了上述解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciens或其制剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液在制备调节动物体微生态平衡的产品中的应用。

本发明还提供了上述解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciens或其制剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液在预防动物疾病或降低动物患病机率中的应用。

本发明还提供了上述解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciens或其制剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液在制备预防动物疾病或降低动物患病机率的产品中的应用。

本发明还提供了上述解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciens或其制剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液在提高动物体生长性能中的应用。

本发明还提供了上述解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciens或其制剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液在制备提高动物体生长性能的产品中的应用。

上述应用中，所述解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciens为上述解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefacienshcob1。

本发明的最后一个目的是提供一种产品。

本发明提供的产品的活性成分为解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciens或其制剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液；

所述产品具有如下1)-5)中任一种的功能：

1)抗菌和/或抑菌；

2)调节动物体微生态平衡；

3)预防动物疾病；

4)降低动物患病机率；

5)提高动物体生长性能。

上述产品中，所述菌为细菌和/或真菌；所述细菌具体可为藤黄微球菌micrococcusluteus、产肠毒性大肠杆菌enterotoxigenicescherichiacoli、鼠伤寒沙门氏菌salmonellaentericaserovartyphimurium、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌methicillin-resistantstaphylococcusaureu、柠檬酸杆菌citrobacterrodentium或奇异变形杆菌proteusmirabilis；所述真菌具体可为禾谷镰刀菌fusariumgraminearum或尖孢镰刀菌fusariumoxysporum。

所述解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciens为上述解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefacienshcob1。

本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefacienshcob1，其保藏编号为cgmccno.14599。通过实验证明的解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefacienshcob1cgmccno.14599具有抑菌作用，对细菌和真菌均具有较好的抑制活性，可用于调节动物体微生态平衡、预防动物疾病、降低动物患病机率、提高动物体生长性能。不仅对减少抗生素的使用，提高农牧产品的品质及保护环境具有非常重要的意义，而且有助于促进农业可持续发展，具有较好的应用前景。

附图说明

图1为hcob1发酵液上清中的代谢产物(伊枯菌素)分析结果。

图2为hcob1发酵液上清中的代谢产物(表面活性素)分析结果。

图3为hcob1发酵液上清中的代谢产物(芬芥素)分析结果。

图4为hcob1发酵液上清对藤黄微球菌8166的抑菌实验结果。

图5为hcob1发酵液上清对大肠杆菌etec的抑菌实验结果。

图6为hcob1发酵液上清对鼠伤寒沙门氏菌的抑菌实验结果。

图7为hcob1发酵液上清对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantstaphylococcusaureus，mrsa)的抑菌实验结果。

图8为hcob1发酵液上清对柠檬酸杆菌citrobacterrodentiumcb10的抑菌实验结果。

图9为hcob1发酵液上清对奇异变形杆菌proteusmirabilisdrl2的抑菌实验结果。

图10为hcob1发酵液上清对真菌的抑菌实验结果。左图为对禾谷镰刀菌fusariumgraminearum的抑菌实验结果；右图为对尖孢镰刀菌fusariumoxysporum的抑菌实验结果。

保藏说明

菌种名称：解淀粉芽孢杆菌

拉丁名：bacillusamyloliquefaciens

菌株编号：hcob1

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：cgmcc

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2017年9月8日

保藏中心登记入册编号：cgmccno.14599

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的藤黄微球菌ncib8166(micrococcusflavusncib8166)在文献“xiaoh,chenx,chenm,tangs,zhaox,andhuanl.2004.bovicinhj50,anovellantibioticproducedbystreptococcusbovishj50.microbiology150:103-108.”中公开过，公众可从中国科学院微生物研究所获得。

下述实施例中的eteck88在文献“zhangl,zhangl,zhanx,zengx,zhoul,caog,chena,yangc.effectsofdietarysupplementationofprobiotic,clostridiumbutyricum,ongrowthperformance,immuneresponse,intestinalbarrierfunction,anddigestiveenzymeactivityinbroilerchickenschallengedwithescherichiacolik88.janimscibiotechnol.2016jan26；7:3.doi:10.1186/s40104-016-0061-4”中公开过，公众可从中国科学院微生物研究所获得。

下述实施例中的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌staphylococcusaureus1-1在文献“wangj,zhangl,tengk,suns,sunz,zhongj.cerecidins,novellantibioticsfrombacilluscereuswithpotentantimicrobialactivity.appl.environ.microbiol.2014,80(8):2633”中公开过，公众可从中国科学院微生物研究所获得。

实施例1、hcob1菌株的分离与鉴定

一、hcob1菌株的分离

hcob1分离自1个半月龄的健康仔猪结肠。具体分离方法如下：取解剖后的一个半月龄的健康仔猪结肠部位内容物，将其用生理盐水按照10^-1到10^-6进行梯度稀释，涂布于lb培养平板(1l培养基配方为胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，1.5％琼脂粉，双蒸水定容到ll，高压灭菌)。培养平板于37℃培养箱中培养1天后，挑取边缘不规则的单克隆在液体lb培养基(1l培养基配方为胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，双蒸水定容到ll，高压灭菌)中培养。过夜培养后检测单克隆的培养产物对藤黄微球菌8166的抑菌活性，发现有一株菌的发酵液上清有很明显的抑菌活性，将其命名为hcob1。

二、hcob1菌株的鉴定

将hcob1菌体培养后收集，提取基因组dna，利用引物(27f：5’-agagtttgatcctggctcag-3'和1492r：5'-ggttaccttgttacgactt-3)对16srrna序列进行扩增，得到pcr产物。并对pcr产物进行测序。

测序结果表明：pcr产物的序列如序列1所示，将此序列经过在ncbi网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)比对分析，鉴定为解淀粉芽孢杆菌。

经过上述鉴定结果，确定hcob1菌株名称为解淀粉芽孢杆菌，其分类命名为解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciens，该菌株已于2017年9月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为cgmccno.14599。

实施例2、hcob1菌株的发酵及其发酵上清中代谢产物分析

一、hcob1菌株的发酵

将实施例1中分离得到的hcob1菌株接种于lb培养基中在37度摇床(200转/分)中发酵培养24小时，得到hcob1发酵液，hcob1发酵液在12000rpm条件下离心2min，收集上清液，得到hcob1发酵液上清。将hcob1发酵液上清命名为微生物制剂hcob1。

二、hcob1发酵液上清中的代谢产物分析

将hcob1发酵液上清用ziptip处理后，利用质谱对其中代谢产物的分子量进行鉴定并分析。

结果表明：hcob1发酵液上清中包含如下三种具有抑菌活性的脂肽类活性产物：伊枯菌素(分子量为1403.5da，对应含14个碳链长度的伊枯菌素；分子量为1057.5da，对应含15个碳链长度的伊枯菌素；图1)、表面活性素(分子量为1008.6da，对应含13个碳链长度的表面活性素；分子量为1022.6，对应含14个碳链长度的表面活性素；分子量为1058.6da，对应含15个碳链长度(钠峰)的表面活性素；图2)和芬芥素(分子量为1435.7da，对应含14个碳链长度的芬芥素；分子量为1449.7，对应含15个碳链长度的芬芥素；分子量为1463.7da，对应含16个碳链长度的芬芥素；分子量为1477.7，对应含17个碳链长度的芬芥素；分子量为1491.7da，对应含18个碳链长度的芬芥素；分子量为1505.7，对应含18个碳链长度的芬芥素同系物，其第六位丙氨酸被替换为缬氨酸；分子量为1513.7da，对应含16个碳链长度的芬芥素同系物(钠峰)，其第六位丙氨酸被替换为缬氨酸；图3)。

实施例3、微生物制剂hcob1在抑菌中的应用

(一)微生物制剂hcob1在抑制细菌生长中的应用

一、微生物制剂hcob1对藤黄微球菌的抑制作用

以藤黄微球菌micrococcusluteusncib8166为指示菌，利用“挖井扩散法”检测hcob1发酵液上清对藤黄微球菌ncib8166的抑菌活性。具体步骤如下：用含s1培养基(溶剂为水，溶质及其质量分数如下：0.8％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％葡萄糖、0.2％碳酸氢二钠、0.5％氯化钠、0.1％吐温20)的平板培养藤黄色微球菌ncib8166，并在冰箱中放置20天左右，挑取一环藤黄色微球ncib8166于生理盐水中，悬浮混匀，取0.5ml悬浮液加入融化的20mls1固体培养基中混匀，倒入直径90mm的培养皿中，平放，得到藤黄色微球菌ncib8166的指示菌平板。平板凝固后用打孔器在各指示菌平板上打出直径5mm的小孔，将25ul分别培养了8小时和24小时的hcob1发酵液上清加入到小孔中，以相同体积的lb培养基作为正对照，将平板放入30度培养箱过夜培养。

结果表明：hcob1发酵液上清对藤黄微球菌8166有很明显的抑菌活性，且随着发酵时间延长，抑菌活性升高(图4)。

二、微生物制剂hcob1对产肠毒性大肠杆菌的抑制作用

产肠毒性大肠杆菌(enterotoxigenicescherichiacoli，etec)是一类引起人和幼畜，尤其是初生仔猪、犊牛、羔羊及断奶仔猪腹泻的重要病原菌，初生幼畜被etec感染后，常因剧烈水样腹泻和迅速脱水而死亡，发病率和死亡率均很高。据估计，每年全世界死亡的仔猪50％是由etec引起的。为了研究微生物制剂hcob1是否对大肠杆菌etec有抑制作用，进行了如下实验：

将hcob1发酵液上清分别按照体积分数为10％和20％的比例加入含有产肠毒性大肠杆菌eteck88的lb培养基中，得到eteck88培养体系；接种eteck88后在自动微生物生长分析仪bioscreenc中进行培养。在培养过程中的不同时间点检测eteck88培养体系的od600值，并以od600值为纵坐标，生长时间为横坐标绘制生长曲线，检测其生长情况。同时以不加入hcob1发酵液上清作为对照。

结果表明：hcob1发酵液上清对产肠毒性大肠杆菌etec的生长具有很明显的抑制作用，且发酵液浓度越高，其抑制效果越明显(图5)。

三、微生物制剂hcob1对鼠伤寒沙门氏菌的抑制作用

鼠伤寒沙门氏菌和etec是影响养猪业的两大主要病原菌。鼠伤寒沙门氏菌能引起各种家禽和哺乳动物的传染病，也可引起人类尤其是婴幼儿感染，是引起急性胃肠炎的主要病原菌之一。为了研究微生物制剂hcob1是否对鼠伤寒沙门氏菌有抑制作用，进行了如下实验：

将hcob1发酵液上清分别按照体积分数为10％和20％的比例加入含有鼠伤寒沙门氏菌salmonellaentericaserovartyphimuriumg5787(atcc编号为14028)的lb培养基中，得到鼠伤寒沙门氏菌培养体系；接种后在自动微生物生长分析仪bioscreenc中进行培养。在培养过程中的不同时间点检测鼠伤寒沙门氏菌培养体系的od600值，并以od600值为纵坐标，生长时间为横坐标绘制生长曲线，检测其生长情况。同时以不加入hcob1发酵液上清作为对照。

结果表明：hcob1发酵液上清对鼠伤寒沙门氏菌生长具有很明显的抑制作用(图6)。

四、微生物制剂hcob1对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)的抑制作用

将hcob1发酵液上清分别按照体积分数为10％和20％的比例加入含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌methicillin-resistantstaphylococcusaureus1-1的lb培养基中，得到耐甲氧西林金黄色葡萄球菌培养体系，接种后在自动微生物生长分析仪bioscreenc中进行培养。在培养过程中的不同时间点检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌培养体系的od600值，并以od600值为纵坐标，生长时间为横坐标绘制生长曲线，检测其生长情况。同时以不加入hcob1发酵液上清作为对照。

结果表明：hcob1发酵液上清对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生长具有很明显的抑制作用(图7)。

五、微生物制剂hcob1对柠檬酸杆菌的抑制作用

将hcob1发酵液上清分别按照体积分数为10％和20％的比例加入含有柠檬酸杆菌citrobacterrodentiumdbs100(atcc编号为51459)的lb培养基中，得到柠檬酸杆菌培养体系，接种后在自动微生物生长分析仪bioscreenc中进行培养。在培养过程中的不同时间点检测柠檬酸杆菌培养体系的od600值，并以od600值为纵坐标，生长时间为横坐标绘制生长曲线，检测其生长情况。同时以不加入hcob1发酵液上清作为对照。

结果表明：hcob1发酵液上清对柠檬酸杆菌生长具有很明显的抑制作用(图8)。

六、微生物制剂hcob1对奇异变形杆菌的抑制作用

将hcob1发酵液上清分别按照体积分数为10％和20％的比例加入含有奇异变形杆菌proteusmirabilis(atcc编号为29906)的lb培养基中，得到奇异变形杆菌培养体系；接种后在自动微生物生长分析仪bioscreenc中进行培养。在培养过程中的不同时间点检测奇异变形杆菌培养体系的od600值，并以od600值为纵坐标，生长时间为横坐标绘制生长曲线，检测其生长情况。同时以不加入hcob1发酵液上清作为对照。

结果表明：hcob1发酵液上清对奇异变形杆菌生长具有很明显的抑制作用(图9)。

(二)微生物制剂hcob1在抑制真菌生长中的应用

一、微生物制剂hcob1对禾谷镰刀菌的抑制作用

采用挖井扩散法测定hcob1发酵液上清对禾谷镰刀菌的抑菌活性。具体步骤如下：用含pda培养基(1lpda培养基配方如下：马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂15～20克，双蒸水定容到1l)的平板培养禾谷镰刀菌fusariumgraminearumnrrl31084，在平板中央接种菌后生长2-4天，然后用打孔器在菌落圈周围平板上打出直径5mm的小孔，将25ul培养了24小时的hcob1发酵液上清加入到小孔中，同时以枯草芽孢杆菌b.subtilis168及可产乳链菌肽nisin的乳酸乳球菌l.lactish1作为对照，将平板放入30度培养箱培养1-2天。

结果表明：hcob1发酵液上清对禾谷镰刀菌生长具有很明显的抑制作用(图10)。

二、微生物制剂hcob1对尖孢镰刀菌的抑制作用

采用挖井扩散法测定hcob1发酵液上清对尖孢镰刀菌的抑菌活性。具体步骤如下：用含pda培养基的平板培养尖孢镰刀菌fusariumoxysporumsrrc1370，在平板中央接种菌后生长2-4天，然后用打孔器在菌落圈周围平板上打出直径5mm的小孔，将25ul培养24小时的hcob1发酵液上清加入到小孔中，同时以枯草芽孢杆菌b.subtilis168及可产乳链菌肽nisin的乳酸乳球菌l.lactish1作为对照，将平板放入30度培养箱培养1-2天。

结果表明：hcob1发酵液上清对尖孢镰刀菌生长具有很明显的抑制作用(图10)。

序列表

<110>中国科学院微生物研究所

<120>一种仔猪源解淀粉芽孢杆菌及其应用

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1408

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

caagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaac60

acgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggat120

ggttgtttgaaccgcatggttcagacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatgg180

acccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagcc240

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cagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtga360

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